만성 HBV 감염에서 CD4 T 세포는 바이러스 성 클리어런스와 반환자 모두에서 중요한 역할을합니다. 이 방법을 사용하면 HBV 특정 CD4 T 셀 응답을 평가하고 HBV 특정 CD4 T 세포 에피토프를 동시에 식별할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 연구 조교인 젠메이 샤오(Jianmei Xiao)가 될 것입니다.
그리고 싱 완, 빌라오에서 기술자. 우선, 피콜 밀도 그라데이션 원심원심을 사용하여 20분 동안 800회 G로 말초 혈액 단핵세포 또는 PBMC를 혈액에서 분리한다. 이어서, 파스퇴 피펫을 사용하여 적혈구 층과 적혈구 층 사이의 과립구를 수집한다.
해동 된 세포 현탁액을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 미리 따뜻해지는 벤조나제 RPMI 1640의 밀리리터 를 넣고 현명하게 떨어뜨린 다음 천천히 6 밀리리터를 추가합니다. 벤조나제 RPMI 1640의 2밀리리터로 냉동 바이알을 헹구어 나머지 세포를 회수합니다. 그런 다음 튜브를 400배 G로 10분 동안 원심분리합니다.
상체를 제거하고 튜브를 눌러 펠릿을 느슨하게. 따뜻한 벤세나제 NACE RPMI 1640의 1밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다. 세포를 부드럽게 섞고, 세포 덩어리가 보이면 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 필터링합니다.
트라이판 블루와 혈전계를 사용하여 실행 가능한 세포를 계산합니다. 밀리리터 IL2당 10단위, 밀리리터 IL7당 10나노그램을 포함하는 PBMC 및 완전한 배양 배지를 다시 일시 중단한다. 셀 밀도를 밀리리터당 6세포로 1.5x10으로 조정합니다.
그런 다음 96-Well 평평한 바닥 플레이트에서 잘 당 다섯 번째 세포에 3x10의 밀도로 세포를 플레이트. 각 웰에 B형 간염 바이러스 또는 HBV 유래 펩티드 풀을 추가합니다. 배경 및 양수 컨트롤 Wells의 경우 동일한 양의 용매를 추가합니다.
플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 셋째 날에는 IL2밀리리터당 50단위, IL7 밀리리터당 10나노그램으로 배양 배지를 보충합니다. 7일째에는 배양 배지의 절반을 밀리리터 펩티드당 4마이크로그램, 밀리리터 IL2당 100대, 밀리리터 IL7당 20나노그램을 함유한 신선한 배지로 교체한다.
10일째에, 각 웰의 세포를 7~9회 부드럽게 피펫하여 세포 클러스터를 분해합니다. HPV 특이CD4 T 세포 반응 분석을 위한 96-웰 라운드 하단 플레이트의 각 웰으로 실행 가능한 세포의 수를 계산하고 2x10을 각 웰로 옮기다. 96-Well 플랫 하부 플레이트내의 잔류 세포의 경우, 과도한 배지를 폐기하여 배양 배지의 부피를 100 마이크로리터로 조정한다.
그런 다음, 글리리터 펩티드 당 4 마이크로그램, 밀리리터 IL2 당 100 단위, 밀리리터 IL7 당 20 나노그램을 포함하는 신선하고 완전한 배양 배지100 마이크로리터로 배양을 보완한다. 12일째에 에피토프 식별을 위해 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 세포를 계속 배양합니다. RPMI 1640의 200 마이크로리터를 추가하고, 플레이트를 550회 G에서 3분간 원심분리하고, 상판을 폐기하여 96-Well 라운드 하단 플레이트에서 셀을 세척합니다.
마지막 세척을 위해 완전한 배양 매체를 사용하여 두 번 세척을 반복하십시오. 특정 펩티드 풀로 자극된 각 셀의 각 웰에 대해 동일한 펩티드 풀로 보충된 완전한 배양 배지200 마이크로리터를 추가합니다. 배경 제어 우물의 경우 DMSO 밀리리터당 1개의 마이크로리터로 보완된 완벽한 배양 매체를 추가합니다.
긍정적 인 제어 우물의 경우 밀리리터 DMSO 당 1 개의 마이크로 리터, 밀리리터 PMA 당 150 나노 그램, 이오노마이신 리터 당 1 마이크로 몰로 보충 된 완벽한 배양 매체를 추가하십시오. 6시간 동안 이산화탄소 5%에서 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 잠복 한 시간 후, 문화에 밀리 리터 모넨신 당 1.37 마이크로 그램을 추가합니다.
6시간 배양이 완료되면 플레이트를 550배G로 3분간 원심분리합니다. 이전에 설명한 대로 상체를 제거하고 200마이크로리터의 DP로 한 번 세척합니다. 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8 및 생존 가능성 마커용 얼룩.
