Maximilian Boesch는 Austrian Science Fund FWF의 Erwin Schrödinger Fellows (승인 번호 J-3807)의 지원을받습니다.

이 프로토콜은 표준 기관의 윤리적 검토위원회 지침을 완전히 준수합니다. 여기에 묘사 된 프로토콜을 사용하여 인간 또는 동물 조직을 조사하는 경우 연구자는 해당 기관 또는 국가의 관련 검토위원회의 승인을 받아야합니다. 주의 : 생물학적 시료의 안전한 취급에 대한 표준 예방 조치가이 프로토콜에 적용됩니다. 여기에는 장갑과 실험복을 착용하고 가능한 한 바이오 안전성 캐비닛 아래에서 작업을 수행하는 것이 포함됩니다. 1. 세포의 준비 <ol><li> 암 세포주 <ol><li> 적절한 매체 ( 예 : 10 % ( V / V ) FBS, 2 MM L - 글루타민과 1x 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 보충 RPMI 1640) 10-30 ML 37 ° C에서 각각의 인간 또는 마우스 암 세포주를 문화와 수확 0.05 % 트립신 -EDTA 또는 다른 일부 de-att로 소화를 사용하는 아 집단 ( 즉, 70-90 %)에서의 세포감사 절차. 카운팅 챔버와 트리 판 블루 얼룩을 사용하여 세포 수를 결정하고 생존력을 확인하십시오. 생존 세포의 비율은 85 %를 초과해야합니다. 참고 : SP 구획을 ​​포함하는 인간 암 세포주의 예에는 MCF7 / HTB-22 및 SKBR3 / HTB-30 (유방암), A2780 및 SKOV-3 / HTB-77 (난소 암) 및 A549 (폐암) 26이 포함 됩니다. </li></ol></li><li> 생체 외 종양 조직 <ol><li> 신선한 외과 종양 표본을 가져 가거나 또는 이식 가능한 또는 유 전적으로 조작 한 마우스 종양 모델에서 종양 조직을 수확하십시오. 200-1,000 mg의 조직을 가져 와서 기계적 분해 ( 예 : 가위 또는 메스 사용) 및 효소 분해 ( 예 : collagenase / dispase / DNase 칵테일 사용)를 통해 단일 세포 현탁액을 생성하십시오. </li><li> 샘플을 70 μm 컷오프 여과기로 여과하십시오. 셀 수를 결정하고 카운팅 챔버 및 트리 팬 (trypan)을 사용하여 생존력을 확인하십시오ue 염색법. 참고 : 소화 칵테일에는 종종 200 μg / mL 콜라게나 제 P, 0.8 U / mL 디스 패제 및 25 μg / mL DNase I가 포함되며 배양 시간은 일반적으로 20 - 50 분 사이입니다. 이상적으로, 조직 분해는 조사중인 조직에 대해 최적화 된 프로토콜 27 , 28 , 29에 따라 수행 됩니다. </li></ol></li></ol> 2. 샘플 테스트 <ol><li> 신선한 배지에서 세포 농도를 1 x 106 세포 / mL로 조정하십시오 (염료 압출은 활성 에너지를 소비하는 과정에서 중요합니다). 마지막으로, 1mL의 샘플을 일반 유동 세포 계측법 / FACS 둥근 바닥 튜브 ( &#39;테스트&#39;로 표시)로 옮긴다. 참고 : 최적의 결과를 얻으려면 세포 농도를 적정해야합니다 (예 : 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2.5 x 106 세포 / mL). 