이 연구는 시카고 대학 여성위원회 (University Board of Chicago Women Board), 웬디 윌 사건 기금 (Wendy Will Case Fund), 시카고 대학 종합 암 센터 지원 교부금 (P30 CA014599)에 의해 지원되었습니다. 이 실험을 설정하는 데 도움을 주신 시카고 대학교의 Flow Cytometry Core와 de Zhong 연구실의 다른 회원, 특히 Leslie Pedraza 및 Sean McConnell에게 감사드립니다.

제브라 피쉬의 모든 절차는 시카고 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 시카고 대학은 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 인증을 받았으며. Zebrafish의 1. 생성 및 분리 찬란 레이블이 T-ALL 세포 <ol><li> 동계 제브라 피쉬 배아에 미세 주입 <ol><li> 녹색 형광 단백질 (rag2 : GFP) C-myc 유전자 및 rag2 : 시판되는 키트를 사용하여, 원형 rag2 격리 TOL2의 트랜스 (플라스미드 DNA의 소스 재료의 도표 참조) (12)에 의해 인식 된 역전 된 말단 반복 부를 포함하는 플라스미드 DNA를 상기 DNA를 용출 멸균한다. 참고 : GFP는이 연구에서 사용되지만, 어떤 형광 단백질이 작동합니다. </li><li> PCS2 - 트랜스 준비 (TOL2) RNA <ol><li> t 참조 (시판 키트를 사용하여 TOL2 플라스미드 DNA를 분리플라스미드 DNA의 소스 재료의 그 테이블) (12) 및 멸균의 DNA를 용출시킨다. </li><li> 플라스미드를 선형화하는 적절한 버퍼를 NotI 제한 효소 5 개 유닛으로 1 시간 동안 37 ° C에서 TOL2의 DNA 1 μg의 부화. 20 분 동안 65 ° C에서을 NotI을 열 - 불 활성화. </li><li> 시판 RNA 전사 세트 (13)를 사용하는 선형화 된 DNA로부터의 SP6 RNA 폴리머 라제와 RNA를 TOL2의 전사. -80 ° C에서 단일 사용 씩의 RNA를 저장합니다. </li></ol></li><li> C-myc의 플라스미드 DNA, 250 ng의 rag2 : GFP 플라스미드 DNA, RNA의 TOL2 150 NG 및 페놀 레드 0.5 μL rag2 250 NG를 첨가하여 얼음에 주입 혼합을 준비한다. 핵산 분해 효소가없는 물 10 μL에 볼륨을 조절합니다. </li><li> 이전 맛 음료 다음, 유리 모세관으로부터 뽑아 마이크로 인젝터와 바늘을 이용하여 단일 세포 단계 동계 지브라 피쉬의 배아 세포에 주입 혼합 ~ 1 거리 nL 주입lished 방법 8, 14. 참고 : 처녀 생식 (15)에 의해 생성 된 동계 제브라 피쉬는 이식 후 유전 적 이질성과 면역 거부 반응을 제거하기 위해 여기에 사용됩니다. 그러나, 야생형 제브라 또는 임의의 변형이 사용될 수있다. </li><li> 24 시간 및 48 시간 후 주사 16 죽은 낙후 또는 잘못된 배아를 제거한다. </li><li> 주입 후 6 일째에 물고기 시스템에 주입 된 물고기를 놓고 표준 프로토콜 6 항 키우기. </li></ol></li><li> 주입 지브라 피쉬 검사 및 종양 성장을 모니터링 <ol><li> 8 이십일일 후 분사에서 epifluorescent 현미경 (: 40분의 470, 발광 대역 50분의 525 여기 대역)을 이용하여 GFP 형광을위한 배양 접시와 화면 배아 매체의 액적 단일 주입 유충 놓는다. 참고 : 시간 Zebrafish의 유충ave는 rag2 : c-myc와 rag2 : GFP를 모두 통합하여 녹색 형광성 흉선 (양성 어류)을 가지며 이미 흉선을 넘어 악성 녹색 형광 세포의 확장을 나타낼 수 있습니다. GFP + 흉선이있는 모든 물고기는 GFP + T-ALL을 개발합니다. 플라스미드의 통합을 입증하지 않는 유충은 녹색 형광 세포 (음성 생선)를 갖지 않을 것이다. </li><li> 다른 탱크에 (형광 부족에 따라) 부정적인 물고기를 분리하고 사후 28 일 및 35 일에 다시 물고기를 모니터하십시오. 