우리는 이바노프 (Ivanov)와 앤더슨 (Anderson) 연구소의 회원들에게 도움이되는 토론과이 원고에 대한 피드백에 감사드립니다. 이 연구는 폴란드의 국립 과학 센터 [UMO-2012 / 06 / M / NZ3 / 00054]를 국립 보건원 (PA)의 GM111700과 CA168872, NSO94918의 PI에게 지원했다. WS는 또한 폴란드에서 과학 및 고등 교육부 (Mobility Plus Program)와 폴란드 - 미국 풀 브라이트 (Fulbright)위원회가 미국에서 자신의 연구를 재정 지원 한 사실을 인정합니다.

1. 세포 준비 <ol><li> 그림 1A 에 표시된 대로, 24 웰 플레이트의 12 우물에 autoclaved coverslips을 추가; 이것은 각 coverslip을 데리러 진공에 첨부 된 살균 파스퇴르 피펫을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 부드럽게 우물의 측면에 coverslip을 눌러서 coverslip가 우물에 떨어질 수 있도록 흡입을 해제하십시오. </li><li> 플레이트 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteoscomcoma 세포를 최종 용적 500 μL의 배양액에 넣습니다. 플레이트의 측면을 위아래로 여러 번 움직여 셀이 고르게 분포되도록합니다. </li><li> 부드럽게 coverslip 깨끗한 P1000 팁 coverslip가 우물의 바닥에 있는지 확인하고 coverslip 아래에 거품이 있는지 확인하십시오. </li></ol> 2. 스트레스 셀 <ol><li> 다음날, 시각적으로 세포가 균등하게 흩어져 있는지 확인하고 커버 슬립을 가로 질러 균등하게 합쳐져 있는지 확인하십시오.mples은 결과의 재현성에 악영향을 줄 수 있습니다. 거꾸로 조직 문화 현미경에 10X 목적을 사용하십시오. </li><li> 37 ° C로 매체를 예열하십시오. 차가운 충격이나 열 충격을 일으킬 수 있으므로 찬물 또는 뜨거운 종이를 셀에 가하지 마십시오. </li><li> 예열 된 약물에서 약물을 희석하십시오. 각각의 다른 약물 농도에 대해 500 μL의 배지가 포함 된 2 개의 웰을 준비하십시오. pipetting 동안 손실을 허용하기 위해 추가 500 μL를 준비하십시오. 나누어지는 4 개의 튜브, 각각 1.5 mL가 들어 있습니다. <ol><li> 아비 산 나트륨 : 500 μL를 함유하는 각 웰에 100 mM 아비산 나트륨 (최종 농도 : 100 μM) 1.5 μL를 첨가하거나 100 mM 아질산 나트륨 (최종 농도 : 50 μM) 0.75 μL를 첨가한다. </li><li> vinorelbine의 경우 : 500 μL를 함유 한 각 웰에 10 mM vinorelbine (최종 농도 : 150 μM) 22.5 μL를 넣거나 10 mM vinorelbine (최종 농도 : 100 μM) 18.75 μL를 넣으십시오. 주 : 아질산 나트륨<html> 잘 특성화되고 일반적으로 사용되는 스트레스 과립 유도제이며 따라서 고전적으로 긍정적 인 컨트롤로 사용됩니다. </li></ol></li><li> 웰 B1 - 4와 C1 - 4에서 미디어를 제거하고 버립니다. 약물로 미디어를 추가하고 60 분 (그림 1A)를 기다립니다. <ol><li> 우물 B1과 B2에 100 μM 아질산 나트륨과 함께 매체 500 μL를 추가합니다. 우물 B3과 B4에 50 μM 아질산 나트륨과 함께 매체 500 μL를 추가합니다. </li><li> 우물 C1과 C2 150 μM vinorelbine와 매체의 500 μL를 추가합니다. 우물 C3와 C4에 125 μm의 vinorelbine과 매체 500 μL를 추가합니다. </li></ol></li><li> 고정 30 분 전에 컬럼 2의 우물을 5μL의 시클로 헥시 미드 (1 mg / mL 주식)로 처리하고 컬럼 4의 우물을 2 μL의 퓨로 마이신 (1.25 mg / mL 주식)으로 처리하십시오. 부드럽게 37 ° C 배양기에 다시 접시를 배치하기 전에 혼합 접시를 흔들어. </li></ol> 3. 세포 고정 및 Immunofluorescence 실험에 앞서 메탄올이 -20 ° C로 냉각되었는지 확인하십시오. 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), PBS (5 % 정상 말 혈청 (NHS)) 및 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA )을 PBS에 넣었다. <ol><li> 미디어를 폐기하고 PBS로 coverslips가 포함 된 우물을 씻으십시오. 사용 된 약물에 따라 마약이 들어있는 매체를 적절하게 버리는 것이 중요합니다. 자세한 지시 사항은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오. 효율적으로 씻으려면 PBS로 쥐어 짜는 병을 채우고 꽉 짜인 흐름이 아닌 부드러운 흐름이 가능하도록 팁을 잘라내고 원래 PBS를 흡입 한 후 각 웰에 PBS를 넣으십시오. </li><li> 부드러운 교반하에 RT에서 15 분 동안 4 % PFA ~ 250 μL를 사용하여 세포를 고정. 완전히 PFA로 coverslip의 상단을 커버; 250 μL로 충분해야하지만, 그렇지 않은 경우 추가하십시오. 어떤 세포 (또는 세포의 스트레스 처리)가 부착을 변경할 수 있기 때문에 항상 coverslips에 직접 피펫을 피하십시오.그는 피펫 팅에서 세포를 제거 할 수 있습니다. </li><li> PFA를 제거하고 올바르게 버립니다. 파라 포름 알데히드를 올바르게 폐기하는 방법에 대한 자세한 내용은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오. </li><li> 메탄올 (-20 ° C) ~ 250 μL를 첨가하고 부드러운 흔들림하에 실온에서 5 분 동안 품을; 이것은 세포를 투과시키고 평평하게합니다. </li><li> 제거하고 메탄올을 버리고 4 ℃에서 RT O / N에서 1 시간 동안 5 % NHS ~ 250 μL를 적용하여 세포를 차단하십시오. 메탄올을 올바르게 폐기하는 방법에 대한 자세한 내용은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오. </li><li> 일차 항체의 경우 5 % NHS에서 항체를 희석합니다. 참고 : 여러 SG 마커를 사용하면 관찰 된 알갱이가 진품 SG인지 여부를 확인할 수 있습니다. 사용할 수있는 SG 마커의 수는 현미경에서 사용할 수있는 필터에 따라 다릅니다. 표준 녹색, 적색 및 원적외선 필터 세트를 사용할 수있는 경우 1/250 희석으로 G3BP1, eIF4G 및 eIF3b를 사용하십시오. <ol><li&gt;이 실험 (각 250μL 12 coverslips - 총 : 5 % NHS 3 ML)에 다음 12 μL를 추가하십시오 : 항 -G3BP1, 항 -eIF3b 및 항 -eIF4G. 