그러나보다 낮은 세포 농도더 높은 해상도 19 . 최대 수의 SP 세포가 회수되어야하는 분류 용도에 대해서만 세포 농도를 1 x 107 세포 / mL까지 증가시키는 것이 좋습니다. </li><li> 10 μM의 DCV를 샘플에 첨가하고 부드럽게 볼 텍싱하거나 3 ~ 5 배 재현하여 잘 섞는다. 억제 컨트롤로 진행하십시오. 참고 : 최적의 결과는 트리거링 염료 (예 : 2.5; 5; 10; 20 μM)의 적정에 따라 달라질 수 있지만 일반적으로 염료 농도가 높을수록 해상도가 더 높아집니다. </li></ol> 3. 억제 컨트롤 <ol><li> 염료 함유 세포 현탁액 250 μL를 새로운 유동 세포 계측법 / FACS 둥근 바닥 튜브 ( &#39;대조군&#39;으로 표시)에 옮긴다. 50 μM의 verapamil 또는 20 μM의 FTC를 첨가하고 pipetting으로 잘 섞는다. 참고 : Verapamil과 FTC는 SP 분석을 위해 가장 잘 확립 된 억제제이지만 다른 유출 펌프 특성y : 베라파밀은 ABCB1과 ABCB5를 포함한 몇 가지 ABC 약물 전달체를 억제하는 반면, FTC는 ABCG2 6 , 19 에 특이 적이다. 개별 샘플의 SP 상태가 알려지지 않은 경우 별도의 튜브에서 verapamil과 FTC를 모두 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. 염색 <ol><li> &#39;테스트&#39;및 &#39;컨트롤&#39;튜브를 모두 막아서 37 분간 37 ° C에서 어두운 곳에서 90 분 동안, 15 분마다 부드럽게 교반하십시오. SP 세포에서 염료 압출의 대부분은 처음 45 분 이내에 발생하지만 비 SP 세포 (해상도에 기여)의 염료 축적은 75-90 분 19 후에 최대입니다. </li><li> 얼룩이 완료되면, 3-4 ML 얼음으로 차가운 PBS에 세포를 씻어 100 μL (PBS뿐만 아니라)의 볼륨에 펠렛을 resuspend. 세포를 어둠에 보관하고 얼음 위에서 식힌 다음 추가 마커를 염색합니다. 또는 직접적으로 flow cytometric ana를 수행하십시오용해. </li></ol> 5. 다른 마커에 대한 비용 <ol><li> DCV - 스테인드 세포에 fluorochrome - 복합 항체의 원하는 패널을 추가 잘 혼합하고 4 ~ 20 분 동안 암흑에서 C를 품어. 3 - 4 ML 얼음으로 차가운 PBS에 세포를 씻어 죽은 세포 차별로 진행합니다. 참고 : DCV와 쉽게 호환되고 보상을 필요로하지 않는 항체는 PerCP 또는 PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 및 BV786 . DCV와 호환되지만 보상이 필요할 수있는 형식에는 FITC, Alexa Fluor 488, PE 및 BV650이 포함됩니다. 사실상 DCV와 호환되지 않는 형식으로는 BV421, V450 및 V500이 있습니다. </li><li> 특정 제조 업체가 권장하는 농도로 DCV로 염색 된 세포에 7-AAD (또는 PI)를 첨가하고 어둠 속에서 5 ~ 10 분 동안 표본을 품을 수 있습니다. 70 μm 컷 - 오프 strainers 통해 샘플을 필터링하고 흐름 cytometric 분석을 진행합니다.