이 프로토콜은 희귀한 항원 특이적 B 세포를 식별하기 위해 인간 기증자의 면역 레퍼토리를 심문하는 데 사용될 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술은 우리가 급속하게 복제될 수 있는 토착 짝이 무거운 및 빛 사슬을 얻고, 그 때 관심있는 항원 또는 항원에 대하여 직접 시험할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 인 마이크 모튼 (Mike Morton)이 될 것입니다.
해동 및 복구 후 적어도 한 시간, 원심 분리에 의해 기증자 PBMC를 수집합니다. 그리고 계산을 위해 얼음 차가운 MES 버퍼의 50 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 펠릿은 다른 원심분리에 의해 세포를 분리하고, 표준 프로토콜에 따라 CD22 마이크로비드와 양수 선택으로 CD22 양성 B 세포를 분리한다.
비드 절연 CD22 양성 세포를 원심분리에 의해 수집하고 Vax 버퍼 농도의 밀리리터 당 일곱 번째 세포에 4회 10번에서 세포를 재일시 중단한다. IgG CD19 CD27 항체 칵테일을 부드러운 혼합으로 제조업체의 희석 권고에 따라 세포에 추가하고, 7번째 세포에 알리쿼트 10을 음의 제어를 위한 1.5 밀리리터 미세센트심분리기 튜브에 추가합니다. PE와 APC를 가진 36 나노몰라의 최종 농도에서 음수 대조관에 이중 라벨이 붙은 비오틴 스테스타비딘 테트라머를 추가하여 정렬 튜브의 펩티드 수를 곱합니다.
신선한 Vax 버퍼와 각 튜브 2.5 밀리리터에 최종 볼륨을 가져와 36 나노 몰라 각 PE와 APC에서 튜브 정렬에 펩티드 테트라머를 추가합니다. 원심 분리 후, 세포를 TBS 농도 100 마이크로리터 당 6번으로 2배 10분, 어둠 속에서 4°C에서 회전한다. 인큐베이션이 끝나면 시료를 개별 5 밀리리터 필터 캡 튜브로 긴장하기 전에 세척당 신선한 TBS 버퍼로 세포를 두 번 세척합니다.
세포막 무결성의 마커로서 DAPI의 0.3 마이크로몰라 최종 농도로 샘플을 얼룩지게 한다. 그리고 세포 선별기의 전체 음수 제어를 실행하여 단일 세포 분류에 적합한 세포 집단을 격리시키기 위한 유동 세포 측정 게이트를 설정합니다. 항원 PE 대 항원 APC를 플롯하고 R8 게이트를 항원 PE 양성으로 설정하고, 이중 양성 게이트에서 낮은 수의 이벤트로 APC 양성 사분면을 설정한다.
이어서, 단일 CD19 양성 CD27 양성 항원 PE 양성, 항원 APC 양성 세포를 마스터 믹스의 개별 우물로 분류하여 96웰 플레이트를 준비하였다. 종류의 끝에서, 알루미늄 테이프 패드로 플레이트를 커버하고, 마이너스 80도 저장하기 전에 400 배 g에서 1 분 동안 세포를 원심 분리합니다. 역전사 반응을 수행하기 위해, 플레이트를 3300배g에서 2분간 회전하기 전에 얼음에 정렬된 B 세포를 2분간 해동하여 열기 전에 우물 내용자를 플레이트 바닥으로 끌어당깁니다.
적절한 효소 마스터 믹스로 세포를 치료한 후, 각 PCR 반응에 대한 템플릿으로 무료 DNA 2.5 마이크로리터를 추가하고 각 반응에 1 마이크로몰러의 최종 농도에 프라이머를 추가합니다. 이어서, 반응당 25마이크로리터에 최종 부피를 가져오기 위해 각 웰에 10X 폴리머라제 버퍼의 2X 농도를 추가한다. 그리고 50 사이클에 대해 각각 무겁고 가벼운 체인 PCR 반응을 실행합니다.