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 적어도 1 시간 동안 부드러운 교반을 사용하여 기본 항체를 품어. </li></ol></li><li> PBS로 웰을 3 회 세척하고 5 분 동안 각 세척을 배양한다. </li><li> 2 차 항체의 경우 5 % NHS에서 모든 2 차 항체 (1/250 희석)와 Hoechst 염료 (1 / 1,000 희석)를 희석하십시오. <ol><li> 이 실험 (각각 250 μL 12 coverslips - 총 : 3 % 5 % NHS)에 Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit 및 Cy5-Goat (각각 1/250 희석액)을 12 μL 씩 넣으십시오 Hoechst 염료 3 μL를 넣는다. </li><li> RT에서 1 시간 동안 이차 항체와 coverslips을 품어. 이 단계와 다음 단계 동안 상자를 사용하여 플레이트를 덮거나 조직 배양 접시 상단에 호일을 놓아 샘플을 빛으로부터 보호하십시오. </li></ol></li><li> 우리를 씻어 라.각각 5 분 동안 PBS로 3 회 주사합니다. </li><li> 마운트 매체를 사용하여 레이블이 붙은 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재하십시오. 10 분 37 ° C 열 블록에서 장착 매체를 가열; 이것은 점성을 감소시키고 피펫을 더 쉽게 만듭니다. 컷 P200 팁, 유리 슬라이드에 coverslip 당 장착 매체 25 μL 피펫; 현미경 스테이지가 이것을 허용한다고 가정 할 때 4-8 coverslips는 하나의 유리 슬라이드에 들어갈 수 있습니다. 미세 포 셉를 사용하여 슬라이드에서 well에서 coverslip을 전송, 설치 매체에 세포 측면을 넣어 있는지 확인하십시오. 깨끗한 P200 팁을 사용하여 coverslip을 누르십시오. </li><li> 모든 coverslips가 장착되면 접힌 실험실 조직을 사용하여 슬라이드에 매우 단단히 실험실 조직을 눌러 과도한 장착 매체를 청소합니다. 과도한 장착 매체를 제거하기 위해 H 2 O가 들어있는 짜낸 병을 사용하고 물을 제거하기 위해 접힌 실험실 조직으로 블로 팅을 반복하십시오. </li></ol> 4. 현장에서의 형광 &lt;/ em&gt; 하이브리드 화 (FISH) <ol><li> 단계 1과 2.1-4를 지침으로 사용하여 세포를 처리하고 처리하십시오. 다음 실험에서는 단 3 개의 커버 슬립이 필요하기 때문에 컬럼 1에 세포를 플레이트 할 필요가 있습니다. </li><li> 메탄올이 -20 ° C로 냉각되고 모든 완충액이 준비되었는지 확인하십시오 ( 예 : PBS에 4 % PFA, 물에 70 % 에탄올, 2x 염산 - 나트륨 - 시트르산 (SSC) 및 5 % NHS) 하이브리드 화 오븐은 적절한 온도까지 데워진다. </li><li> 셀을 씻어 고치려면 3.1-3.3 단계를 수행하십시오. </li><li> -20 ° C의 메탄올을 10 분간 첨가하여 세포를 침투시킨다. </li><li> 메탄올을 제거하고 70 % 에탄올로 coverslips을 품어. 접시를 4 ° C에서 밤새 두십시오. 증발을 방지하기 위해 파라 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하십시오. </li><li> 다음날, 에탄올을 제거하고 2x SSC 500 μL를 추가하여 세포를 재수 화하십시오. RT에서 부드러운 교반과 coverslips를 5 분 품어. </li><li> 2x SSC를 제거하고 500을 더하십시오.μL의 2X SSC. 온화한 교반하에 5 분 동안 품어 낸다. </li><li> 하이브리드 화 오븐의 바닥에 평행 한 파라핀을 놓습니다. 각 coverslip에 대한 parafilm에 하이브 리다이 제이션 버퍼의 피펫 25 μL. 24 - 잘 접시에서 coverslip을 제거 (이 시점에서, coverslips는 세포 측면입니다) 및 하이브 리다이 제이션 버퍼에 coverslip 셀쪽으로 내려 놓으십시오. 이것을 42 ° C에서 또는 65 ° C에서 15 분 동안 수행하십시오. 참고 : 65 ° C에서이 단계를 완료하면 세포 RNA가 변성됩니다. 이것은 polyA가 단백질과의 상호 작용에 의해 가리워지면 신호를 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 하이브 리다이 제이션 버퍼에서 2 ng / μL의 농도로 Biotin-Oligo (dT) 프로브 (100 ng / μL)를 희석하십시오. coverslip 당 25 μL 충분합니다. </li><li> 각 coverslip 들어, parafilm에 Biotin - Oligo (dT)를 포함하는 하이브 리다이 제이션 버퍼 25 μL을 피펫. 집게로 coverslip을 들고 부드럽게 초과 커버를 제거하기 위해 실험실 조직에 coverslip의 가장자리를 만지지하이브리드 화 완충액. Biotin - Oligo (dT)와 하이브 리다이 제이션 버퍼 coverslip을 전송; 셀을 아래로 향하게하십시오. </li><li> 하이브 리다이 제이션 상자에 coverslips를 넣어 증발을 제한하십시오. 42에서 하이브 리다이 제이션 버퍼에 Biotin - Oligo (dT)와 coverslips를 품어 ° C. </li><li> 하이브 리다이 제이션 오븐에 2x SSC를 놓고 42 ° C로 평형을 유지하십시오. </li><li> 따뜻하게 2x SSC의 ~ 500 μL를 24-well dish의 well에 넣고 포셉을 사용하여 coverslips를 well로 옮깁니다. 10 분 동안 품어 낸다. </li><li> 42 ° C에서 두 번 위 세척 단계를 반복 한 다음 RT에서 두 번 반복합니다. </li><li> 3.5-3.10 단계를 완료하여 streptavidin fluorochrome을 사용하여 하나의 일반 항체 대신 Biotin-Oligo (dT)를 검출하십시오. </li></ol> 5. 번역 상태를 평가하기위한 Ribopuromycylation 분석 <ol><li> 1 단계에 표시된대로 coverslips에 U2OS 세포를 플레이트하지만, 조건 당 하나의 coverslip을 플레이트 (이 있음케이스, 3 개의 커버 슬립 : 비 처리, 100 μM 아질산 나트륨, 150 μM vinorelbine) ( 그림 1A). </li><li> 2 단계에서 프로토콜을 사용하여 세포에 스트레스를 가하고 2.1-2.4 단계를 완료하십시오. </li><li> 고정 전에 5 분 puromycin (주식 : 1.25 밀리그램 / ML, 5 μg / ML의 최종 puromycin 농도를 얻기 위해 500 μL에 희석 2 μL) 2 μL를 추가하고 2.9 μL emetine (주식 : 20 μg / ML; 2.9 μL를 이미 puromycin을 함유 한 동일한 용액에) 0.5 mL를 함유하는 각 웰에 첨가 하였다. </li><li> puromycin을 탐지하기 위해 anti-puromycin 항체 (1/1000 희석액)를 사용하여 위의 지시 된대로 3.1-3.10 단계를 완료하십시오. 