</li></ol> 6. 플로우 사이토 메트릭 분석 참고 : 샘플 준비가 완료되는 즉시 모든 염색계가 설정되도록 염색 과정 중에 각 유세포 분석기를 켜는 것이 좋습니다. 여기에는 시스템 성능 추적 및 탱크 재충전과 같은 표준 유지 관리 절차도 포함됩니다. <ol><li> 유동 세포 계측기에서 세포를 취득하고 bivariate FSC / SSC 도트 플롯 (그림 1B)에서 그들을 게이트. FSC의 다른 신호 ( 즉, 높이, 너비, 면적)를 비교하여 doublets 및 aggregates를 제외합니다 (그림 1C). <ol><li> 죽은 세포 마커가 포함 된 경우, 생존 가능한 세포 분획 ( 예 : 7-AAD- 음성)에 게이트가 삽입됩니다 ( 그림 1D ). &#39;파란색&#39;및 &#39;빨간색&#39;DCV 방출에 대해 이중 변이 점 그림에서 생존 가능한 단일 세포를 시각화합니다. 이를 위해 y 축 ( 예 : 450/50)에 &#39;파란색&#39;형광 채널을 표시하고 &#39;적색 &#39;형광 채널 ( 예 : 525/50). </li><li> 두 채널을 선형 모드로 전환하고 SP가 왼쪽 하단 사분면의 플롯 측면 에 위치하도록 검출기 전압을 그에 따라 조정합니다. 반대로, non-SP는 세포주기 분포 (G1 및 G2)를 반영하는 플롯의 오른쪽 위 사분면에 위치합니다. SP를 게이트하고 획득을 중지하십시오 ( 그림 1E ). 참고 : DCV 정의 SP 세포는 보라색 레이저 여기 소스 ( 예 : 405 nm 레이저 라인)가 장착 된 유동 세포 계측기를 사용하여 감지 할 수 있습니다. 방출 된 형광은 선형 모드와 2 변수 도트 플롯에 표시된 2 개의 개별 채널에서 측정되는 것이 SP 분석의 특유한 것입니다. DCV의 &#39;청색&#39;방출은 약 450 nm에서 측정되며 ( 예 : 450/40 표준 필터로 측정) DCV의 &#39;적색&#39;방출은 약 510-585 nm에서 측정됩니다 ( 예 : 510/50, a 525/50 또는 585/15 필터) 19 . 분석의 특수한 화학적 특성으로 인해 SP와 비 SP 세포 사이의 분리는 일반적으로 &#39;적색&#39;형광 채널 19 에서 더 높습니다. </li></ol></li><li> 금지 컨트롤을로드하고 데이터를 획득하십시오. SP 세포는 이제 사라 졌거나 실질적으로 감소되었습니다 ( 그림 1F ). 필요한 경우이 데이터를 기반으로 SP 게이트를 수정하십시오. </li><li> SP 세포에 의한 표면 마커 발현을 조사하기 위해, x 축 상에 DCV의 &#39;적색&#39;형광을 남겨두고 대수 모드 ( 예 : APC)에서 y 축 상에 각각의 형광 채널을 표시한다. 대응 검출기 전압을 조정하고 연구 마커 (들) ( 그림 1G )에 대한 긍정적 인 얼룩이 SP 세포의 분율을 게이트. SP 세포에 의한 특정 마커의 동시 발현은 플롯 30 의 좌측 상부 사분면에서 각각의 신호를 산출한다. </li><li> 기록데이터를 수집 및 / 또는 정렬 할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 선언 할 이해 관계가 없습니다. 원고 작성에는 비 저자가 개입하지 않습니다.

