우리는 기술 지원을 린 Forlow-Jech 및 Dannialle 리로이 감사합니다. 이 문서는 목적으로 만입니다 무역 이름 또는 상용 제품의 JAF 및 JJH 언급 작물 보호 및 검역 [프로젝트 # 2020-22620-022-00D] -이 작품은 USDA ARS에 기본 CRIS 자금, 국가 프로그램 (304)에 의해 지원되었다 특정 정보를 제공하고 미국 농무부에 의해 추천이나 승인을 의미하지는 않습니다. USDA는 동등한 기회를 제공하는 고용 기관입니다.

표현의 플라스미드의 건설 1. OE-PCR 참고 : OE-PCR에 사용 된 모든 프라이머는 표 1을 참조하십시오. 높은 충실도의 DNA 중합 효소의 사용은 모든 증폭하는 것이 좋습니다. 그러나 이러한 효소는 자주 방치하지 않기 때문에 3 &#39;A는, 그것의 Taq DNA 중합 효소와 간단한 비 증폭 배양을 실시 할 필요가에 &quot;A-꼬리&quot;를 PCR 제품 조교 곤충 세포 발현로 복제하기 전에 벡터. 이 프로토콜은 곤충 발현 플라스미드가 세포 내 마커 단백질 (두 Bemisia의 담배가 루이 아쿠아 포린 단백질이 경우), 또는 관심의 유전자의 카복실 말단에 인 - 프레임 융합 형광 단백질, 키 메릭 단백질을 형질 생성하는 방법을 보여준다 (도 1). <ol><li> 증폭 개의 독립적 인 발사 구성 OE-PCR을 사용하여 생성한다 : (1) 관심의 유전자를 코딩하는 서열 (B. 담배가 루이아쿠아 포린 1 : BtDrip1; B.의 담배가 루이의 아쿠아 포린 2 BtDrip2_v1) EGFP 또는 (2) 세포 내 마커 (초파리 melanogaster의 성 펩타이드 수용체라는 녹색 형광 단백질 변이체에 프레임 융합 : DmSPR 호모 사피엔스 포스 포 리파제 A2 : HsPLA2)에 mCherry 코딩 시퀀스. 직접 PIB / V5-그의-TA 플라스미드로 최종 OE-PCR 제품을 결찰. <ol><li> OE-PCR의 첫 번째 라운드를 들면, (표 1에 볼드체로 도시) 유전자 특이 적 센스 프라이머 및 키메라 안티센스 프라이머를 사용하여 (AD 및 A&#39;-D도 1은 &#39;로 표시됨)에 대응 (표 1 이탤릭체) 관심 / 세포 내 마커 유전자 (종결 코돈이없는) 최종 15 BP로 원하는 형광 단백질의 5 &#39;말단의 15 염기쌍 내지 (EGFP 또는 mCherry)는 3&#39;오버행을 갖는 제품을 생성한다. 참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오. </li><li> 별도의 튜브에있어서,과 특이 유전자를 사용원하는 형광체의 5&#39;- 말단으로부터 관심 / 세포 내 마커 유전자의 3 &#39;말단의 15 염기쌍, 15 염기쌍을 포함하고 키메라 센스 프라이머 (표 1의 밑줄로 표시) IC 형광 단백질 안티센스 프라이머 단백질은 5 &#39;오버행을 가진 제품을 생성합니다. 참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오. PCR 반응의 주형은 하나 이상의, 바람직하게 플라스미드 DNA는 목적하는 서열을 은닉하는 서열 확인 PCR 생성물 또는 일 수있다. 여기에 설명 된 연구는 순서 검증 된 플라스미드를 사용합니다. </li><li> (표준 분자 수준 오스를 사용하여) 1 % 아가로 스겔 전기 영동에 가진 PCR 산물을 분리한다. </li><li> 소비세 시판 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 예상되는 크기 (표 2 참조)의 생성물을 정제 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 키트 물질의 표를 참조). </li><li> 최종 오버랩 전자를 생성하는 단계 1.1.4에서 겔 정제 된 PCR 산물을 사용하여xtension 제품은 ( &#39;A로 표시된&#39;- D &#39;&#39;를도 1). 관심 / 아세포의 마커 유전자와 목적하는 키메라 서열을 생성 할 수있는 형광 단백질에 해당하는 유전자 특이 적 안티센스 프라이머위한 유전자 특이 적 센스 프라이머를 사용한다. 참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오. 