이 프로토콜은 세포 또는 조직 용해와 같은 복잡한 생물학적 샘플에서 내인성 CK2 기판의 특정 라벨링 및 후속 농축 및 식별을 허용한다. 이 방법은 모든 세포 유형 또는 조직에 적용될 수 있다. 따라서 다양한 생물학적 맥락에서 CK2의 연구를 촉진한다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 존 Chojnowski가 될 것입니다. 시작하려면, 총 900 마이크로리터의 시료를 수집하기 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 조직 샘플 또는 배양 세포를 기계적으로 분해한다. 원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 3분간.
그런 다음, 3개의 새로운 1.7 밀리리터 미세원심분리기 튜브의 각각에 상피의 270 마이크로리터를 전송합니다. 입력 제어로 사용할 나머지 상체의 40 마이크로리터를 제거하고 새로운 튜브로 전송합니다. 모든 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
먼저, 여기에 표시된 대로 3개의 샘플 튜브각각에 라벨을 붙입니다. 키나제 반응 튜브에 CK2의 2.7 마이크로리터와 2.7 마이크로리터를 2.5 밀리머 GTPgammaS를 추가합니다. 튜브를 플릭하여 섞어 즉시 얼음 위에 놓습니다.
GTPgammaS 전용 튜브에 2.7 마이크로리터 2.5 밀리머 GTPgammaS, 그리고 2.7 리시스 버퍼의 마이크로리터를 추가합니다. 혼합이 튜브를 플릭하고 즉시 얼음에 배치합니다. PNBM 전용 튜브에 5.4 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가합니다.
튜브를 플릭하여 섞어 즉시 얼음 위에 놓습니다. 30°C에서 1분간 3개의 튜브를 모두 수조에 담는다. 그 후 각 튜브에 밀리리터당 12밀리그램에 13.5 마이크로리터의 PNBM을 추가합니다.
튜브를 반전하여 샘플을 혼합하고 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 샘플이 인큐베이팅되는 동안 여기에 표시된 대로 샘플이 로드될 각 열에 레이블을 지정합니다. 각 열을 여러 번 반전하여 저장소 버퍼의 Sephadex G-25 수지를 다시 일시 중지하여 열을 준비합니다.
각 컬럼을 클램프 스탠드에 부착하고 약 5분간 방해받지 않고 앉아 수지정착을 허용합니다. 다음으로 각 컬럼의 아래쪽 개구부 아래에 튜브를 놓습니다. 각 컬럼의 상단과 하단모두에서 캡을 제거하여 저장 버퍼가 중력에 의해 튜브로 배출되도록 합니다.
저장소 버퍼가 고갈되면 각 열에 약 2.7 밀리리터의 Lysis Buffer를 추가하여 이를 상화하여 흐름을 수집하고 폐기합니다. Lysis 버퍼를 추가하고 흐름을 세 번 삭제하는 이 프로세스를 반복합니다. 시작하려면 각 샘플을 해당 열에 로드합니다.
흐름을 수집하고 폐기합니다. 각 컬럼에 420마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가하여 샘플을 세척합니다. Lysis 버퍼가 열을 통해 필터링하고 흐름을 수집하고 폐기하도록 합니다.
그런 다음 샘플 수집을 위해 각 컬럼 아래에 튜브를 배치합니다. 샘플을 elute하기 위해 각 열에 500 마이크로리터의 Lysis 버퍼를 추가합니다. 지금 키나아제 반응에 있는 티오포스포리및 alkylated CK2 기판의 농축된 인구를 포함하는 통해 흐름을 수집합니다.
GTPgammaS 만 반응은 어떤 내생 CK2 존재에 의해 기질 티오포스포리및 알킬것을 포함합니다. PNMB 만 반응은 배경 알키드 단백질을 포함합니다. 용출 입력 제어 샘플로 각 용출에서 80 마이크로리터를 제거합니다.
다음으로 각 샘플을 각각 200마이크로리터가 포함된 두 개의 튜브로 분할합니다. 여기에 도시된 바와 같이 각 튜브를 안티 티오포스페이트 에스테르 또는 면역글로불린 G로 라벨을 붙인다. 각 티오포스페이트 에스테르 튜브에 2.8 마이크로그램의 항티오포스페이트 에스테르 항체를 첨가합니다.
각 IGG 튜브에 2.8 마이크로그램의 이소타입 제어 항체를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 2시간 동안 회전에 놓습니다. 샘플 인큐베이션의 마지막 15 분 동안 깨끗한 면도날을 사용하여 P200 파이펫 팁의 끝을 잘라 게이지 크기를 증가시면 됩니다.
