이 방법은 신장 섬유증과 같은 광범위한 병리학 적 조건을 가진 마우스의 신장에서 microRNA 발현을 제공할 수 있게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 시간을 절약하고 기술적 오류를 방지하는 간단한 프로세스를 사용하여 높은 정확도와 감도로 마이크로RNA 발현 프로파일링을 가능하게 한다는 것입니다. 가짜 수술을 수행하려면 외과 가위와 핀셋을 사용하여 복부의 피부에 절개를하고 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막을 자른다.
PBS로 두 면봉을 적시고 창자를 조심스럽게 옆으로 당깁니다. 왼쪽 신장과 요관을 식별하기 위해 촉촉한 면봉을 놓습니다. 회막을 닫은 다음 4-0 나일론으로 절개를 합니다.
일방적인 요도 방해, 또는 UUO를 수행하기 위해 복부의 피부에 절개를하고 가짜 수술에 대해 입증 된 바와 같이 근육과 복막을 잘라냅니다. 마우스 아래에 2.5 밀리리터 주사기를 놓습니다. PBS로 두 면 봉기를 모은 다음 핀셋으로 창자를 조심스럽게 옆으로 당기고 면봉을 놓아 왼쪽 요관자를 식별합니다.
핀셋을 사용하여 왼쪽 신장을 들어 올립니다. 4-0 실크를 사용하여 왼쪽 요관을 두 곳에서 약 1센티미터 떨어진 곳에 장식합니다. 두 결찰의 중심 지점에서 요관을 잘라 한 다음 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 회막과 절개를 닫습니다.
이전에 설명한 대로 회막을 절단한 후 핀셋으로 들어 올려 외과 가위를 사용하여 상단 가장자리에서 옆으로 절개를 한 다음 갈비뼈의 가장 낮은 가장자리를 따라 절개를 계속합니다. 왼쪽 신장을 확인하고 신장이 황백색으로 변할 때까지 PBS로 역류합니다. 왼쪽 신장 동맥과 정맥을 수술 가위로 절단하여 신장을 제거하고 페트리 접시에 넣은 다음 PBS로 조심스럽게 씻으신다.
수술 가위와 핀셋으로 신장을 약 10밀리그램 샘플로 자르고 신장의 각 조각을 자체 1.5 밀리리터 미세 센트심분리기 튜브에 넣고 튜브의 캡을 닫습니다. 실리콘 균질화에 신장 샘플을 넣고 페닐 / 구아니딘 기반 용액 시약의 700 마이크로 리터를 추가합니다. 신장 샘플에 대해 균질화제의 봉헌을 천천히 누르고 비틀어 균질화합니다.
샘플이 용해 시약에 완전히 용해 될 때까지 누르고 비틀기 반복합니다. 시료를 균질화하기 위해 균질화된 용재를 생체 폴리머 스핀 컬럼으로 옮기고 3분 동안 14, 000회 G로 회전한 다음 침전된 용액을 사용하지 않은 1.5밀리리터 미세원심분리튜브로 이송한다. 튜브에 140 마이크로리터의 클로로폼을 결합하고 튜브를 단단히 덮습니다.
lysate와 클로로폼을 혼합하려면 튜브를 15 번 반전시하십시오. 실온에서 2~3분 동안 샘플을 배양한 다음 섭씨 4도에서 15분 동안 12, 000배 G로 회전합니다. 침전을 방해하지 않고, 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 상체를 전송하고, 100 % 에탄올의 1.5 배를 추가합니다.
혼합물을 5초 동안 소용돌이시다. 2밀리리터 수집 튜브의 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 시료 700 마이크로리터를 적재합니다. 컬럼 캡을 닫고 컬럼을 15, 000회 G로 15초 간 돌린 다음 수집 튜브에 침전된 용액을 버리십시오.
2밀리리터 수집 튜브의 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 700 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하여 샘플을 철저히 세척하십시오. 그런 다음 원심 분리를 반복하고 수집 튜브를 버리십시오. 워시 당 2 개의 세척 버퍼 500 마이크로 리터로 두 번 세척을 반복하십시오.
마지막 세척 후 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 15, 000회 G에서 1분 동안 000회 회전하고 침전된 용액을 버리십시오. 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮킵니다. 총 RNA를 컬럼에 RNase 가 없는 물 30마이크로리터를 추가하여 녹이고 컬럼 캡을 닫고 실온에서 5분간 둡니다.
그런 다음 1분 동안 15, 000회 G로 컬럼을 회전시합니다. 총 RNA를 함유한 샘플을 얼음 위에 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기고, 분광광법에 의한 총 RNA의 농도를 측정한다. 원고 방향에 따라 마스터 믹스 솔루션을 준비하고 8웰 튜브 스트립의 각 튜브에 8 개의 마이크로 리터를 추가하십시오.
총 RNA 밀도를 조정한 후, 각 튜브에 총 RNA의 12 마이크로리터 알리쿼트를 배치하고 캡을 닫습니다. 튜브를 15초 동안 원심분리합니다. 튜브를 온도 순환기에 넣고 섭씨 37도에서 60 분 동안 배양하십시오.
완료되면, 즉시 cDNA의 합성을 위해 섭씨 95도에서 5 분 동안 배양하십시오. cDNA를 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 증류수로 10회 희석합니다. 소용돌이와 원심분리기를 5초 동안 튜브에 대고 텍스트 원고에 설명된 대로 정량적 실시간 PCR을 수행합니다.
이 프로토콜은 20~25그램의 8주된 수컷 마우스에서 좌측 요관 결찰을 통해 일방적인 요도 방해 마우스 모델을 만드는 데 사용되었다. 우레는 4-0 실크 봉합사로 더블 리그에 완전히 막혀 있었다. 신장은 수술 후 8 일 에서 수집되었다.
microRNA qRT-PCR 데이터는 마이크로RNA 3070-3p의 수준이 현저하게 증가하고 마이크로RNA, 7218-5p 및 microRNA 7219-5p의 수준이 대조군과 비교하여 UUO 마우스의 신장에서 감소되었다는 것을 나타냈다. 이 프로토콜을 시도할 때, 좋은 RNA 추출을 달성하기 위하여 페닐/구아니딘 기지를 둔 용해 시약에 완전히 용해될 때까지 신장 견본을 비틀기 반복하는 것을 기억하십시오.