주사 후 28 일 및 35 일에, 선별 전 물고기 시스템 물에서 0.02 % 완충 된 트리 세인 (MS-222)으로 물고기를 마취시킨다. </li><li> 일주일에 세 번씩 종양 성장을 모니터링하기 위해 형광성으로 분류 된 흉선 또는 형광성 종양에 양성인 각 제브라 피쉬 애벌레를 개별 탱크에 놓습니다. </li></ol></li><li> 일차 종양 어류에서 형광 표지 된 T-ALL 세포의 수집 <ol><li> 적어도 0.9 20 ㎖의 인산염 완충 식염수 (FBS / PBS)에서 10 %의 열 - 불 활성화 된 우 태아 혈청으로 준비한다. </li><li> 헤파린 나트륨의 한 바이알 (300 개)에 FBS / PBS 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 선택 물고기 몸의 50 % 이상에서 종양 베어링, 또는 그 물고기는 어려움 먹고 수영을 가지고. tricaine 또는 얼음물에 담가을 했나봐하여 물고기를 희생. 아가미의 움직임과 심장 박동의 부족 (a)에 의해 죽음을 확인합니다. </li><li> 물고기의 머리를 제거하기 위해 면도날을 사용합니다. </li><li> 과도한 적혈구를 제거하기 위해 헤파린 용액과 물고기의 구멍을 씻으십시오. <ol><li> 피펫을 사용하여, 물고기의 체강 내에 헤파린 용액 (단계 1.3.2에서 제조) 100 μL를 주입. 밖으로 유출 모든 액체를 제거합니다 (그것은 혈액 세포를 포함) 및 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 피펫. </li><li> 다시 몸을 씻어 신선한 피펫 팁을 사용합니다. 적어도 세 세척을 수행하거나 밖으로 유출 액체는 BL의 무료 나타날 때까지짐 우드. </li><li> 이를 추가 분석에 사용되지 않으므로, 단계 1.3.5.1 및 1.3.5.2에 세척 모든 액체 폐기. </li></ol></li><li> 백혈병 세포를 수집합니다. <ol><li> 물고기의 체강 내에 FBS / PBS 100 ㎕를 주입한다. </li><li> 종양 세포를 밀어 / 짜내 피펫 팁과 물고기의 몸의 외부에 부드러운 압력을 적용합니다. 주 :이 단계는 해부 현미경을 사용하여 수행되는 경우 체강 흘리 종양 세포가 명백 할 것이다. </li><li> 각 액상 세포 수집은 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 세척 하였다. </li><li> 단계를 반복 1.3.6.1-1.3.6.3 종양 세포의 대부분은 (일반적으로 5 ~ 10 회)를 수집 할 때까지. 동일한 1.5mL 용량의 마이크로 원심 튜브에 모든 종양 세포를 수집한다. 실온에서 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 세포 덩어리 해리하도록하여 피펫 팅 단계 1.3.6에서 수집 된 종양 세포를 섞는다. 4 통해 세포 현탁액을 필터0 ㎛의 메쉬 필터. FBS / PBS 100 μL와 필터 1-2 회 반복한다. 실온에서 세포를 유지합니다. </li><li> 새로운 튜브에 트리 판 블루 18 μL (0.4 %로 1:10으로 희석하고 여과)하여 세포 현탁액 2 μL를 섞는다. 로드 혈구 10 μL와 격리 된 종양 세포의 수를 계산하는 라이브 (비 블루) 형광 세포의 수를 계산합니다. 참고 : 비 블루 GFP - 부정적인 세포가 가능성이 정상이 아닌 악성 T 세포이며, 계산되어서는 안된다. 적어도 2 × 106 세포 훽스트 33342로 세포를 염색하기 위해 요구된다. </li></ol></li></ol> 훽스트 (Hoechst) 33342 2. 염색 찬란 레이블이 T-ALL 세포는 사이드 인구를 식별하는 <ol><li> 1 ㎎ / ㎖의 농도를 작동하도록 클레아없는 H 2 O로 훽스트 33342 1:10 희석. 4 ℃에서 어둠에서 염료를 저장한다. </li><li> 디메틸 설폭 사이드 1 ㎖ (DMSO) 49.1 mg을 용해시켜 베라파밀의 100 mm의 용액을 제조 하였다. 참고 : 베라파밀은 ABC 트랜스 포터의 억제제 및 측면 인구 실험을위한 중요한 컨트롤입니다. 샘플 베라파밀를 추가하면 훽스트 33342 염색을 유출하는 ABC 수송의 기능을 억제한다. 