그녀의 우수한 기술 지원에 대해 Miyako Shigeta에게 감사드립니다. 이 연구는 JSPS 가켄 (교부 번호 25461252)에 의해 부분적으로 지원되었다.

모든 동물 실험 프로토콜은 Jichi Medical University의 동물 윤리위원회의 승인을 얻었으며 Jichi Medical University Laboratory Animals 안내서의 Experimental Animals Use and Care of Animals 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 복막 샘플 수집 <ol><li> 다음 품목을 수집하십시오 : isoflurane, 코르크 시트, 인산염 완충 식염수 (PBS), 수술 가위 및 포 셉과 페트리 접시에 흠뻑 목화와 50 ML 원심 분리기 튜브. </li><li> Isofluorane의 과다 복용으로 쥐를 안락사시키고, 70 % 에탄올로 쥐의 복부 피부를 스프레이하고, 뒤에 코르크 시트에 쥐를 탑재. </li><li> 가위와 포셉을 사용하여 복부 피부, 근육 및 복막에 세로 절개를하십시오. </li><li> 포 셉를 사용하여 복막을 집어 들고, 다이어프램 아래의 가장 낮은 늑골을 따라 그 상단 부분에 수평 절개를하고,외과 용 가위를 사용하여 옆쪽 영역에있는 오우리어 쪽. 다음으로 외과 용 가위를 사용하여 몸에서 복막을 제거하기 위해 세로로 절개하십시오. 그런 다음 페트리 접시에 PBS로 씻으십시오. </li><li> 외과 용 가위 및 집게를 사용하여 다음 단계에 적합한 크기 인 복막 막 샘플 20mg (3 ~ 5mm 2 )을 잘라내어 다듬습니다. </li></ol> 2. 복막 막 샘플로부터 전체 RNA 정제 참고 : 여기에 무게가 20mg 인 복막 샘플을 유리 호 모지 나이저 및 미세 원심 분리기 스핀 컬럼에서 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하여 균질화합니다. 그런 다음 복막 막 샘플의 총 RNA를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 사용하여 분리합니다. <ol><li> 다음 항목을 수집하십시오 : 1.5 또는 2.0 ML microcentrifuge 튜브, 100 % 에탄올, 클로로포름, 유리 호 모지 나이저, 얼음, biopolymer - microcentrifuge 스핀 열 10 에서 시스템을 분쇄 </s( 10) , 페놀 / 구아니딘 계 용해제, 구아니딘과 에탄올을 포함한 세척 완충액 (세척 완충액 1), 에탄올을 포함한 세척 완충액 (세척 완충액 2)을 포함한다. </li><li> 유리 호 모지 나이저에 20 MG 복막 샘플을 넣고 페놀 / 구아니딘 기반 용해 시약 700 μL를 추가합니다. </li><li> 뒤틀린 상태에서 유봉을 천천히 눌러 시료를 균질화하십시오. 복막 막 샘플이 페놀 / 구아니딘 기반 용해 시약에 완전히 용해 될 때까지 얼음 위에서이 과정을 수십 번 반복합니다. </li><li> 추가 균질, 2.0 ML 수집 튜브에 microcentrifuge 스핀 칼럼에 biopolymer - 파쇄 시스템에 균질 lysate을 전송합니다. 그런 다음 14,000 xg에서 4 분간 3 분간 원심 분리하십시오. </li><li> Homogenized lysate를 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮긴다. </li><li> 균질화 lysate에 클로로포름 140 μL를 추가하고 욕조를 모자안전하게. 그런 다음 튜브를 15 초 동안 뒤집어서 혼합하십시오. </li><li> 실온에서 2-3 분 동안 샘플을 품어 낸다. 그런 다음 12,000 xg에서 15 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하십시오. </li><li> 침전물을 방해하지 않고 상등액 (일반적으로 300 μL)을 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮기고 100 배 에탄올의 1.5 배량 (일반적으로 450 μL)을 첨가하십시오. 