저자는이 프로토콜의 개발에 도움을 젠킨스 연구소의 앙드레 한과 로렌스의 엔 기술 지원 및 회원 감사드립니다.

1. 림프 조직에서 세포 절연 <ol><li> 의 작은 사각형이 포함 된 60mm 문화 요리에, 얼음 차가운 cEHAA (EHAA + 10% FBS, 펜 / 패 혈성, gentamycin, 2 MM L-글루타민, 55 MM 2 메르 캅토 에탄올) 또는 기타 이에 상응하는 T 세포 매체 1 ML을 추가 얼음에 100 μm 나일론 메쉬 및 장소. </li><li> 마우스를 안락사시켜야. </li><li> 비장 가능한 많은 쉽게 접근 할 수 림프절을 제거합니다. 이러한 적어도 사타구니, 겨드랑이, 상완, 자궁 경부, 그리고 장간막 림프절을 포함해야합니다. 배양 접시에있는 나일론 메쉬의 상단에 올려 놓으십시오. </li><li> 부드럽게 덧는 림프구를 해방하기 위해 나일론 메쉬 동안 폐쇄 1.5 ML의 microfuge 튜브의 평면 상단을 림프 조직 사용합니다. 정지에 셀을 작업 할 cEHAA와 pipet 위아래로 다른 한 ML을 추가합니다. 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브의 맨 위에 위치 나일론 메쉬의 또 다른 작품을 통해 셀을 전송합니다. 얼음 차가운 cEHAA, PO의 또 다른 한 ML 함께 그릇과 메쉬를 씻어같은 관에 볼륨을 oling. 4 ML의 최종 세포 현탁액 볼륨을 달성하기 위해 반복합니다. </li><li> 15 ML의 최종 볼륨 (PBS + 2% FBS, 0.05 % Azide) 차가운 정렬 버퍼를 추가, 4, 300 XG에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 ° C. </li><li> 조심스럽게 액체의 어떤 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 표면에 뜨는을 대기음. 약 두 번 펠렛 자체의와 동일한 최종 볼륨으로 FC 블록 (정렬 버퍼 + 2.4G2 항체)의 세포 펠렛을 Resuspend. 예를 들어, 순진한 마우스 비장과 림프 노드는 일반적으로 약 100 μl의 세포 펠렛을 생산하고 있습니다. 이 경우, 200 μl의 볼륨을 가져 FC 블록 100 μl를 추가합니다. 셀 거리며 걷게의 큰 학위가 발생했습니다 경우, 조심스럽게 pipet 팁을이 시점에서 세포 덩어리를 제거합니다. </li></ol> 2. Tetramer의 착색 <ol><li> 10 나노 미터 (또는 경험적으로 최적화 된 농도)의 최종 농도에 PE 또는 APC-라벨 pMHC tetramer를 추가합니다. </li><li> 믹스와 incuba실내 온도 (또는 경험적으로 최적화 시간 및 온도)에서 1 시간에 테. </li><li> 15 ML의 볼륨에 감기 정렬 버퍼를 추가하고 300 XG, 4 ° C.에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 얼음 또는 ° C 지금부터 4에 샘플을 보관. </li><li> 조심스럽게 액체의 어떤 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 표면에 뜨는을 대기음. 200 μl의 최종 볼륨으로 정렬 버퍼에있는 셀 펠렛을 Resuspend. 더블 tetramer 농축를 들어, 150 μl의 최종 볼륨 resuspend. </li></ol> 3. 자기 강화 <ol><li> Miltenyi 방지 PE 또는 안티 APC microbeads의 50 μl를 추가합니다. 더블 tetramer 농축를 들어, 50 μl를 추가합니다. </li><li> 4에 섞어서 20 분에 품다 ° C. </li><li> 15 ML의 볼륨에 감기 정렬 버퍼를 추가하고 300 XG, 4 ° C.에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 </li><li> 기다리는 동안 MidiMACS 또는 QuadroMACS 자석에 Miltenyi LS 자기 열을 설정합니다. 에 문이 열려있는 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브의 위치를열 아래에 직접 올릴 수. </li><li> 가 15 ML 튜브로 배수 할 수 있도록, 컬럼의 상단에 정렬 버퍼 3 ML을 추가합니다. </li><li> 칼럼의 상단에 100 μm 나일론 메쉬 광장을 배치합니다. </li><li> 세포가 회전이 완료되면, 조심스럽게 표면에 뜨는을 기음과 정렬 버퍼 3 ML에서 펠렛을 resuspend. </li><li> 열 상단 위에 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 세포 현탁액이 완전히 열을 배출되면, 정렬 버퍼의 다른 3 ML로 원래 튜브를 씻어 열로 나일론 메쉬를 통해 버퍼를 전송 과정에서 메쉬를 린스. 나일론 메쉬를 폐기하십시오. </li><li> 버퍼가 완전히 열을 배출되면 열을 정렬 버퍼의 또 다른 3 ML를 추가합니다. </li><li> 3 × 3 ML 세차 총 10 단계를 반복합니다. </li><li> 새로운 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브를 통해 자석과 장소에서 열을 제거합니다. </li><li> t로 정렬 버퍼의 5 ML을 추가그는 열. </li><li> 즉시 열 상단에 플런저를 삽입하고 하나의 연속 동작으로, 튜브에 열을 밖으로 버퍼를 강제, 플런저 모든 방법을 아래로 밀어. </li><li> 300 XG에서 5 분의 용출 바인딩 된 분수와 흐름을 통해 언 바운드 분수, 4 ° C.를 포함하는 튜브를 원심 분리기 </li><li> 액체의 더 작은 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 바인딩 분수에서 표면에 뜨는을 자세히 대기음. 정확히 95 μl의 최종 볼륨으로 정렬 버퍼에있는 셀 펠렛을 Resuspend. 기음과 2 ML의 최종 볼륨에 언 바운드 일부를 resuspend. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 <ol><li> 각 분수를 들어, 5 μl를 제거하고 5 ML의 FACS 관 계수 구슬 200 μl (정렬 버퍼에 200,000 / ML의 농도로 조정)에 추가 할 수 있습니다. 4에 정해 ° C를 분석하기. 시간을 절약하기 위해 구슬은 실험 시작 전에 레이블 튜브에 미리 aliquoted 할 수 있습니다. </li><li> 오전 준비항체의 애 스터 믹스는 세포의 표면 마커 (표 1) 얼룩합니다. 시간을 절약하기 위해, 이것은 실험의 시작하기 전에 수행 할 수 있습니다. </li><li> 바인딩 된 분수를 들어, 관 세포 ~ 90 μl에 직접 항체 칵테일의 복용을 추가합니다. 언 바운드 분수의 분석이 필요하다면, 5 ML의 FACS 튜브에 세포의 90 μl를 전송하고 항체 칵테일의 복용을 추가합니다. </li><li> 흐름 cytometer위한 단일 색상 보정 컨트롤 패널을 설정합니다. 사용 할 각각의 fluorochrome를 들어, 해당 fluorochrome에 복합 항 CD4 항체 1 μl로 5 ML의 FACS 관에 남은 언 바운드 분획 세포의 50 μl를 섞는다. 뿐만 아니라 흠없는 제어를 설정해야합니다. </li><li> 소용돌이와 4에서 30 분의 모든 샘플을 품다 ° C. </li><li> 300 XG에서 5 분, 4 ° C. 각 튜브와 원심 분리기로 정렬 버퍼의 5 ML을 추가 </li><li> 바인딩 된 분수를 들어, 신중하게 정렬 buf 200 μl의 세포 표면에 뜨는 기음 및 resuspend남았다. 1.2 ML의 FACS의 microtube에 세포를 전송합니다. 같은 microtube에 정렬 버퍼와 수영장의 또 다른 200 μl로 관을 씻어. 셀 clumps이 명백 경우, 50 μm 필터를 통해 세포를 전달합니다. </li><li> 언 바운드 분율 및 보상 제어, 가만히 따르다 또는의 표면에 뜨는 및 resuspend 두 ML의 정렬 버퍼를 대기음하십시오. </li><li> 단일 색 보정 컨트롤을 사용하여 흐름 cytometer를 설정합니다. 기록 할 추가 매개 변수로 측 분산 폭 (SSC-W)를 선택합니다. </li><li> 도 1 및도 2에 도시 된 바와 같이 + 나 CD8 + T 세포 CD4을 식별 할 연속 포함 된 문의 순서를 사용하여 스테인드 샘플을 분석합니다. 바인딩 분수를 들어, 최대 2,000,000 총 이벤트의 최대 가능한 한 많은 세포를 수집합니다. 언 바운드 분수를 들어, 1,000,000 총 이벤트를 수집합니다. 수집 속도 초당 이벤트이나 3000 아래하세요. </li><li> 같은 시스템 설정을 사용하여 계산 비드 샘플을 분석 할 수 있습니다. 10,000 총 이벤트를 수집합니다. &lt;/ 리&gt; <li> FCS 파일로 모든 데이터를 저장합니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> FlowJo 소프트웨어를 사용하여 계산 비드 샘플에 대한 FCS 데이터 파일을 분석합니다. 플롯 앞으로 FITC의 분산 및 (그림 1과 2 참조) 계산 구슬을 aroung 게이트를 설정합니다. 각 샘플에서 발견 비즈를 계산의 총 수를 결정합니다. 수집 셀 이벤트의 수를 결정하기 위해 수집 이벤트의 총 수에서 뺍니다. </li><li> 박스 1에서 설명한 방정식을 사용하여 각 샘플에있는 모든 세포의 총 수를 계산합니다. </li><li> 스테인드 바운드 및 언 바운드 일부 샘플에 대한 FCS 데이터 파일을 분석합니다. 림프 +, 측면 산란 - 너비 이오, 덤프 -, 3 번 CD +, CD4 + 또는 CD8 +, tetramer도 1 및도 2에 도시 된 바와 같이 각 예제에서 + T 세포.을 식별 할 연속 포함 된 문의 순서를 설정 </li><li> CD4을 정의하는 데 사용 포함 된 문이 각각의 주파수 + tetramer하여 샘플에서 세포의 총 수를 모두 곱하면+ 또는 CD8 + tetramer + 세포 에피토프 특정 T 세포 (박스 1)의 총 수를 계산합니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 프로토콜에서 제공 pMHC tetramer 기반의 세포 농축 방법은 내생 T 세포 repertoires에서 에피토프 특정 T 세포를 연구하기위한 강력한 도구입니다. pMHC의 tetramers의 사용은 직접적으로 기원 pMHC 리간드를 구속하기 위해 자신의 TCRs의 능력에 따라 에피토프 특정 T 세포의 확인을 할 수 있습니다. 강화는 항원에 특정한 T 세포의 매우 희귀 한 인구는 자신의 유전 메이크업이나 전구체 주파수의 조작없이 T ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; 시약</strong</td&gt;<td<strong&gt; 공급 업체</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE 또는 APC 복합 pMHC tetramer (또는 multimer)</td&gt;<td&gt; NIH tetramer 코어에서 얻은, 조사원에 의해 제작, 또는 상업적 소스에서 구입</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - PE 복합 자성 microbeads</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - APC 복합 자성 microbeads</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LS 자기 열</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS 또는 QuadroMACS 자석</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 또는 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 셀 계산 비즈</td&gt;<td&gt; 생명 기술</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptide:mhc tetramer-based enrichment of epitope-specific t cells