경험적 최종적 전체 길이 키메라 PCR 생성물을 수득하기 위해, 반응 혼합물에 추가 1 라운드 오버랩 신장 산물의 최적 량을 결정하는 것이 필요할 수있다. </li><li> 1 % 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 제 2 라운드 PCR-OE 제품 별개. 소비세는 시중에서 판매하는 DNA 젤 추출 키트를 사용하여 제품을 정화. </li><li> TA 클로닝에 필요한 3 &#39;adenylated (즉, 꼬리) 제품을 생성하는 72 ° C에서 10 분 동안의 Taq DNA 중합 효소의 마스터 믹스를 1 개 유닛으로 겔 정제 2 라운드 OE-PCR 제품 인큐베이션. </li><li> 결과 adenylated 제품을 결찰이소 부틸 렌 발현 벡터에 화학적 능력 (열충격) 또는 electrocompetent (전기) 대장균 세포를 형질 전환 표준 분자 클로닝 기술을 사용한다. 적절한 선별 마커 (예, 암피실린 또는 베니 실린)을 함유하는 배지에서 밤새 플레이트. </li><li> 발현 플라스미드는 5&#39;-3 &#39;방향 인서트를 형질 형질 전환 된 인서트 양성 콜로니를 확인하기 위해 벡터 특이 프라이머 및 삽입 특이 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행한다 (12). 예상 된 크기의 PCR 제품을 생성하는 식민지의 야간 문화를 준비합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 시판되는 DNA 정제 키트 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 키트 재료 표 참조)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리. 직접적인 DNA 서열 분석에 의해 각각의 삽입 체의 서열 무결성을 검증. </li></ol></li></ol> 주 : 무균 상태를 유지 층류 후드 내 조직 배양 플라스크의 개방을 요구하는 모든 셀의 조작을 수행하기 위해. 종래 셀 조작에 층류 후드 UV 살균 램프에 적어도 1 시간 우회전. 니트릴 장갑을 착용하고 그들의 사용하기 전에 70 % 에탄올로 벤치, 피펫,기구, 튜브 및 플라스크의 표면 오염을 제거. 기본 세포 배양 기술에 대한 지식 (13)를 권장합니다. <ol><li> 혈청이없는 배지에 적응 TNI 세포 (트리코 NI 난소 조직 유래의 확립 된 세포 배양 라인)을 사용하여 28 ° C T25의 조직 배양 플라스크에서 무 혈청 곤충 배지에서 점착성 단층 배양로 유지한다. </li><li> Sf9 세포 (스포 도프 테라 프 루기 페르 난소 조직 유래의 확립 된 세포 배양 라인)와 유사하게 사용되지만 TNM-FH 곤충 배양 배지 보충 유지10 % 소 태아 혈청 (FBS) 에드. </li><li> -80 ° C에서 재고의 튜브를 제거하고는 37 ° C의 물을 욕조에 해동 할 수 있도록하여 냉동 인 Sf9 또는 TNI 세포에서 배양 초기 종자. 해동 후 70 % 에탄올로 유리 병의 오염을 제거하고 얼음에 배치합니다. </li><li> 새로운 T25 플라스크 전송 해동 곤충 세포 현탁액 1 ㎖에 곤충 세포 배지 4 mL를 넣고. 28 ° C, 비 가습 인큐베이터에 플라스크를 배치하고, 세포를 30-45 분 동안 부착 할 수있다. </li><li> 적절한 배지 5 mL를 시딩 배지를 교체하고 28 ° C 비 가습 인큐베이터 플라스크 옮긴다. 매일 세포의 합류를 모니터링합니다. 통로 세포는 90 %의 포화 상태에 도달했을 때. 참고 : T25 플라스크의 전체 범위는 ~ 5 × 10 6 세포에 해당합니다. </li><li> 곤충 세포 통로. <ol><li> 세포 통로, 제 5 ㎖ 멸균 피펫을 사용하여 혈청 학적 융합 세포를 포함하는 플라스크에서 배출 된 매체를 제거한다.매체가 얻어 세포 단층에서, 하나 개의 코너로 흐르도록 플라스크를 기울인다. 조심스럽게 세포를 방해하지 않고 피펫을 사용하여 매체를 제거합니다. </li><li> 부드럽게 새로운 살균 5 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 무 혈청 배지 곤충 4 mL를 합류 단층을 함유하는 T25 플라스크를 세척함으로써 세포를 TNI시키다. 