이상적으로 나머지 채널에는 다른 두 개의 SG 마커를 사용하십시오. </li><li> puromycin 신호를 정량화 할 때 동일한 노출을 사용하여 모든 이미지를 촬영하십시오. 가장 밝은 (응력이 가해지지 않은) 샘플을 사용하고 채도없이 가능한 한 밝은 이미지를 촬영하여이 노출을 선택하십시오. 참고 : 안티 - puromycin 형광 신호의 강도 repres아미노산을 대신하는 퓨로 마이신 (puromycin)으로 진행되는 번역은 초기 단백질에 통합되어 단백질의 조기 종료를 강제합니다. </li></ol> 6. 이미지 수집 및 분석 <ol><li> 스트레스 과립의 정량화 <ol><li> SG를 정량화하기 위해 40X 대물 렌즈를 사용하여 샘플 당 총 100 개 이상의 세포를 3 ~ 5 개의 이미지로 수집합니다. 또는 다른 목표를 사용하여 이미지를 수집하지만 100 개 이상의 셀이 커버 슬립 당 계산되고 배율이 과립을 명확하게 시각화 할 수있을만큼 커야합니다. 커버 슬립을 5 개의 대략 동일한 영역으로 나누고 각 영역에서 임의로 필드를 선택하여이를 수행하십시오 ( 그림 1B ). 동일한 필드의 이미지에는 마커의 동시 표정을 평가하는 모든 채널이 포함되어야합니다. </li><li> 모든 이미지를 가져 오면 채널을 병합하십시오. 일부 카메라 소프트웨어는 자동으로이 작업을 수행하지만 다른 작업에서는 수동 병합이 필요합니다. 이것으로 할 수있다.ImageJ를 열어 모든 이미지를 열고 [이미지 | 색상 | 병합 채널]. </li><li> Hoechst를 핵 마커로 사용하여 핵의 수를 세어 총 세포 수를 수동으로 계산합니다. 셀 당 2 개 이상의 SG를 포함하는 셀 수를 수동으로 계산하십시오. 참고 : 예를 들어 G3BP1 (녹색), eIF4G (적색) 및 Hoechst (파랑)이 표시된 병합 된 3 채널 이미지를 사용하여 파란색 채널을 사용하여 핵 (또는 셀 수)을 계산합니다. 그런 다음 셀당 2 개 이상의 노란 초점을 가진 것으로 SG 양성 세포를 세십시오. 과립은 G3BP1에서 녹색으로, 노란색으로, colocalized 경우 eIF4G에서 빨간색으로 나타납니다. </li><li> 3-5 개의 독립된 지역의 데이터를 결합하여 SG 양성인 세포의 비율을 결정한 후 다음을 계산하십시오 : SG 양성의 수 / 핵의 수) * 100 = SG- 양성 세포의 퍼센트 </li></ol></li><li> 라인 스캔 분석을 통한 Colocalization 평가 - 수동 방법 <ol><li> 열다ImageJ. ()에서 무료로 다운로드하십시오. </li><li> 투자 수익 (ROI) 관리자를 엽니 다 : [분석 | 도구 | ROI 관리자 ...]. </li><li> ImageJ에서 병합 된 이미지를 엽니 다 : [File | 열다]. </li><li> ImageJ 도구 모음에있는 선 도구를 사용하여 SG를 통과하는 선을 추가하고 SG 앞뒤에 포함하십시오. ROI 관리자 창에서 [추가]를 클릭하여 ROI 관리자에이 행을 추가하십시오. </li><li> 병합 된 이미지를 별도의 채널로 분할하여 과립에 대한 각 표식의 현지화를 평가합니다. [이미지 | 색상 | 채널 분할]; 그러면 병합 된 이미지가 3 개의 흑백 이미지로 분할됩니다. </li><li> 흑백 이미지에서 선이 선택되었는지 확인하십시오. 이미지에 나타나면 선이 선택됩니다. 그렇지 않은 경우 ROI 관리자 창에서 패널의 라인을 클릭하십시오. 그러면 ROI 관리자 창에서 파란색 선이 강조 표시되고 흑백 이미지에 선이 표시됩니다. 회선이 여전히 표시되지 않으면 &quot;모두 표시&quot;가 chROI 관리자에서 확인한 다음 이미지의 선을 클릭하십시오. </li><li> 선의 강도를 분석합니다 : [Analyze | 플롯 프로파일]; 이것은 &quot;Plot Profile&quot;창을 불러 오며,이 창은 선을 가로 지르는 신호의 강도를 나타냅니다. </li><li> &quot;Plot Profile&quot;창에서 [List]를 클릭하면 그래프의 원시 데이터가 들어있는 창이 나타납니다. 이 창에있는 모든 데이터를 복사하여 스프레드 시트 파일에 붙여 넣으십시오. 이렇게하려면 창에있는 모든 데이터를 선택하십시오 : [Edit | 모두 선택]을 선택하십시오. 날짜 복사 : [편집 | 부]. 스프레드 시트 파일을 열고 데이터를 붙여 넣습니다 : [편집 | 풀]. </li><li> 각 채널에 대해 단계 6.2.6 - 6.2.8을 따로 완료하십시오. 평가중인 채널을 추적하십시오. </li><li> 스프레드 시트에서 결과의 선 그래프를 생성합니다. [control] 키를 누르고 각 열의 맨 위에있는 문자를 클릭하여 데이터가 포함 된 열을 선택하십시오. 그런 다음 선 그래프를 선택하십시오 : [Insert | 선 그래프]. </li><li> mult에 대해이 분석을 반복하십시오.여러 개의 독립적 인 실험에 걸쳐 스트레스 과립. </li></ol></li><li> 라인 스캔 분석으로 Colocalization 평가 - ImageJ Plugin <ol><li> ImageJ 웹 사이트 (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt)에서 RGB 프로파일 도구를 다운로드하여 설치하십시오. 올바르게 설치되면 빨간색, 녹색 및 파란색 (RGB) 줄 아이콘이 도구 모음에 나타납니다. </li><li> ImageJ에서 이미지 ( 예 : Tiff, JPG)를 엽니 다. [File | 열다]. </li><li> ImageJ 도구 모음에있는 RGB 아이콘을 클릭하십시오. </li><li> 클릭하고 드래그하여 인접한 영역을 포함하여 SG를 통해 확장하는 선을 추가합니다. 히스토그램 이미지가 팝업 창에 나타납니다. </li><li> 데이터를 이미지로 저장하십시오 : [File | 다른 이름으로 저장 | 사소한 말다툼]. 또는 위에서 6.2.8 단계를 사용하여 다른 그래프 작성 프로그램에서 데이터를 내보내고 그래프로 나타낼 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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만성 스트레스는 여러 질병에 대한 면역 조직 학적 연구에서 입증 된 바와 같이 다양한 세포 내 초점을 형성합니다. 예를 들어, 대부분의 신경 퇴행성 질환은 불용성 단백질의 세포 내 응집체를 특징으로합니다. 그러한 응집체에서 SG- 관련 단백질의 존재는 그러한 초점이 SG라고 결론을 내리기위한 기초가된다. SG 마커 양성 세포질 초점이 새로운 스트레스 자극으로 치료 된 세포에서 관찰되는 경?...