암의 임상 관리의 진행은 또한 CSCs를 타깃으로하는 치료 양식 개발에 달려있다. 생물학적 시료로부터 CSCs의 신뢰성있는 분리를 가능하게하는 방법은 적합한 표적의 동정을 가속화 할 것이므로이 노력에서 매우 중요합니다. SP 분석은 ABC 약물 전달체를 발현하는 CSC 집단을 확인하기위한 확립되고 가치있는 기술이며 DCV의 구현은 표준 유동 세포 계측 도구에 대한 적용 가능성을 확장 시켰습니다. ?...

1 차 암 치료법의 효능은 질병의 유전 및 분자 이해의 진보와 치료 용 항체 및 소분자 억제제와 같은 표적 약물의 출현으로 인해 지난 10 년 동안 상당히 향상되었습니다. 대조적으로, 전이성 및 재발 성 질환은 여전히 ​​치료가 불가능하고, 이환률 및 사망률은이 임상 환경에서 여전히 높습니다. CSCs는 종양 내의 분명한 하위 집단을 대표하고 clonogenicity / tumorigenicity, 다중 약물 저항 및 비대칭 세포 분열과 같은 표준 줄기 세포 특성을 부여받습니다. 따라서 CSC는 전이성 진행과 종양 이질성을 촉진 할뿐만 아니라 환자가 재발하는 경향이있는 치료 중에도 지속됩니다. 그러므로 치료 CSC 제거는 질병 재발을 예방하고 암의 장기 치료를 가능하게하는 중요한 의학적 필요성이다. </sup&gt;. 취약성 식별 및 CSC 퇴치 전략의 설명은 후속 발현 프로파일 작성 및 / 또는 기능 조사를 위해 생물학적 샘플로부터 정제 할 수있는 방법에 크게 의존합니다. 차례로, 그러한 방법은 이들 세포에 특이적인 표면, 세포 내 또는 기능성 마커에 의존한다. CSC 특이적인 표면 마커는 CD44, CD133, CD24 및 CD90을 포함하지만 이에 국한되지 않고 유방암 및 대장 암을 포함한 다양한 종양 개체에서 CSC 개체군을 확인하는 데 사용되었습니다. 또 다른 마커, 알데히드 탈수소 효소 (ALDH)는 세포 내 국소화를 보여 주며 효소 전환이 빛을 생성하는 각각의 기질을 제공하여 기능적으로 검출 될 수 있습니다. 이 검사를 사용하여 CSC 집단은 다양한 종양 개체에서도 확인되었습니다. 일반적으로 SP 분석이라고도하며 여기에서 묘사 된 보완적인 방법<html> ethodological 세부 정보, 형광 염료 줄기 같은 세포의 작은 인구를 식별하는 ABC 약물 전송에 의한 활성 염료 유출을 활용 6 , 7 , 8 . 이를 위해, 주어진 샘플을 수동 확산을 통해 모든 세포로 들어가는 친 지질 성 DNA 결합 형광 단의 존재 하에서 배양하고, 결합을 위해 핵 및 미토콘드리아 DNA를 표적으로한다. ABC 약물 전달체 발현이없는 비 -CSCs는 형광을 감소시키는 염료를 축적하는 반면, CSC는 형광을 감소시키는 염료를 능동적으로 압출한다. 약물 전달체 활성의 약리학 적 억제는 SP 표현형을 폐기하고 기능적으로 확인하며 대조 목적으로 사용해야한다. SP 특성을 나타내는 CSC 개체군이 난소 암 9 , 10 , 전립선 암 11 ,&gt; 12, 유방암 13 , 폐암 14 , 자궁 내막 암 15 , 신경아 교종 16 , 17 및 뼈 육종 18 . 중요한 물질은 비록 특정 종양 세포 판별 전략 (특정 숙주 세포 집단이 SP 특성을 나타낼 수 있음)과 같은 추가적인 문제를 제기하지만, SP 분석은 암 세포주와 원발 종양 조직 모두와 양립 할 수 있습니다 19 , 20 . 두 가지 가장 확립 된 SP- 부여 약물 전달체는 ABCB1 / P- 당단백 / MDR1 / CD243 및 ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8,9,21; 그러나 다른 약물 전달체도 SP 표현형 ( 예 : ABCB5)의 분자 결정 인자 일 수 있습니다 22 . ABCB1ABCG2의 활성이 fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 로 특이 적으로 제거 될 수있는 반면, 베라파밀로 효과적으로 차단 될 수있다. SP 분석의 특별한 강점은 다른 염색 ( 예 : 표면 마커 및 ALDH)과 결합 할 수 있으며 살아있는 세포 복구가 가능하므로 하위 기능 조사와 호환된다는 것입니다. 더욱이, SP 검출은 CSC 집단 중 ABC 약물 전달체의 높은 보존으로 인해 광범위하게 적용 가능하다. 원래 SP 검출은 Hoechst 33342를 유발 염료로 사용하여 수행되었습니다 24 . 이 염료는 우수한 해상도를 달성하지만 자외선 레이저 여기가 필요합니다. 따라서 그 적용 성은 하이 엔드 유동 세포 계측기에 자연적으로 제한됩니다. DyeCycle Violet (DCV) 25 의 도래는 새로운 Avenu(자외선 레이저 소스가 DCV-SP 세포를 분해하기에 충분 함)가 부족한 표준 유동 세포 계측기구에이 방법의 적용 가능성을 확장시켰다. 중요하게도 Hoechst 33342와 DCV는 일반적인 펌프 특이성을 공유하므로 두 염료 모두 동일한 세포 집단을 식별해야합니다. 여기서는 DCV 기반 SP 분석에 대한 자세한 실험 프로토콜을 제공하여 독립적 인 실험실에서 쉽고 빠르게 재생산 할 수 있습니다. 따라서 우리는이 유용한 세포 생물학적 방법의 최적화 및 표준화에 기여해야하는 CSC 연구원을위한 자료로 우리의 논문을 인식합니다.