플라스크에 걸쳐 피펫 팁을 이동 서서히 느슨하게 플라스크 바닥에 부착 된 세포를 제거하기 위해 관개. <ol><li> 모든 미디어를 제거를 통해 플라스크를 회전하고, 플라스크의 바닥이 깨끗한 지 관찰하여 세포의 적절한 분리를 확인합니다. </li></ol></li><li> 더 단단히 부착 Sf9 세포에 대해, 신선한 TNM-FH 배지 4 mL를 첨가하고, 세포 부착을 제거하는 셀 스크레이퍼를 사용한다. 부드럽게 혼합 세포 응집을 줄이기 위해 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다. </li><li> 매체의 볼륨 당 가능한 곤충 세포의 수를 추정하는 자동 세포 계수기를 사용합니다. 1.5 mL의 세포 / 배지 혼합물에 0.1 mL의 전송미세 원심 분리 튜브. 별도의 0.5 mL의 미세 원심 분리 튜브에, 트리 판 블루 10 μL로 세포 / 배지 혼합물 10 μL를 추가한다. </li><li> 포장에서 셀 카운터 챔버 슬라이드를 제거하고 계산 슬라이드의 각 측면에 셀 / 중간 / 트리 판 블루 혼합물 10 μL를 추가한다. 세포 카운터에 슬라이드 삽입하고, 세포 밀도 및 생존 능력을 결정한다. </li><li> 세포 밀도를 사용하여 계산하고 새로운 무균 T25 플라스크에 곤충 세포 배지 (최대 5 ㎖까지)의 적절한 부피를 추가한다. </li><li> 신선한 미디어와 T25 플라스크에 약 1.5 × 10 6 세포로 이동; (P, N의 셀의 이전 세대 통로 번호 P의 N + 1 세대) 세포 라인을 사용 날짜, 중간 부가 세포 수 및 통로 번호 플라스크 라벨; 최대 72 시간 동안 28 ° C의 배양기에서 플라스크를 배치했다. 주 : 곤충 세포가 연속적으로 전달 될 수 있고, 세포를 형질 감염 및 / 또는 이종 덜 들일 수도 있지만통로 (30) 후 단백질 발현. 10 % 표백제 용액으로 파기 세포 / 미디어를 처리하고, 처리 전에 일회용 플라스틱 제품을 오토 클레이브. </li></ol></li></ol> 3. 곤충 세포 형질 <ol><li> 와 T25 플라스크 시드 최대 1 × 적합한 곤충 세포 배지에서 6 TNI 또는 인 Sf9 세포 (인 Sf9위한 TNI 및 TNM-FH 용 무 혈청 곤충 배지), 28 ° C에서 72 시간 동안 포화 상태로 성장한다. </li><li> 제거하고 기존 매체를 버리고 신선한 혈청이없는 곤충 매체의 4 mL로 세포를 이동시키다 (위의 단계 2.6.2과 2.6.3을 참조). </li><li> 자동 세포 계수기 (위의 단계 2.6.4 참조)를 사용하여 세포 농도를 추정한다. </li><li> 각각의 35mm의 유리 - 바닥 접시에 약 7 × 105 세포를 첨가하고, 세포를 28 ℃에서 20-25 분 동안 부착 할 수있다. </li><li> 각각의 형질 감염을 위해, 플라스미드 DNA의 2 μg의 추가 (DO 중 하나에 대한 두 개의 플라스미드들 각각으로부터 하나의 플라스미드 형질 하나 또는 2 μg의 행멸균 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브 인 Sf9 및 형질 TNI) 모두 FBS가없는 무 혈청 곤충 배지 (0.1 mL를 행 uble 형질). </li><li> 별도의 튜브에, 무 혈청 곤충 배지 0.1 ㎖의 트랜 스펙 션 시약의 8 μL를 혼합하고 관심의 플라스미드 DNA를 함유하는 용액 튜브에 옮긴다. 가볍게 와동 및 20 RT 부화 - 30 분. </li><li> 전량을 1 mL로 같도록 혈청 곤충 배지 0.8 mL의 플라스미드 형질 단계 3.5 내지 3.6의 혼합물을 희석. </li><li> 조심스럽게 부착 된 세포를 포함하는 유리 접시에서 용지를 제거합니다. 희석 된 플라스미드 형질 감염 배지 부착 세포 오버레이. </li><li> 5 시간 동안 28 ℃에서 세포를 인큐베이션. 