세포는 스트레스에 반응하는 많은 메커니즘을 사용합니다. 일부 반응은 전사 후 수준에서 일어나며 mRNA 번역 및 / 또는 안정성을 조절하는 것과 관련됩니다 1 , 2 . 스트레스 - 조절 된 mRNA 번역 정지 및 분해는 특이 적 비 막성 세포 초점의 형성과 관련되며, 가장 잘 특징 지어지는 스트레스 과립 (SGs) 3 . SG는 스트레스 ( 예 : 산화, 열 쇼크, 영양 결핍 및 바이러스 감염)에 반응하여 번역 상 체포 된 세포에 비 번역 mRNP를 집중시키는 세포질 초점입니다 4 . 비 번역 mRNA 외에도 SG에는 번역 개시 인자, RNA 결합 단백질 및 다양한 신호 단백질 5가 들어 있습니다. SG는 억제 된 단백질 번역 및 변형 된 RNA 신진 대사의 바이오 마커이며 세포 생존 및 세포 사멸, 신호 전달 경로와 관련되어있다s 및 핵 과정 5 . SG는 동적 엔티티이며, 그 형성은 셀룰러 변환 6 의 상태와 밀접하게 관련되어 있습니다. 외관상으로 튼튼한 외관에도 불구하고, 대부분의 SG 단백질 성분은 초 단위의 체류 시간으로 빠르게 출퇴근합니다. SG는 몇 시간에서 몇 시간 동안 지속되지만 대부분의 구성 요소는 빠른 속도로 흐릅니다. 번역 개시의 억제와 번역 폴리 소메 우스의 결과적인 분해는 SG의 형성을 촉진한다. 따라서 SG는 번역 폴리 소문과 평형을 이룹니다. 이 polysome / SG 평형은 다른 스트레스 유발 성 초점과 진실 SG를 구별하는 데 중요합니다 6 , 7 . 정지 개시 정지는 mRNA, 번역 개시 인자 (eIF) 및 40S 리보솜 서브 유니트를 함유하는 번역 - 유능한 사전 - 개시 복합체의 전환을 수반한다<html> o-48S 복합체)를 SGs 4 , 6 으로 통합 할 수있는 번역 상 지연된 복합체 (소위 48S * 복합체)로 전환시키는 것이다. SGs는 48S 복합체 형성의 상류의 2 개의 다른 단계에서 번역 정지에 의해 촉진된다 : 캡 결합 eIF4F 복합체 ( 예를 들어, 그의 eIF4A 서브 유닛을 표적으로하는 것)의 기능과의 간섭 또는 번역 개시 인자 eIF2의 α 서브 유닛의 인산화 4 종의 eIF2 키나아제 중 하나 이상을 포함한다. 정지 된 48S 복합체 ( 즉, 40S 리보솜 서브 유닛 및 선택된 번역 개시 인자)의 존재는 SGs 8 , 9 의 특징이다. SG는 바이러스 감염, 신경 변성,자가 면역 및 암과 같은 다양한 병리학 적 상태에 연관되어있다 3 , 10 , 11 ,ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . 몇몇 SG 성분의 돌연변이 형태는 뉴런이 뉴런의 죽음에 적극적인 역할을 할 수있는 세포 내 병적 흠도를 나타내는 신경 퇴행성 질환 ( 예 : 근 위축성 측삭 경화증)과 관련되어있다. 일부 바이러스는 SG 성분을 납치하여 SG 형성을 억제하고 바이러스 복제를 촉진시킵니다 14 . 최근의 연구들은 또한 화학 요법 및 방사선 치료법 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 하에서 SG를 암 15 와 암 세포 생존과 연관시킨다. 이러한 발견이 SG 생물학에 큰 관심을 자극하는 동안, 많은 발표 된 보고서는 선의 SG의 형성을 다른 스트레스 유발 성 초점과 구별하는 중요한 통제가 부족하다. SG는 처음에 T 세포 세포 내 항원 1 (TIA-1) 및 폴리 -A 결합 단백질 (PABP)을 포함하는 선택된 mRNA- 결합 단백질 (RBP)로 구성된 비 막성 세포질 초점으로 기술되었다; 번역 개시 요인; 폴리아 데 닐화 된 mRNA; 작은 리보솜 서브 유닛 4 , 6 , 21 , 22 . 전통적으로, 그들의 구성은 면역 염색과 형광 tagged 단백질 23 , 24 의 이소성 발현과 같은 기술에 의해 결정되었습니다. 그들의 매우 역동적 인 특성으로 인해, SG 단백질 및 / 또는 mRNA의 면역 로컬 ​​리 제이션은 SGs 23 , 24 를 검출하기위한 정의 방법으로 남아 있습니다. 지금까지 많은 RBP와 다른 단백질 (120 종 이상의 서로 다른 단백질)이 SG 구성 요소 11 로 묘사됩니다. 많은 SG- 지방화 된 단백질은 스트레스 의존성 및 독립적 인 방식으로 이들의 국소화를 변화시키고 다른 세포 내 구획 및 병소에 축적 될 수 있으므로, 정확한 SG 마커를 선택하고 SG를 다른 유형의 스트레스 유도 성 초점. 진실 된 SG는 mRNA, 번역 개시 인자 및 작은 리보솜 서브 유닛을 포함하며 번역과 동적 평형을 이룹니다. 이 간단한 작업 흐름은 스트레스에 의해 유발 된 초점이 진실한 SG인지 여부를 결정하도록 설계되었습니다. 이 워크 플로우에는 U2OS 세포를 사용하는 몇 가지 실험적 접근 방법이 포함되어 있습니다. SG는 SG를 연구하는 데 일반적으로 사용되는 세포입니다. 이 세포들은 큰 세포질을 가지고 비교적 평평하며 유리 커버 슬립에 강하게 부착되어 이상적입니다. SG를 연구하기 위해 다른 세포 유형을 사용할 수도 있지만 타이밍, 약물 농도 및 SG 핵 결정 단백질의 차이가 동질성을 변화시킬 수 있다는 사실을 알고 있어야합니다.상황. 또한 일부 세포는 세포 표면 표백제를 형성하여 파라 포름 알데히드 고정에 반응하여 일부 SG 마커의 점을 찍은 국소화를 유발하는 겉치레 모양을 나타낸다. 신중한 분석 없이는 SG로 잘못 분류 될 수 있습니다. 이것은 스트레스 유발 성 초점을 진실 SG로 식별하는 데 필요한 모든 기준을 평가할 필요성을 강조합니다. SG 22 를 촉진시키는 암 치료제 인 Vinorelbine (VRB)과 강력하고 잘 특성화 된 SG 유도제 인 Sodium Arsenite (SA)가이 프로토콜에서 실험을위한 스트레스로 사용됩니다. 표준 SG에는 세포질 초점에서 공존하는 여러 SG 마커 (단백질과 mRNA 모두)가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 단백질 마커와 polyadenylated mRNA 22 의 국한을 각각 감지하기 위해 immunofluorescence와 형광 in situ hybridization (FISH)을 사용합니다. 간략하게, 간접 면역 형광법은 항체 ( 즉,이자형. 일차 항체)를 세포 내에서 검출 할 수 있습니다. 그런 다음 형광 색소에 부착 된 2 차 항체 (보통 종 특이성)가 1 차 항체를 인식하고 표적 단백질의 위치를 ​​밝혀냅니다. 형광 현미경 검사는 세포 내에서 국부 신호를 감지하는 데 사용됩니다. 다른 종에서 생산 된 항체를 사용하고 색이 다른 2 차 항체로 검출하면 여러 항체의 동시 발현을 검출 할 수있어 단백질 표적이 동일한 위치에서 발견됨을 나타냅니다 23 . 진실 된 SG에서 공존하는 것으로 확인 된 마커를 선택하는 것이 중요합니다. FISH는 특정 RNA 또는 DNA 서열과 염기쌍을 이루는 표지 된 프로브를 사용합니다 25 . mRNA를 검출하기 위해이 프로토콜은 mRNA의 polyA 꼬리 ( 즉, polyA FI)와 하이브 리다 이즈 (또는 염기쌍)하는 바이오 티 닐화 올리고 (dT) 40 프로브를 사용합니다SH). 그런 다음 streptavidin이 biotin에 대해 높은 친 화성을 가지기 때문에 형광 결합 형 streptavidin을 사용하여 biotinylated probe를 검출합니다. SG를 평가할 때 polyA FISH와 SG marker를 검출하는 immunofluorescence를 결합하는 것이 중요합니다. 실제 SG와 마찬가지로 두 신호가 함께 있어야합니다. 이 프로토콜을 사용하여 colocalization은 여러 가지 방법으로 평가됩니다. 다중 채널 ( 즉, RGB : 적색, 녹색 및 청색) 이미지에서 colocalization은 중첩 신호의 색상을 변경합니다 ( 예 : colocalized 빨간색과 녹색이 노란색으로 나타남). 또한, 각 색의 강도가 주어진 라인 8 , 20 에서 측정되는 라인 스캔 분석을 사용하여 동시 기록이 그래픽으로 정량화됩니다. 