그런 다음 5 초 동안 볼 텍싱하여 샘플을 섞으십시오. </li><li> 시료 700 μL를 2.0 mL 수집 튜브에 놓여있는 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣으십시오. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 엄격하게 샘플을 씻어 실리카 막 기반 스핀 칼럼에 세척 버퍼 1 700 μL를 추가합니다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 실리카 멤에 세척 버퍼 2 500 μL를 추가하십시오rane 기반의 스핀 컬럼으로 소금의 흔적을 제거합니다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 2.11을 반복하십시오. </li><li> 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 15,000 xg에서 1 분간 다시 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 새로운 1.5 ML 수집 튜브에 실리카 멤브레인 기반 스핀 칼럼을 놓습니다. 그런 다음 RNase가없는 물 25 μL를 컬럼으로 옮긴다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 샘플을 실온에서 5 분 동안 방치하십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 1 분간 원심 분리합니다. </li><li> 총 RNA가 포함 된 25 μL 용리액을 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮기십시오. 그런 다음 사용하기 전에 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 3. 총 RNA의 역전사 참고 : 정량 실시간 PCR 실험의 출판을위한 최소 정보에 대한 참고 및 준수iments (MIQE) 지침은 더 나은 실습을 장려하고 신뢰성 있고 명확한 결과를 얻는 데 도움이됩니다. 참고 : 여기서 역전사 효소, poly (A) polymerase 및 oligo-dT primer를 사용하여 총 1.0 μg의 분리 된 RNA를 역전 사합니다. <ol><li> 다음 품목을 수집하십시오 : 1.5 mL microcentrifuge tubes; 8- 웰 스트립 튜브; RNase없는 물; 얼음; 역전사 효소 키트 (물질 표 참조) 11 . </li><li> 2.0 μL의 10x 핵산 믹스, 2.0 μL의 역전사 효소 믹스 (키트에서), 4.0 μL의 5x hi-spec 버퍼를 포함하는 마스터 믹스 용액을 튜브 당 총 8.0 μL로 준비하십시오. </li><li> 마스터 믹스 용액 (키트에서) 8.0 μL를 각 튜브에 분배합니다. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 전체 RNA 양을 측정하십시오. 복막 막 샘플에서 정제 된 분리 된 총 RNA 1.0 μg을 각 튜브에 첨가합니다. 참고 : qRT-PCR은 미국에서 수행 할 수 있습니다.정화 된 총 RNA의 품질 관리를 위해 역전사없이 전체 RNA를 주형으로 사용합니다. DNA가 오염되면 qRT-PCR에 의해 예상치 못한 증폭 산물이 관찰됩니다. </li><li> 총 20 μL까지 각 튜브에 RNase가없는 물을 첨가하십시오. 그런 다음 피펫 팅으로 철저히 혼합하고 15 초 동안 원심 분리하십시오. </li><li> 37 ° C에서 60 분 동안 견본을 품어 라. 95 ° C에서 5 분간 즉시 품어 라. 