반응의 끝에서, 양성 증폭 안타를 시각화하기 위해 1%아가로즈 젤에 샘플을 실행합니다. 젤 추출을 통해 동일한 세포에서 페어링된 무거운 및 광 사슬 반응을 모두 분리합니다. 정확한 결찰 혼합 계산을 위해 광학 밀도에서 60까지의 DNA 단편 농도를 결정합니다.
회수된 무거운 및 라이트 체인 조각을 링커 조각과 제조업체의 지시에 따라 4개의 조각 결찰 반응을 사용하여 발현 벡터 백본을 결합합니다. 그리고 제조 업체의 지시에 따라 화학적으로 유능한 박테리아로 결찰 반응을 변환합니다. 일단 항생제 판에 도금되면, 분당 250 회전에서 37섭씨 37도에서 하룻밤 에 잠복을 위한 나머지 변환 문화에 항생제를 가진 성장 매체의 4밀리리터를 추가합니다.
다음 아침, 제조업체의 지시에 따라 하룻밤 결찰 혼합 문화에서 미니 준비 DNA를 준비하고 결과 플라스미드 DNA 농도를 결정합니다. 격리된 항체의 항원 특이성을 확인하기 위해, 293세포의 10 밀리리터 현탁액에서 양이온 지질 염기 시약을 가진 미니렙 DNA의 10 마이크로그램. 세포 배양은 섭씨 37도, 이산화탄소 8%, 분당 125회 회전에서 3~4일 동안 배양한다.
인큐베이션이 끝나면 1000배 g에서 10분 동안 배양을 원심분리하고, 정제된 배지를 회수한다. 단백질 A에 친화성을 통해 상체에서 IgG 농도를 측정하고 표준 ELISA 프로토콜에 따라 종류에 사용되는 개별 펩티드에 대해 ELISA에 의해 밀리리터 농도 당 25 마이크로그램으로 상체내각 항체를 테스트한다. 이어서, IgG 초신체의 희석제를 이용하여 추가ELISA를 사용하여 화면 양성 안타를 확인하여 밀리리터당 20 마이크로리터에서 시작하여 초기 화면 ELISA에 반응성을 보이는 각 항원에 대한 광학 밀도에 대한 플롯을 생성한다.
인간 기증자로부터 항원 특이적 항체를 분리하기 위해 일련의 세포측정게이트를 고안하여 표적 메모리 B 세포를 분리할 수 있다. 림프구는 세포 크기와 세분성에 따라 분리되어 전방 및 측면 산란을 사용합니다. 이중 및 죽은 세포의 배제에 따라, 페노티픽 마커는 IgG 양성 CD19 양성 B 세포 및 CD27 양성 기억 B 세포의 분리를 허용한다.
단일 셀 복제의 첫 번째 판독은 각각의 무겁고 가벼운 가변 사슬의 증폭 확인입니다. 여기서, PCR이 나타난 후 42%의 페어링된 회복을 가진 24개의 단일 세포로부터 매우 효율적인 증폭의 예가 나타난다. IgG 복제 후, IgG 발현 벡터는 인간 배아 신장 293 세포로 변형된다.
회수된 항체는 ELISA에 의해 반응성을 위해 득점된 타우 펩티드의 원래 패널에 대하여 가려집니다. 추가 확인은 초기 스크린에서 확인된 펩티드에 대하여 동일한 재조합 항체 샘플의 농도 곡선을 사용하여 완료된다. 각각의 양수 적중에 대해, 개별 플라스미드 클론은 변형된 풀에서 분리되고 동일한 ELISA 방법에 의해 재확인될 수 있다.
목표는 단일 세포에서 증폭 서열, 그래서 기억 해야 할 가장 중요 한 것은 어떤 오염이 절차의 PCR 부분 동안 증폭 될 것입니다. 이 절차는 생성하고자하는 만큼 항체의 정화 및 기능적 특성화를 허용하는 인간 재조합 항체를 그대로 산출합니다.