이 프로토콜은 ImageJ 26을 사용하는 두 개의 라인 스캔 분석 절차를 설명합니다. 하나의 절차는 수동이며 전체 프로세스를 진행합니다.다른 하나는 매크로를 사용하거나 수동 단계를 자동화하는 간단한 프로그램을 사용합니다. 매크로 절차를 이해하려면 수동 프로그램을 거치는 것이 중요합니다. SG가 번역이 억제 된 세포에서 형성된다; 따라서 SG가있는 세포는 처리되지 않은 세포에 비해 전체적인 번역 수준이 감소해야합니다. 실험적으로 ribopuromycylation이 사용됩니다. puromycin과 emetine은 고정되기 전에 짧은 기간 동안 세포에 첨가되어 puromycin이 적극적으로 폴리 펩타이드를 형성하게하여 종결을 일으킨다. 재 시술을 막기 위해 emetine을 사용한 치료가 필요합니다 29 . Puromycin은 Anti-Puromycin 항체를 사용하여 검출 할 수 있으며 활성 번역의 스냅 샷을 제공합니다. 이 방법은 빠르고, 특정 아미노산이 결핍 된 배지를 미리 굶주 리지 않아도 (그리고 잠재적으로 세포에 압박을 가하는) 필요가 없기 때문에 사용됩니다.단백질 변환의 세포 내 지방화. &quot;click-it&quot;화학 물질 30 과 결합 된 메티오닌 아날로그 L- 아지도 모아 라 인 (AHA)과 같은 변형 된 아미노산 유사체를 사용하는 다른 방법은 SG를 함유하는 세포가 이웃 세포보다 훨씬 낮은 번역을 나타내는 것을 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나,이 기술은 메티오닌 기아와 15-30 분 동안의 펄스 표지가 필요합니다. 메티오닌 기아 현상은 추가적인 스트레스를 구성하는 반면, 긴 표지 시간 ( 즉, 15-30 분)은 누적 이동보다 누적 이동의 측정을 초래하고 새로 합성 된 단백질이 합성 위치에서 세포. 대조적으로, 리보 푸로 마이신 화는 훨씬 빠르며 포도당 결핍을 통해 SG를 유도하는 데 사용되는 글루코스가없는 배지와 같은 모든 배지와 호환됩니다. 정식 SG는 동적 평형 상태에있다.적극적으로 폴리 소문을 번역합니다. 이것은 polysomes를 안정화 시키거나 불안정하게하는 약물로 시료를 처리하여 SG와 polysomes 사이의 균형을 바꾸어 실험적으로 평가할 수 있습니다 23 . Cycloheximide (또는 유사하게 행동하는 emetine)는 mRNA에 리보솜을 &quot;동결 시킴&quot;으로써 신장을 막아 SG를 형성 할 수있는 유효한 non-polysomal mRNP의 수를 감소시킨다. 실험적으로, 이것은 두 가지 방법으로 사용할 수 있습니다 : SG 생성을 막기 위해 스트레스를 가하기 전에 cycloheximide (또는 emetine)를 첨가하거나 SG가 형성 된 후에 cycloheximide (또는 emetine)를 첨가하여 스트레스를 제거하지 않고도 SG 해체 선발 착물은 서서히 폴리 소메 분획으로 들어간다. 대조적으로 puromycin은 조기 종결을 일으키고 폴리섬 해체를 촉진하여 SG로 조립할 수있는 mRNA 개시 풀을 증가시킵니다. 실험적으로 puromycin 치료는 SG의 수를 늘리거나 threshol을 낮 춥니 다.d는 등급이 매겨진 스트레스 나 약물 복용량에 반응하여 형성됩니다. puromycin의 영향을 평가할 때, puromycin이 약물의 효과를 증가시키고 SG를 나타내는 세포의 비율을 증가시킬 것으로 기대되기 때문에, 관심있는 약물의 최대 이하의 수준을 사용하는 것이 중요합니다. 이것은 약물 / 스트레스는 초기에 세포의 100 %에서 SG를 일으킨다. 이는 SG를 분해하고 세포의 ~ 95 %가 SG를 처음 표시 할 때 가장 잘 작동하여 최대 감소 가능성을 관찰하고 정확하게 정량화 할 수있는 cycloheximide 치료법과 대조됩니다. 이 프로토콜은 포유류 세포에서 SG를 연구하기위한 프레임 워크를 제공합니다. 방법은 다음과 같습니다 : (1) 추정 SG에서 전통적인 SG- 관련 마커 eIF4G, eIF3b 및 Ras GTPase- 활성화 단백질 - 결합 단백질 1 (G3BP1)을 동정 (colocalization)을 평가하기위한 면역 형광 염색 및 ImageJ 분석; (2) polyadenylated mRNA를 검출하기위한 올리고 (dT) 형광 in situ hybridization (polyA FISH); (3) 스트레스에 의해 유발 된 초점이 폴리 소메 움과 동적 평형에 있는지 여부를 결정하기위한 시클로 헥시 미드 및 푸로 마이신 치료; (4) 추정 SG를 함유하는 세포의 번역 상태를 평가하기위한 리보 푸로 마이신 화. 함께, 이러한 assays는 스트레스에 의해 유발 된 초점이 진실 된 SG로 분류 될 수 있는지 여부를 결정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg;HTB-96&amp;trade;</td><td>Commonly written &quot;U2OS&quot;&lt;br/&gt; Culture at 37 &amp;deg;C under 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; in 10% FBS/DMEM</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red&lt;br/&gt; Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin&lt;br/&gt; Prewarm prior drug(s) dilution</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td><td>Used to supplement media</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>Used to supplement media</td></tr><tr><td>penicilline streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>Used to supplement media</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>lab tissues (kimwipes)</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>Autoclaved before use&lt;br/&gt; Keep sterile in the tissue culture hood</td></tr><tr><td>Sodium (meta)arsenite &amp;ge;90% (SA)</td><td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 &amp;micro;M as a working stock</td></tr><tr><td>Vinorelbine (VRB)</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td><td>Dissolve in water to 10 mM</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>Used to assess translation level (ribopuromycylation)&lt;br/&gt; -Used to assess SG connection with active translation&lt;br/&gt; Dilute in water to 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Emetine dihydrochloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>Used in combination with puromycin to assess general translation level&lt;br/&gt; Used