베라파밀이 샘플에 추가 될 때 따라서, 진정한 측면 인구는 사라집니다. </li><li> 28 ° C에 수욕을 설정합니다. </li><li> 형광 활성화 된 세포 분류기 (FACS) 튜브 셀 솔루션을 추가하여 어두운 곳에서 샘플 및 제어를 준비한다. <ol><li> 106 개 세포를 1 ㎎을 15 μL / ML 호엑스트 33342 및 FACS 튜브 DMSO 2.5 μL를 첨가하여 샘플을 준비한다. FBS / PBS에 1 mL의 양을 조정한다. </li><li> FACS 튜브 베라파밀 106 셀, 1 ㎎을 15 μL / ML 호엑스트 33342, 100 mM의 2.5 μL를 추가하여 제어를 준비한다. FBS / PBS에 1 mL의 양을 조정한다. 참고 : 10 개 6 세포의 최소 / 샘플 권장되지만 더 세포를 염색 특히 측면의 populat 경우 바람직이온 전지는 추가 분석을 위해 정렬된다. 106 개 세포 / ㎖를 초과하고, 15 ㎍ / ㎖의에 훽스트 33342 농도를 유지하지 않는다. 10 × 106 세포를 염색하는 경우, 총 반응 부피 10 ㎖이다. </li></ol></li><li> 120 분 동안 어둠 속에서 28 ° C의 수조에서 인큐베이션. </li><li> 배양 후, 얼음에 즉시 세포를 배치하고 어두운에 보관하십시오. </li><li> 300 × g으로 6 분 동안 4 ℃에서 세포를 펠렛. 상층 액을 제거합니다. FBS / PBS 1 ml로 세척 하였다. </li><li> 300 × g으로 6 분 동안 4 ℃에서 세포를 펠렛. 상층 액을 제거합니다. FBS / PBS 1 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> 세포 정렬 될 때까지 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 정렬 셀 FBS / PBS 각각 1 mL의 요오드화 프로피 듐 (PI) 재고 2 μL (1 ㎎ / ㎖)을 첨가하기 전에 15 분 (최종 농도 2 ㎍ / ㎖). 잘 섞다. </li></ol> 3. FACS 찬란 레이블이 T-ALL 세포 인구 내에서 사이드 인구를 찾기 <ol><li&gt; Hoechst 33342 염료 여기를위한 UV 레이저와 PI 자극 및 GFP + T-ALL 세포의 검출을위한 488 nm 레이저가 장착 된 셀 분류기에서 얼룩진 제브라 피쉬 T-ALL 세포 현탁액을 분석하십시오. </li><li> 살아있는 GFP + T-ALL 세포의 게이트를 결정하십시오. <ol><li> 파편을 게이트 아웃하려면 FSC (forward scatter) 및 SSC (side scatter) 영역을 사용하십시오. 참고 : FSC는 셀 크기를 구별하는 데 사용되고 SSC는 셀의 세분성을 구별하는 데 사용됩니다. </li><li> 이중 선별을 위해 FSC와 SSC 너비를 사용하십시오. 참고 : 유동 세포 계측기 감지기로 식별되는 세 가지 구성 요소가 있습니다 : 면적, 높이 및 너비. 면적은 일반적으로 세포의 형광을 측정하는 데 사용됩니다. 너비는 비행 시간을 측정하며 두 개의 세포가 함께 뭉치면 두 배가됩니다. </li><li> 살아있는 종양 세포의 경우 적절한 검출기 ( 예 : GFP의 경우 FITC, PI의 경우 PerCP Cy5-5)를 사용하여 GFP가 양성이고 PI가 음성 인 세포 주위에 게이트를 그립니다. </li></ol></li><li&gt; 생균 게이트 (각각 50분의 450 및 30분의 670 등) 훽스트 블루 및 레드 훽스트 대역 통과 필터를 통해 훽스트 33342 형광을 측정한다. 참고 :이 설정 한 후 측면 인구가 존재한다면, 분명있을 것입니다. 그것이 진정한 측면 인구 고려되어야 할 중요한 측면 인구는 순서대로 베라파밀 제어 사라해야합니다. </li><li> 상기 실험 측부 세포 집단을 분류하면, 큰 노즐 팁 (100 μm의)을 사용하여 100 % FBS의 3 ㎖을 함유하는 FACS 튜브에 세포를 수집한다. 정렬 후에 세포 생존을 향상시키기 위해 더 큰 노즐 팁 (100 μm의) 대신 작은 팁 (70 μm의)을 사용한다. </li></ol>