<table><tbody><tr><td>Vybrant DyeCycle Violet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V35003</td><td>Ready to use</td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>Dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>Fumitremorgin C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9054</td><td>Dissolve in DMSO</td></tr><tr><td>7-AAD (or propidium iodide - PI)</td><td>BioLegend</td><td>420403</td><td>Ready to use</td></tr><tr><td>Standard cell culture reagents (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td>Different suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sample/cells of interest (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue)</td><td>Different suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter)</td><td>Different suppliers</td><td></td><td>Violet laser source required</td></tr><tr><td>FACS tubes (round-bottom)</td><td>Different suppliers</td><td></td><td>Tubes with cap recommended</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cut-off strainers</td><td>Different suppliers</td><td></td><td>Optional but recommended</td></tr><tr><td>Digestion enzyme mix (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, collagenase/dispase/Dnase)</td><td>Different suppliers</td><td></td><td>Only relevant for tissue dissociation</td></tr><tr><td>Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest</td><td>Different suppliers</td><td></td><td>Optional</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>01700</td><td>Optional</td></tr></tbody></table>

harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples

암은 줄기 세포 중심 질병이며이 세포의 박멸이 주요 치료 목표가되었습니다. Cancer Stem Cells (CSCs)의 취약성을 해독하고 적절한 분자 표적을 확인하는 것은 세포주 및 생체 외 종양 조직과 같은 이종 시료에서 특유한 차별을 허용하는 방법에 의존합니다. 유동 세포 계측법 / FACS는 단일 세포 수준에서 생물학적 시료를 다중 매개 변수 분석하는 강력한 기술이며 하류 분석을 위해 살아있는 세포를 회수 할 수있는 최신 방법입니다. 알데하이드 탈수소 효소 효소 활성의 검출뿐만 아니라 CD44 및 CD133과 같은 표면 마커는 종종 FACS에 의한 종양 샘플로부터의 CSC를 정의하고 분류하는데 사용되어왔다. 방법 론적 세부 사항에서 여기에 묘사 된 보완적인 접근법은 ABC 약물 전달체에 의한 기능성 염료 압출을 사용하며, 이는 측면 집단 (SP)으로 일반적으로 불리는 형광성 세포의 개별 집단을 확인합니다. SP암세포는 표준 줄기 세포 특징을 나타내고, 염료 압출 약물 전달체 (가장 빈번하게 ABCB1 / P- 당단백 / MDR1 / CD243 및 ABCG2 / Bcrp1 / CD338)를 억제하는 제제를 사용하여 폐색되고 기능적으로 확인 될 수있다. 또한 SP 분석법은 표면 항원 염색, 알데하이드 탈수소 효소 검출 및 사상 세포 판별 ( 예 : 7-AAD 또는 propidium iodide (PI))과 같은 다른 유동 세포 계측법 평가와 호환됩니다. 따라서 우리는 표현형 매개 변수가 아닌 기능적으로 기계적으로 CSC 식별, 격리 및 하위 특성화를위한 가치 있고 광범위하게 적용 가능한 방법을 설명합니다. 원래 Hoechst 33342를 트리거링 염료로 사용해 왔지만 여기에서는 보라색 레이저 소스가 장착 된 모든 유동 세포 계측기에서 분해 할 수있는보다 최근의 Violet 염료 기반 SP 표현형에 초점을 맞 춥니 다.

A2780 세포의 대표적인 SP 분석은 이전에 세포의 1 % 미만을 차지하는 SP를 보유하고있는 것으로 보이는 인간 난소 암 세포주 9) . 세포를 10 % ( v / v ) FBS, 2 mM L- 글루타민 및 1x 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 RPMI 1640에서 37 ℃에서 배양하고, 0.05 % 트립신 -EDTA로 처리하여 85 % 컨 플루 언시에서 수확 하였다. 세포를 PBS로 세척하고 70 μm cut-off strainer...

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Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

생물학적 시료에서 줄기 세포 집단의 특성 분석 및 분리를 허용하는 방법은 암 및 그 이상에서 줄기 세포 표적 처리의 발전에 중요합니다. 여기에서 우리는 염료에 의해 유발 된 부작용 표현형을 사용하는 암 줄기 세포 분리를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

DNA 염료에 의한 측면 집단 표현형을 활용하여 생물학적 샘플에서 암 줄기 세포를 검출하고 정제

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.6K 조회수.  Kantonsspital St. Gallen.  생물학적 시료에서 줄기 세포 집단의 특성 분석 및 분리를 허용하는 방법은 암 및 그 이상에서 줄기 세포 표적 처리의 발전에 중요합니다. 여기에서 우리는 염료에 의해 유발 된 부작용 표현형을 사용하는 암 줄기 세포 분리를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 