to assess SG connection with active translation&lt;br/&gt; -Dilute in water to 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Cycloheximide (CHX)</td><td>Sigma</td><td>C4859</td><td>Used to assess SG connection with active translation&lt;br/&gt; Dilute in water to 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>Wash buffer for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved&lt;br/&gt; Aliquots can be stored at -20 &amp;deg;C for several months&lt;br/&gt; Hazardous, use ventilation&lt;br/&gt; Discard in special waste</td></tr><tr><td>Methanol, ACS</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Prechill to -20 &amp;deg;C before use&lt;br/&gt; Discard in special waste</td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td><td>Dilute to 5% in PBS&lt;br/&gt; Add sodium azide for storage at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Blocking solution for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>Dilute to 70% with water</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/100 dilution</td></tr><tr><td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>goat anti eIF3&amp;eta; (N-20) antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&amp;eta; is also known as eIF3b&lt;br/&gt; Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td><td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/1,000 dilution</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Reconstitute in water per manufacturer&amp;rsquo;s instructions then store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>Reconstitute in water as per manufacturer&amp;rsquo;s instructions then store at 4&amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/2,500 dilution</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>Reconstitute in water as per manufacturer&amp;rsquo;s instructions then store at 4&amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 solution</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Incubate with secondary antibodies&lt;br/&gt; Stock solution 0.5 mg/mL in dH&lt;sub&gt;2&lt;sub&gt;0, protect from light&lt;br/&gt; -Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-084</td><td>Reconstitute in water per manufacturer&amp;rsquo;s instructions, then store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>oligo-(dT)&lt;sub&gt;40x&lt;/sub&gt; probe biotinilated</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>/</td><td>Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use&lt;br/&gt; Custom order</td></tr><tr><td>hybridation box</td><td>/</td><td>/</td><td>Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom&lt;br/&gt; - prewarm the box prior use</td></tr><tr><td>20x SSC buffer</td><td>Thermo fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)&lt;br/&gt; Store at RT&lt;br/&gt; Wash buffer for FISH</td></tr><tr><td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td><td>Sigma</td><td>H7033-50ml</td><td>Block and probe incubation buffer for FISH</td></tr><tr><td>slide mounting media</td><td>home made</td><td>/</td><td>Mix 5 g of &amp;ldquo;cold-soluble&amp;rdquo; poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS&lt;br/&gt; Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT&lt;br/&gt; Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT&lt;br/&gt; Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet&lt;br/&gt; Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 &amp;deg;C, 1 week at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol)</td><td>Sigma</td><td>P-8136-250G</td><td>Reagent to make vinol</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-100ML</td><td>Reagent to make vinol</td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002-5G</td><td>Preservative agent for blocking solution and vinol&lt;br/&gt; Make a 20% dilution in water</td></tr></tbody></table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