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측면 집단 분석은 매우 민감합니다. 따라서 프로토콜을 조금만 변경하면 측면 세포를 검출하는 데 어려움이 발생할 수 있습니다. 첫째, 얼룩 단계 동안 온도는 각 동물 / 세포 시스템에 특정입니다. 포유류 시스템의 경우, 측면 집단 분석은 일반적으로 37 ° C에서 수행됩니다 2 . 제브라 피쉬 T-ALL 세포가 37 ℃에서 배양되었을 때, 많은 세포가 죽어서이 배양 온도를 용납 할 수 없게...

측면 집단 분석은 세포막상의 ATP 결합 카세트 (ABC) 전달체 단백질의 높은 수치로 인해 DNA 결합 염료 Hoechst 33342를 유출시키는 조직 내 특정 세포의 증진 된 능력을 이용합니다. Hoechst 33342 염료를 유출하는 세포는 염료가 UV 레이저로 여기 된 후 이중 파장 유동 세포 계측법 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 이 분석법은 처음에 마우스 조혈 줄기 세포 (HSC) 1 을 확인하는 데 사용되었지만 이후 많은 조직과 암에서 줄기 / 전구 세포 집단을 확인하는 데 사용되었습니다 (참고 문헌 2 참조). 그러나 모든 세포 집단이 부수적 인 집단을 가지고있는 것은 아니며, 모든 부 모집단이 줄기 / 전구 세포를 위해 풍부하지는 않습니다. 제브라 피쉬는 인간의 암을 연구하기위한 강력한 척추 동물 모델 시스템입니다. 3 , 4 , 전통적인 murine암의 델. Zebrafish의 배아는 외부 형질 전환 및 암 개시 및 진행을 포함한 병리학 적 과정의 생체 내 관찰을 용이하게 수정 된 광학적 분명합니다. 현재까지, 측면 인구 분석은 잠재적 인 줄기 또는 전구 세포만을 조혈 모세포를 식별하는 제브라 피쉬의 신장 골수에 적용, 그리고 어떤 제브라 피쉬 암 모델 5, 6되었습니다 감지합니다. T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)는 형태 학적으로 인간 T-ALL 7, 8, 11 유전자와 유사하다. T-ALL은, 인간의, 소아 10 ~ 15 %와 모든 경우 9 성인의 25 %를 차지하는 공격적인 악성 종양이다. T-ALL의 치료가 개선 된 반면, 재발은 여전히 ​​일반적이며 예후와 연관되어 있습니다. T-ALL 종양은 heterogene입니다조직 구성 단위 및 백혈병 개시 세포 (저소득) 등 다양한 종양 세포의 소집단가 포함되어 있습니다. 저소득 그들의 단일 세포에서 종양 전체를 자라게 할 수있는 능력, 및 종양 세포 집단 내 저소득의 주파수에 의해 정의는 제한 희석 이식 분석 (LDA)을 통해 수신자로 변화하는 셀 용량을 이식하여 계산 될 수있다. LDA 실험은 저소득 8, 10, 11의 주파수를 계산하기 위해 제브라 수행 하였지만, 이러한 판정은 제 지나고되고 저소득의 잠재적 분리를 허용하지 않는다. 따라서, 방법은 전향 적으로 암 줄기 세포의 활동에 대한 풍부한 인구가 부족한 분리합니다. 식별 및 지브라 피쉬 T-ALLS 측으로부터 세포 집단을 분리하는 것은 이러한 결함을 해결하기위한 첫 단계이다. 여기에 제시된 프로토콜은 효율적으로 zebr에서 T-ALL 종양을 생성하는 방법에 대해 설명합니다(tol2-mediated transgenesis)를 이용하여 T-ALL 종양 세포를 수확하고 Hoechst 33342로 염색하여 세포의 부작용을 확인한다. 제브라 피쉬 T-ALL 에 대한 미래 의 생체 내 실험 은 측면 세포가 LIC를 강화 시키거나 다른 줄기 - 또는 전구체 - 유사 성질을 갖는지 여부를 포함 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Syngeneic zebrafish (CG2)</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">See Mizgireuv et al., 2006</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">rag2:c-myc plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">rag2 promoter from Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">pCS2-transposase plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Chien Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">NotI -HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:199px;">New England Bio-Labs Inc.</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>500 units in 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">mMessage Machine SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:199px;">Ambion</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific - AM1340</td>
			<td>25 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">QIAGEN Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:199px;">Qiagen, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">12643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">SteREO Discovery V8 Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>495015-0008-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Digital microinjector</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Brass straight-arm needle holder</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Magnetic base and stand</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-HBMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:199px;">Narishige International</td>
			<td style="width:208px;">MN153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">B100-50-10</td>
			<td>10 cm without filament</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:199px;">Eppendorf North America Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phenol Red solution</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">P0290</td>
			<td>0.5% concentration 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Plastic Transfer pipettes</td>
			<td style="width:199px;">Fisherbrand</td>
			<td>137119D</td>
			<td>graduated 7.5 mL bulb</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:199px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - NC0342409</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">HyClone Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - SH3007103</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">1001-023</td>
			<td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:208px;">2106</td>
			<td>15 - 300 unit vials</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">40 um mesh filter</td>
			<td style="width:199px;">Falcon Corning Brand</td>
			<td style="width:208px;">352340</td>
			<td>Case of 50</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">T8154</td>
			<td>20 mL - Solution (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">H3570</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Verapamil</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">V4629</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">D8418</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">P3566</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">BD FACSDiva 8.0.1</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">FlowJo v10.2</td>
			<td style="width:199px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of the side population in myc-induced t-cell acute lymphoblastic leukemia in zebrafish