사용하기 직전에 아가로즈 구슬이 들어 있는 저장 튜브를 잠시 소용돌이시다. 절단 파이펫 팁을 사용하여 면역 침전물당 비드 슬러리 100 마이크로리터를 새로운 1.7 밀리리터 미세센심분리기 튜브로 이송합니다. 구슬이 침전되는 것을 방지하기 위해 각 전송 전에 구슬을 소용돌이치게하는 것이 중요합니다.
17, 500 배 중력과 1 분 동안 섭씨 4도에서 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 폐기합니다. Lysis 버퍼의 200 마이크로 리터를 추가하고 잠시 혼합 소용돌이를 추가하여 구슬을 다시 중단합니다.
구슬을 원심분리하고 세게 씻는 과정을 세 번 반복하십시오. 마지막 세척 후, 진행 할 준비가 될 때까지 얼음에 구슬을 놓습니다. 시료가 인큐베이팅을 마쳤을 때 원심분리기는 중력17, 500배, 섭씨 4도에서 3분간 분리합니다.
그런 다음 각 샘플의 200 마이크로리터를 세척된 구슬을 포함하는 튜브로 옮겨냅니다. 튜브를 회전에 섭씨 4도에 1시간 동안 놓습니다. 다음으로, 17, 500배, 섭씨 4도에서 1분간 튜브를 원심분리합니다.
각 미세입자에서 40마이크로리터를 제거하여 고갈 제어로 저장합니다. 구슬을 방해하지 않도록 주의하면서 나머지 상체를 제거하고 버리십시오. 각각에 200 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가하고 간략하게 소용돌이를 만들어 샘플을 씻어내라.
원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 1분간 1분간 상주포를 폐기한다. 이 세척 및 원심 분리 과정을 세 번 반복하여 구슬을 방해하지 않도록 주의하십시오. 그 후 구슬을 포함하는 각 샘플에 2X 샘플 버퍼50마이크로리터를 추가합니다.
입력 제어, 용출 입력 제어 및 고갈 컨트롤을 포함하는 다른 모든 샘플의 경우 6X 샘플 버퍼의 8 마이크로리터를 추가합니다. 파이펫각 튜브는 구슬이 들어 있는 튜브를 제외한 모든 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 가열한 후 SDS-PAGE를 진행합니다. 면역 침전이 성공했는지 평가하기 위해 별도의 12.5 %의 폴리 아크릴 아미드 젤에서 구슬에서 벗어난 각 샘플의 25 ~ 30 마이크로 리터를 실행합니다.
각 젤을 쿠마시 블루와 함께 염색하여 실험 프로토콜의 다양한 단계에서 농축된 단백질을 시각화합니다. 새롭고 깨끗한 면도날을 사용하여 키나아제 반응 항티오포스페이트 에스테르 IP 레인에 존재하는 독특한 밴드를 신중하게 절제하고 대략적인 분자량을 기록합니다. 각 고유 밴드에 새 면도날을 사용해야 합니다.
이 기술의 기본 기초는이 기술은 인스포릴 그룹 전송에 대 한 GTP를 사용 하는 CK2의 특이 한 능력. GTP 아날로그와 함께 외인성 CK2 홀로효소를 첨가한 GTPgammaS는 세포 용액에, 내인성 CK2 기판의 티오포스포틸화를 초래한다. 알킬라팅 시약 p-니트로벤질 메실레이트와 함께 용액의 후속 치료는 이러한 특정 기판 단백질에 티오포스페이트 에스테르 모에티를 생성하며, 이는 항 티오포스페이트 에스테르 항체를 사용하여 면역침전될 수 있으며 궁극적으로 질량 분광법에 의해 식별될 수 있다.
여기에 나타난 대표적인 긍정적인 결과에서 CK2 의존성, 티오포스포릴화 및 후속 알킬레이션이 성공했습니다. 예상대로, 서양 블로팅에 의한 향상된 안티 티오포스페이트 에스테르 신호는 GTPgammaS만이 아닌 완전한 키나아제 반응을 포함하는 차선에서만 관찰되며, PNMB는 처리된 샘플만으로 관찰된다. 면역 절전 및 암시 된 단백질의 Coomassie Blue 스테인드 젤은 긍정적 인 결과를 보여줍니다.
여러 독특한 밴드는 항 티오포스페이트 에스테르 IP 레인에서만 분명하기 때문에, lysate는 외인성 CK2와 GTPgammaS로 배양되었습니다. 표시된 밴드는 젤에서 절제되고 질량 분석법에 의한 단백질 식별을 위해 제출됩니다. 이 절차에 따라, 질량 분광법에 의해 확인된 PUTative CK2 기판은 체외 키나아제 분석법에서 CK2 의존형 인산화와 같은 추가 접근법을 사용하여 검증되어야 한다.