세포는 갑작스런 환경 변화로 종종 어려움을 겪습니다. 스트레스 조건에 노출 된 세포에서 형성되는 세포질 리보 뉴클레오타이드 복합체 인 스트레스 과립 (SGs)은 세포 대사 및 생존의 다양한 측면과 연관되어있다. SG는 세포 신호 전달 경로, 전사 후 유전자 발현 및 스트레스 반응 프로그램을 조절합니다. 이러한 mRNA- 함유 과립의 형성은 세포 번역에 직접 연결된다. SG 어셈블리는 억제 된 번역 개시에 의해 유발되고, SG 해체는 번역 활성화 또는 억제 된 번역 신장에 의해 촉진된다. 이 관계는 SG 구성에 의해 더 강조됩니다. 핵심 SG 요소는 번역 사전 개시 복합체, mRNA 및 선택된 RNA 결합 단백질 (RBP)이 정지 된 것입니다. SG 어셈블리의 목적은 번역 적으로 정지 된 하우스 키핑 (housekeeping) mRNA를 격리함으로써 세포 에너지를 보존함으로써 스트레스 반응성 단백질의 향상된 번역을 허용하는 것입니다. additi에서stalled translation preinitiation complexes와 같은 핵심 구성물에 SG는 다른 단백질과 신호 분자를 과다하게 포함하고있다. SG 형성의 결함은 스트레스에 대한 세포 적응을 손상시킬 수 있고 따라서 세포 사멸을 촉진시킬 수있다. SG 및 이와 유사한 RNA 함유 과립은 신경 퇴행성 장애 및 암을 비롯한 다수의 인간 질환과 관련되어있어 RNA 과립 아형의 분류 및 정의에 최근 관심을 갖게되었습니다. 이 프로토콜은 포유류 SG를 특성화하고 정량하기위한 분석을 설명합니다.