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Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

연구

암 연구학

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

부인과 및 유방암 종양에서 암 줄기 세포 구체 획득

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great significance for tumor research. Currently, several techniques are used for the identification and purification of CSCs from tumor tissues and tumor cell lines. Separation and analysis of side population (SP) cells are two of the commonly used methods. The methods rely on the ability of CSCs to rapidly expel fluorescent dyes, such as Hoechst 33342. The efflux of the dye is associated with the ATP-binding cassette (ABC) transporters and can be inhibited by ABC transporter inhibitors. Methods for staining cultured tumor cells with Hoechst 33342 and analyzing the proportion of their SP cells by flow cytometry are described. This assay is convenient, fast, and cost-effective. Data generated in this assay can contribute to a better understanding of the effect of genes or other extracellular and intracellular signals on the stemness properties of tumor cells.

A convenient, fast, and cost-effective method to measure the proportion of side population cells in solid tumor cell lines is presented.

고형 종양 세포주에서 측면 인구의 분석

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

의학

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

간편한 Side Population Cell 검출을 위한 대체 Laser Excitation 방법

Effective Detection of Hoechst Side Population Cells by Flow Cytometry

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized for the isolation of stem cells based on the dye efflux properties of ATP-binding cassette (ABC) transporters. The method was initially employed for the identification and isolation of hematopoietic stem cells (HSCs), but it has now evolved to primarily focus on the identification and isolation of cancer stem cells (CSCs). The traditional detection method of FCM uses a 355 nm laser to excite the dye to detect SP cells. Through this study, we have successfully identified alternative approaches for dye excitation that can effectively replace the detection of SP cells using a 355 nm laser. This is achieved through the utilization of high-power 375 nm or 405 nm lasers. This allows us to exercise enhanced selectivity in the detection of SP cells rather than being solely limited to the 355 nm laser flow cytometry.

저자 스포트라이트: 측면 집단 세포를 분석하기 위한 Hoechst 염색을 위한 혁신적인 레이저 기술

Here, we show that high-power 375 nm and 405 nm lasers can effectively excite Hoechst 33342 and serve as a viable alternative to the 355 nm laser for side population (SP) cell detection, thereby expanding the range of available lasers in flow cytometry applications.

유세포분석을 통한 Hoechst side population cells의 효과적인 검출

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to efflux the DNA-binding dye Hoechst 33342. This "side population" of cells can be identified using flow cytometric methods after the Hoechst 33342 dye is excited by an ultraviolet (UV) laser. The side population of many cell types contains stem- or progenitor-like cells. However, not all cell types have an identifiable side population. Danio rerio, zebrafish, have a robust in vivo model of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), but whether these zebrafish T-ALLs have a side population is unknown. The method described here outlines how to isolate the side population cells in zebrafish T-ALL. To begin, the T-ALL in zebrafish is generated via the microinjection of tol2 plasmids into one-cell stage embryos. Once the tumors have grown to a stage at which they expand into more than half of the animal's body, the T-ALL cells can be harvested. The cells are then stained with Hoechst 33342 and examined by flow cytometry for side population cells. This method has broad applications in zebrafish T-ALL research. While there are no known cell surface markers in zebrafish that confirm whether these side population cells are cancer stem cell-like, in vivo functional transplantation assays are possible. Furthermore, single-cell transcriptomics could be applied to identify the genetic features of these side population cells.

Here, we describe a technique to isolate the side population cells from a zebrafish model of myc-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). This side population assay is highly sensitive and is described for zebrafish T-ALL, but it may be applicable to other malignant and non-malignant zebrafish cell types.

측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

DNA 염료에 의한 측면 집단 표현형을 활용하여 생물학적 샘플에서 암 줄기 세포를 검출하고 정제

요약

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암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

부인과 및 유방암 종양에서 암 줄기 세포 구체 획득

고형 종양 세포주에서 측면 인구의 분석

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

유세포분석을 통한 Hoechst side population cells의 효과적인 검출

유세포분석을 통한 Hoechst side population cells의 효과적인 검출

유세포분석을 통한 Hoechst side population cells의 효과적인 검출

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