참고 :이 단계는 열 순환 장치에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> cDNA를 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮기고 RNase가없는 물로 10 배 희석하십시오 (1:10). </li><li> 희석 된 cDNA를 얼음에 일시적으로 보관하고 사용하기 전에 장기간 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 4. miRNA의 qRT-PCR 참고 : miRNA의 qRT-PCR은 인터 칼 레이팅 염료를 사용하여 수행됩니다. 여기에는 RNA, U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p 프라이머 사용 된. <ol><li>다음 항목을 수집 : 1.5 ML microcentrifuge 튜브, qRT - PCR, 96 - 웰 반응 플레이트에 대한 접착 필름, miRNA 특정 primers, 녹색 염료 기반의 PCR 키트 (자료 테이블을 참조하십시오) 11 에 대한 96 잘 반응 플레이트, 그리고 실시간 PCR 기기. </li><li> 2x PCR 마스터 믹스 12.5 μL, nuclease-free 물에 용해 된 5 μM 각 miRNA 프라이머 2.5 μL 및 각 웰에 대한 10 배 범용 프라이머 1.25 μL가 들어있는 마스터 믹스를 준비하십시오. </li><li> 96- 웰 플레이트의 각 웰에 22.5 μL의 마스터 믹스를 분배합니다. </li><li> 각 우물에 2.5 μL의 template cDNA를 첨가한다. </li><li> 96- 웰 반응 플레이트 용 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 그런 다음 플레이트를 1,000 xg에서 30 초간 원심 분리하십시오. </li><li> 다음과 같이 실시간 PCR Instrument 및 소프트웨어로 PCR cycling 프로그램을 실행하십시오. <ol><li> 실시간 PCR 장비에 플레이트를 놓습니다. 실시간 PCR 소프트웨어에서 실험적 속성을 정의합니다 (실험적으로 입력이름, 악기의 실험 유형에 대한 &quot;96 - 우물&quot;을 선택, &quot;SYBR 녹색 시약&quot;대상 시퀀스를 감지하는 &quot;SYBR 녹색 시약&quot;을 선택 &quot;2 - ΔΔCT 방법&quot;을 선택하고, &quot;표준 램프 속도&quot;를 선택하십시오 악기 실행). </li><li> 그런 다음 샘플에 이름을 지정하고 각 웰에서 miRNA를 표적으로 삼습니다. 샘플은 항상 결과 검증을위한 충분한 데이터를 얻기 위해 중복 또는 3 중으로 테스트됩니다. 표준 시료와 내인성 대조군을 선택하십시오. 염료가 수동 기준으로 사용하려면 &quot;없음&quot;을 선택하십시오. </li><li> 지시에 따라 실시간 PCR 소프트웨어에 &quot;20 μL&quot;의 반응 부피와 다음의 PCR 사이클링 조건을 입력하십시오 : 95 ° C에서 15 분 동안 프리 인큐베이션 한 다음 94 ° C에서 15 초 동안 변성 55 ° C에서 30 초, 어닐링은 70 ° C에서 30 초 동안 수행 하였다. </li></ol></li><li> qRT-PCR 데이터 분석 u실시간 PCR 장비의 소프트웨어를 부릅니다. 소프트웨어에 의해 자동으로 결정되는 임계 값과 기준선이 각 우물에서 적절한 지 확인하십시오. </li><li> 각 표본에서 표적 miRNA의 임계주기를 확인하십시오. 임계주기는 증폭 곡선과 임계 선 사이의 교차점입니다. 그런 다음, 내인성 대조군으로서 RNU6-2에 대한 표적 miRNA의 발현 수준을 표준화하고, 2 - ΔΔCT 방법 13을 사용하여 표적 miRNA의 상대 발현 수준을 계산한다. 참고 : 내인성 대조 miRNA의 발현 수준의 안정성을 확인해야합니다. 이 실험에서, RNU6-2는 높은 수준에서 각 그룹에 걸쳐 상대적으로 변하지 않는 것으로 확인되었다. </li></ol>