스트레스 유발 초점은 반드시 SG가 아닙니다. SG는 mRNA, 번역 개시 인자 및 RNA 결합 단백질을 포함하고 활성 번역과 평형을 이루는 세포질 초점으로 분류됩니다. 위의 프로토콜은 주어진 응력이 진정한 SG를 유도하는지 여부를 특성화하기위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다. SGs는 단백질과 mRNA를 포함한 다른 알려진 SG ?...

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Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

스트레스 과립 (SGs)은 다양한 스트레스에 노출 된 세포에서 형성되는 비 세포 성 세포질 구조입니다. SG는 mRNA, RNA 결합 단백질, 작은 리보솜 서브 유닛, 번역 관련 인자 및 다양한 세포 신호 전달 단백질을 포함한다. 이 프로토콜은 선량있는 SG를 탐지, 특성화 및 정량화하기위한 몇 가지 실험적 방법을 사용하는 워크 플로를 설명합니다.

포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.5K 조회수.  Brigham and Women's Hospital.  스트레스 과립 (SGs)은 다양한 스트레스에 노출 된 세포에서 형성되는 비 세포 성 세포질 구조입니다. SG는 mRNA, RNA 결합 단백질, 작은 리보솜 서브 유닛, 번역 관련 인자 및 다양한 세포 신호 전달 단백질을 포함한다. 이 프로토콜은 선량있는 SG를 탐지, 특성화 및 정량화하기위한 몇 가지 실험적 방법을 사용하는 워크 플로를 설명합니다. 

비디오: Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

포유 동물 세포를 Trypsinizing 및 Subculturing

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

연구

생물학

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

면역학 및 감염병학

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

생체공학

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

유세포분석을 사용한 마우스 뇌 히스톤 변형 정량화

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

저자 스포트라이트: 유전자 발현 조절 연구의 개선 사항

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법

요약

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하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

Polysome 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

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