진동기로 세포를 일시 중단한 다음 30분 동안 섭씨 4도에서 플레이트를 냉장 보관합니다. DPBS의 200 마이크로 리터로 한 번 접시를 세척 한 후, 세포를 수정하고 퍼메아빌링, 세포 내 사이토카인에 대한 얼룩, TNF 알파와 인터페론 감마, 45 분 동안 섭씨 4도에서 접시를 냉장. 세포를 다시 한 번 씻고, 유동 세포측정 완충제의 150 마이크로리터에서 다시 중단하십시오.
이어서, 유동 세포계를 이용한 유동 세포측정 데이터를 습득한다. T-75 플라스크에서 알레르기 성 B-림프 구성 세포주 또는 BLCLs를 유지합니다. PBMC 확장의 12 일에, 실행 가능한 BLCL의 수를 계산하고, 15 밀리리터 원심 분리튜브로 전송.
세포를 350배 G에서 10분 동안 원심분리하고 상체를 제거합니다. 세포 펠릿을 다시 일시 중단하고 완전한 배양 배지를 한다. 그런 다음 BLCLs를 4x10에서 4x10의 96-Well 원형 바닥 플레이트에 잘 당 4 개의 세포로, 그리고 완전한 배양 배지의 80 마이크로 리터를 알리쿼트합니다.
단일 펩티드의 밀리리터당 10마이크로그램을 추가하고 두 개의 배경 컨트롤을 설정합니다. HLADR 블로킹, DMSO 맥동으로 펄어드는 펩타이드. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 2시간 동안 배양합니다.
밀리리터 미토마이신 C당 100마이크로그램을 추가하고 1시간 동안 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 플레이트를 배양합니다. RPMI 1640의 200 마이크로리터로 플레이트를 세 번 세척하여 펄스가 없는 펩타이드와 미토마이신 C를 제거한 다음, 진동기를 사용하여 완전한 배양 배지의 120 마이크로리터에서 세포를 다시 중단합니다. PBMC 확장 12일째에 PBMC를 96웰 라운드 하단 플레이트로 이전합니다.
플레이트내의 세포를 원심분리하고, 상체를 제거하고, RPMI 1640의 200 마이크로리터로 두 번 세척하여 이전에 입증하였다. 완전한 배양 배지의 210 마이크로리터로 각 웰마다 PBMC를 다시 중단합니다. 에피토프 식별을 위해 선택된 PBMC Wells의 경우, 셀 서스펜션의 70 마이크로리터를 알리쿼트하고 두 개의 배경 컨트롤을 포함하여 3개의 웰스에서 펩타이드 펄스 BLCLs와 혼합합니다.
플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 6시간 동안 배양합니다. 1시간 동안 잠복한 후 밀리리터 모넨신당 1.37 마이크로그램을 배양에 추가하고 완전한 배양 배지를 가진 200마이크로리터에 각 웰의 최종 볼륨을 가져옵니다. 이 대표적인 예에서, 펩타이드 풀 Core11에 대한 CD4 T 세포 응답을 분비하는 TNF 알파 및 인터페론 감마는 배경 값의 2배보다 낮기 때문에 부정적인 것으로 간주됩니다.
한편, 펩티드 풀 Core09에 대한 반응은 배경의 2배 이상이며 양성으로 간주됩니다. 회색 배경은 양성 CD4 T 세포 반응및 에피토프 식별을 위한 후보 펩타이드가 빨간색으로 표시되어 있으며, Core01은 열 펩타이드 풀에서 CD4T 세포를 분비하는 TNF 알파와 인터페론 감마 모두에서 판단하여 가장 높은 응답률을 갖는다. 펩타이드 C1 에서 15, C31 ~ 45, C61 ~ 75, C91 ~ 105, 이러한 펩티드 풀을 함유한 펩티드 풀의 행으로서 후보 펩티드로 설정되어 또한 긍정적인 결과를 나타낸다.
펩티드 풀 코어07, 08, 09 및 10으로 확장된 PBMC는 이러한 펩티드의 에피토프 식별에 사용된다. 마찬가지로, Core09행 펩티드 풀에서 가장 높은 응답률을 가지고 있습니다. 이 풀의 모든 펩타이드는 펩티드 풀로 확장된 후보 펩티드와 PBMC로 설정됩니다: Core01, 02, 03, 04, 05 및 06은 이러한 펩티드의 에피토프 식별에 사용된다.
펩타이드 풀 코어08확장 PBMC의 경우 펩타이드 C31에서 45펄스 BLCLs로 자극한 후, TNF 알파 및 인터페론 감마 분비 CD4 T 세포의 주파수는 배경 컨트롤보다 2배 높다. 따라서, 펩티드 C31 에서 45는 검증된 HLADR 제한된 CD4 T 세포 에피토프이다. 에피토프 식별 후 남은 추가 확장 된 PBMC가 있었습니다.
확인된 전형의 미세한 표시는 단축된 펩티드의 패널을 사용하여 수행될 수 있다.