<ol>
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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

이 원고에 제시된 프로토콜을 사용하여, qRT-PCR을 사용하여 쥐 복막의 miRNA를 성공적으로 정제하고 검출 하였다. qRT-PCR 데이터 분석의 신뢰성은 정제 된 miRNA의 품질에 달려 있습니다. 따라서 miRNA의 순도는 분광 광도계를 사용하여 측정 할 수있는 280 nm에서의 흡광도 대 260 nm에서의 흡광도의 비율로 qRT-PCR 전에 확인할 수 있습니다. qRT-PCR을 사용하여 miRNA가 현저히 증폭되지 않으면 주형 cDNA의 농도가...

MicroRNAs (miRNAs)는 전 사적으로 mRNA (messenger RNA) 발현을 조절하는 짧은 비 암호화 RNA입니다. miRNA의 발현 변화는 암, 염증, 대사 장애 및 섬유증 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8을 비롯한 다양한 병리학 적 조건에서 중추적 인 역할을하는 많은 mRNA의 발현을 조절합니다. 따라서 miRNA는 새로운 바이오 마커 및 치료 표적 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 로 잠재력이 있습니다. miRNA 발현 프로파일은 다양한 래트에서 결정되었다간, 심장, 폐 및 신장을 포함한 장기 및 조직 9 . 그러나, 랫 복막에서 miRNA의 정제 및 검출에 대한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다. 이 프로토콜의 전체 목표는 성공적으로 쥐의 복막에 miRNAs을 정화하고 감지하는 것입니다. 먼저, 유리 호 모지 나이저를 사용하여 복막 막 샘플을 균질화시킨 다음, 미세 원심 분리기 스핀 컬럼 10 에서 생체 고분자 파쇄 시스템에 노출시켰다. 다음으로, 실리카 막 기반 스핀 컬럼 10을 이용하여 복막 샘플로부터 miRNA를 포함한 total RNA를 정제 하였다. 이어서 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머 11을 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. 마지막으로, 삽입 염료 11을 사용하여 qRT-PCR에 의해 miRNA의 발현을 측정 하였다. 이 프로토콜의 이론적 근거는 b이전 연구에서 단순한 과정으로 조직에서 miRNA의 유의 한 정화 및 검출을 보여주었습니다 8 , 10 , 11 . 미세 원심 분리기 스핀 컬럼과 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에서 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하면 조직에서 고품질의 총 RNA를 정제 할 수 있다고보고되었습니다. 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머를 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하는 방법 및이 프로토콜에서 인터 칼 레이팅 염료를 사용하는 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현을 검출하는 방법이 높은 정확성을 보인 것으로보고되었다. 감도 11 . 또한이 작업은 시간을 절약하고 기술적 오류를 방지하는 간단한 프로세스입니다. 따라서이 프로토콜은 광범위한 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 miRNA의 매우 정확하고 민감한 검출을 필요로하는 연구에 유용합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>silica-membrane based spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>includes 10&#215; Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer&#160;&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>not disclosed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-142-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00031451</td>
			<td>5&#39;-UGUAGUGUUUCC 
			UACUUUAUGGA-3&#39;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-21-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>5&#39;-UAGCUUAUCAG 
			ACUGAUGUUGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-221-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003857</td>
			<td>5&#39;-AGCUACAUUGU 
			CUGCUGGGUUUC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033320</td>
			<td>5&#39;-UGUCAGUUUG 
			UCAAAUACCCC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-34a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003318</td>
			<td>5&#39;-UGGCAGUGUCU 
			UAGCUGGUUGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-327 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00000805</td>
			<td>5&#39;-CCUUGAGGGG 
			CAUGAGGGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylglyoxal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midperic</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td>peritoneal dialysis fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague&#8211;Dawley rats</td>
			<td>SLC</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr

MicroRNAs (miRNAs)는 전사 후 사슬 RNA 발현을 조절하는 작은 비 암호화 RNA입니다. miRNA 발현 프로파일은 쥐의 다양한 기관과 조직에서 조사되었습니다. 그러나, miRNA의 정제 및 쥐 복막에서의 발현 검출을위한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다. 우리는 랫트 복막에서 정량적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 이용하여 miRNA를 정제하고 정량화하는 효과적이고 신뢰성있는 방법을 개발했다. 이 프로토콜은 4 단계로 구성되어 있습니다 : 1) 복막 샘플의 정화; 2) 복막 막 시료로부터의 miRNA를 포함하는 전체 RNA의 정제; 3) cDNA를 생산하기위한 miRNA의 역전사; 및 4) miRNA 발현을 검출하기위한 qRT-PCR. 이 프로토콜을 사용하여 6 개의 miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p)의 발현이 증가한 것을 성공적으로 확인했습니다.쥐 복막 섬유증 모델의 복막이 대조군에 비해 유의하게 높았다. 이 프로토콜은 많은 병리학 조건에서 쥐의 복막에서 miRNA 표현의 프로필을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

여기에 제시된 결과는 이전에보고 된 연구 8 에 근거합니다. 우리는 복막 섬유증에서 miRNA 발현 프로파일을 조사했다. 복막 섬유증은 복막 투석의 주요 합병증입니다. 그것은 mesothelial 세포 monolayer의 손실과 extracellular 매트릭스 구성 요소의 과도한 축적을 특징으로하고, 복막 막 실패 14 , 15 와 관련이 있습니다....

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Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

여기 우리는 양적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 microRNA 표현의 탐지 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는데 적합합니다.

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

7.8K 조회수.  Saitama Medical Center, Jichi Medical University.  여기 우리는 양적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 microRNA 표현의 탐지 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는데 적합합니다. 

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Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (&#916;S) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (&#945;) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (&#946;). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (S&#945;, S&#946;, &#916;S&#945; and &#916;S&#946;) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and &#945;/&#946; C-termini, can be quantified.

절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. In recent years, miRNA-mediated gene regulation has shown potential for treatment of neurological disorders caused by a toxic gain of function mechanism. However, efficient delivery to target tissues has limited its application. Here we used a transgenic mouse model for spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA), a neuromuscular disease caused by polyglutamine expansion in the androgen receptor (AR), to test gene silencing by a newly identified AR-targeting miRNA, miR-298. We overexpressed miR-298 using a recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype 9 vector to facilitate transduction of non-dividing cells. A single tail-vein injection in SBMA mice induced sustained and widespread overexpression of miR-298 in skeletal muscle and motor neurons and resulted in amelioration of the neuromuscular phenotype in the mice.