생체 실험 모델과 적응 면역을 공부 연구자에 대한 기본적인 필요는 T 세포 항원 수용체 (TCR) 특이성에 따라 T 세포를 식별 할 수 있다는 것입니다. 많은 간접 방법은 T 세포의 대량 인구가 특정 항원과 에피토프 특정 T 세포 등 확산, 시토 킨 생산, 또는 활성 마커 하나의 표현과 같은 기능 응답의 측정을 통해 확인할 수 있습니다와 체외에서 자극되는 이용하실 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 여러 가지 기능 중 하나를 전시 에피토프 특정 T 세포를 식별, 그들은 순진한 전구체 주파수에서 에피토프 특정 T 세포를 감지 할 수있을만큼 문자를 구분하지 않습니다. 인기있는 대안은, TCR 유전자 변형 입양 이전 모델 인에서 TCR 유전자 변형 마우스의 단클론 T 세포는 easi 수 있습니다 에피토프 특정 T 세포의 큰 전구체 인구를 만들 histocompatible 호스트에 놓는 아르통증은 congenic 마커 항체 2,3의 사용을 추적. 강력한 있지만,이 방법은 4,5 하나의 에피토프에 대한 특이성과 T 세포의 unphysiological 주파수와 관련된 실험 유물을 앓고. 또한,이 시스템은 polyclonal 인구에서 에피토프 특정 T 세포 클론의 기능 이질성을 조사하는 데 사용할 수 없습니다. MHC (pMHC) 단지 : 적응 면역을 연구 할 수있는 이상적인 방법은 전적으로 해당 펩타이드 기원에 바인딩하여 TCR의 특이성을 구별하는 방법을 사용하여 내생 T 세포 레퍼토리의 에피토프 특정 T 세포의 직접 검출을 포함해야합니다. pMHC tetramers 및 유동 세포 계측법의 사용이 6 달성 있지만 다음과 같은 항원 유발 clonal 확장을 발견 에피토프 특정 T 세포의 높은 주파수 인구의 감지로 제한됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 pMHC의 tetramers의 사용을 조정 방법 및 magne을 설명틱 세포 농축 기술은 마우스 림프 조직 3,7에서 매우 낮은 주파수 에피토프 특정 T 세포의 탐색 기능을 사용하도록 설정합니다. 이 기술로, 하나는 종합적으로 면역 반응의 모든 단계에서 쥐 내생 T 세포의 전체 에피토프 별 인구를 추적 할 수 있습니다.

그림 2는 이전에 관련 펩타이드 + CFA와 함께 예방 접종을 쥐 대표 데이터를 묘사하면서 그림 1은 순진 쥐에서 pMHCII tetramer 강화 비장과 림프절 샘플을 대표하는 유동 세포 계측법의 음모를 도시한다. 시리얼 게이트는 CD4의 분석 + T 세포 인구에서 autofluorescent 및 기타 원치 않는 이벤트를 제거합니다. CD8 + T 세포 인구는 CD4의 pMHCII tetramer의 착색 + T 세포에 유용한 내부 대조군...

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Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를 수<em&gt; 생체 내</em&gt; 실험 시스템.

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

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Immunology and Infection

17.7K 조회수.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. 에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를 수 생체 내 실험 시스템.