건강 악성 조직 중 어느 하나에서 이종 세포 집단은 상기 DNA 결합 염료 훽스트 33342. 셀이 &quot;측면 인구&quot;유출하는 차동 기능을 특징으로 세포 집단을 포함 할 수있다 훽스트 33342 후 유세포 방법을 이용하여 식별 될 수있다 염료는 자외선 (UV) 레이저에 의해 여기된다. 많은 세포 유형의 측면 인구는 stem- 또는 전구와 같은 세포가 포함되어 있습니다. 그러나 모든 종류의 세포는 식별 측면 인구가 있습니다. 다니오의 레 리오 (rerio), 제브라 피쉬는 T 세포 급성 림프 구성 백혈병 (T-ALL)의 생체 내 모델의 강력한을 가지고 있지만 이러한 제브라 피쉬 T-ALLS가 있는지 여부 측면 인구는 알 수 없습니다. 여기에 설명 된 방법은 제브라 피쉬 T-ALL의 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 우선, 제브라 피쉬의 T-ALL은 하나의 세포 단계의 배아로 TOL2 플라스미드의 미세 주입을 통해 생성됩니다. 종양 무대로 성장했으면하는 그들은 항문의 절반 이상으로 확장T-ALL 세포를 수확 할 수 있습니다. 그 다음, 세포를 Hoechst 33342로 염색하고 측면 세포에 대한 유동 세포 계측법으로 검사한다. 이 방법은 zebrafish T-ALL 연구에 광범위한 응용이 있습니다. 제브라 피쉬에는 이러한 측면 세포가 암 줄기 세포와 유사한지를 확인하는 알려진 세포 표면 마커는 없지만 생체 내 기능 이식 분석이 가능합니다. 또한, 단일 세포 transcriptomics이 측면 인구 세포의 유전 특징을 식별하는 데 적용 할 수 있습니다.

효율적 제브라 형광 myc의 유도 된 T-ALL 종양을 생성하기 위해 트랜스 TOL2의 사이트에 의해 측면 원형 DNA 구조체는 TOL2의 RNA와 공동으로 주입 될 수있다. 제브라 피쉬의 수정란으로 선형화 된 DNA의 주입 이전 연구에서 5 %의 형질 전환 레이트 8보고한다. 프로토콜 TOL2 - 매개 형질 전환 등을 조정하여, 10-44 %의 범위의 형질 전환 비율 (표 1)를 관찰...

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Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

여기서는 myc의 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)에서 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 이 쪽 인구 분석은 매우 민감하고 제브라 피쉬 T-ALL에 대해 설명하지만, 다른 악성 및 비 악성 제브라 피쉬의 세포 유형에 적용 할 수있다.

측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

isolation-side-population-myc-induced-t-cell-acute-lymphoblastic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K 조회수.  The University of Chicago.  여기서는 myc의 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)에서 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 이 쪽 인구 분석은 매우 민감하고 제브라 피쉬 T-ALL에 대해 설명하지만, 다른 악성 및 비 악성 제브라 피쉬의 세포 유형에 적용 할 수있다. 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em&gt; 생체 내</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.