Here we describe the delivery of microRNA using a recombinant adeno-associated virus serotype 9 in a mouse model of a neuromuscular disease. A single peripheral administration in mice resulted in sustained miRNA overexpression in muscle and motor neurons, providing an opportunity to study miRNA function and therapeutic potential in vivo.

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly sensitive. This protocol obtains precise measurements of gene expression from single worms or from bulk samples. The protocol presented here provides a novel adaptation of existing methods for complementary DNA (cDNA) preparation coupled to a nanofluidic RT-qPCR platform. The first part of this protocol, named &#8216;Worm-to-CT&#8217;, allows cDNA production directly from nematodes without the need for prior mRNA isolation. It increases experimental throughput by allowing the preparation of cDNA from 96 worms in 3.5 h. The second part of the protocol uses existing nanofluidic technology to run high-throughput RT-qPCR on the cDNA. This paper evaluates two different nanofluidic chips: the first runs 96 samples and 96 targets, resulting in 9,216 reactions in approximately 1.5 days of benchwork. The second chip type consists of six 12 x 12 arrays, resulting in 864 reactions. Here, the Worm-to-CT method is demonstrated by quantifying mRNA levels of genes encoding heat shock proteins from single worms and from bulk samples. Provided is an extensive list of primers designed to amplify processed RNA for the majority of coding genes within the C. elegans genome.

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In this article a high-throughput protocol for fast and reliable determination of gene expression levels in single or bulk C. elegans samples is described. This protocol does not require RNA isolation and produces cDNA directly from samples. It can be used together with high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to partially complementary target sites in the 3&#39; untranslated region (UTR) of messenger RNA (mRNA), which reduces the mRNA&#39;s translation and stability. The miRNA expression profiles in various organs and tissues of mice have been investigated, but standard methods for the purification and quantification of miRNA in mouse kidney have not been available. We have established an effective and reliable method for extracting and evaluating miRNA expression in mouse kidney with renal interstitial fibrosis by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The protocol required five steps: (1) creation of sham and unilateral ureteral obstruction (UUO) mice; (2) extraction of kidney samples from the UUO mice; (3) extraction of total RNA, which includes miRNA, from the kidney samples; (4) complementary DNA (cDNA) synthesis with reverse transcription from miRNA; and (5) qRT-PCR using the cDNA. Using this protocol, we successfully confirmed that compared to the controls, the expression of miRNA-3070-3p was significantly increased and those of miRNA-7218-5p and miRNA-7219-5p were significantly decreased in the kidneys of a mouse model of renal interstitial fibrosis. This protocol can be used to determine the miRNA expression in the kidneys of mice with UUO.

We describe a method for evaluating the microRNA expression in the kidneys of mice with unilateral ureteral obstruction (UUO) by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction. This protocol is suitable for studying kidney microRNA expression profiles in mice with UUO and in the context of other pathological conditions.

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

A Virtual Machine Platform for Non-Computer Professionals for Using Deep Learning to Classify Biological Sequences of Metagenomic Data

A variety of biological sequence classification tasks, such as species classification, gene function classification and viral host classification, are expected processes in many metagenomic data analyses. Since metagenomic data contain a large number of novel species and genes, high-performing classification algorithms are needed in many studies. Biologists often encounter challenges in finding suitable sequence classification and annotation tools for a specific task and are often not able to construct a corresponding algorithm on their own because of a lack of the necessary mathematical and computational knowledge. Deep learning techniques have recently become a popular topic and show strong advantages in many classification tasks. To date, many highly packaged deep learning packages, which make it possible for biologists to construct deep learning frameworks according to their own needs without in-depth knowledge of the algorithm details, have been developed. In this tutorial, we provide a guideline for constructing an easy-to-use deep learning framework for sequence classification without the need for sufficient mathematical knowledge or programming skills. All the code is optimized in a virtual machine so that users can directly run the code using their own data.

This tutorial describes a simple method to construct a deep learning algorithm for performing 2-class sequence classification of metagenomic data.

메지노믹 데이터의 생물학적 시퀀스를 분류하기 위해 딥 러닝을 사용하기 위한 비컴퓨터 전문가를 위한 가상 머신 플랫폼

A variety of biological sequence classification tasks, such as species classification, gene function classification and viral host classification, are ...