주 : 형질 조건은 최대 형질 전환 효율 (경험적 최적화를 필요로 예를 들면 밤새 형질보다 5 시간, 사용 된 플라스미드 DNA의 양, 형질 감염 시약 화학사용, 등.). </li><li> 제거하고 형질 매체를 폐기하고 부드럽게 세포를 꺼 내려하지 않도록주의, 무 혈청 곤충 매체의 1 mL로 세포를 씻어. </li><li> 신선한 곤충 세포 배지 (인 Sf9에 대한 TNI와 TNM-FH에 대한 혈청이없는 곤충 매체)의 2 mL를 추가하고 48 ~ 72 시간 동안 28 ° C에서 품어. 참고 : 다시, 조건이 최대 이종 단백질 발현에 대한 경험적 최적화가 필요합니다. </li></ol> 4. 공 초점 형광 현미경 <ol><li> 48-72 시간 후 형질 감염에서 IPL-41 곤충 배지 1 ㎖로 한번 세포를 세척하고 2 mL의 IPL-41 촬상 용 커버. 참고 :이 세척 단계는 정상 세포의 유지에 사용되는 곤충 세포 매체 관찰 배경 자동 형광을 줄일 수 있습니다. </li><li> 훽스트 살아있는 세포 염색 시약을 4 방울을 가하여 매체 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 핵 염색 재료의 테이블 참조)를 20-25 분 동안 28 ℃에서 배양한다. 참고 : 추가 NUC염료 EGFP 및 mCherry에서 독특한 형광 프로파일을 가져야하지만 리어 얼룩은 치환 될 수있다. </li><li> 자기 밀폐 된 공 촛점 현미경 스캐닝 레이저로 35mm 접시 (이 프로토콜에 사용되는 특정 악기 재료의 표 참조)을 놓습니다. </li><li> 훽스트, EGFP 및 mCherry 관찰 조건 현미경 조정 : 훽스트 여기 / 방출 - 461분의 359 나노 미터; EGFP 여기 / 방출 - 510분의 489 나노 미터; mCherry 여기 / 방출 - 610분의 580 내지. </li><li> 형광 발현을 확인한 후 60X 위상 대조 물 액침 대물 주사를 사용 모드로 전환하기 위해 10 배 대물 렌즈를 사용하여 초기 검사를 수행한다. </li><li> 화상 콘트라스트, 해상도를 최적화하기위한 레이저 파워 (5-7 %), 검출 감도 (47-49 %), 주사 속도, Z 축 깊이, 디지털 줌을 조정한다. 이미지 1.5 배 디지털 줌의 세포는 90X 증폭의 총을 제공합니다. 참고 : 현미경 매개 변수를 최적화에 대한 경험적 조정 필요및 이미지 컬렉션 사용 기기에 특정 될 수있다. </li><li> TIFF 이미지 파일로 원시 데이터를 내보내고 그림 세대 (작물 및 오버레이)를 수정합니다. </li></ol>

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Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이종 단백질 발현 시스템은 다수의 다운 스트림 애플리케이션 4에 사용되는 재조합 단백질의 생산을위한 중요한 도구입니다. 사용할 수있는 다양한 발현 시스템에서 선택하면 관심있는 단백질의 최종 목표에 따라 달라집니다. 여러 곤충 세포 발현 시스템은 원핵 생물과 진핵 세포 발현 시스템 5, 6 유연한 대안을 제공하는 사용할 수 ?...

곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 재조합 단백질의 생산은 진핵 세포 단백질의 연구에 많은 이점을 제공합니다. 즉, 곤충 세포 유사 번역 후 변형, 가공, 적절히 접힌 단백질 1, 2, 3의 제조에 유리하다 포유류 세포에 존재하는 것과 같은 정렬 메커니즘을 갖는다. 곤충 세포 시스템은 일반적으로 포유 동물 세포주 4, 5에 비해 유지 보수를 위해 더 적은 자원과 적은 시간과 노력을 필요로한다. 배큘로 바이러스 발현 시스템은 단백질의 특성화 및 치료제 외국 펩타이드 백신 생산 용 바이러스 단백질의 면역 원성 프레젠테이션 다중 합성 용 재조합 단백질의 생산을 포함하여 널리 다양한 분야에서 사용되는 하나의 곤충 세포 기반 시스템이며 - 단백질 복합체등의 당화 단백질의 제조. 1, 2, 4, 6. 있다, 그러나, 상황이되는 배큘로 바이러스 발현은 3, 7 적용되지 않을 수 있으며, nonlytic 과도 곤충 발현 시스템의 사용이 더 적합 할 수있다. 특히, 과도 곤충 세포 발현 재조합 단백질의 빠른 합성을위한 가능성을 제공, 바이러스 부과 세포 용해를 포함하지 않는 덜 개발 및 유지 보수를 필요로하고, 더 나은 단백질 합성 7, 8, 9시 세포 인신 매매를 연구하는 수단을 제공, 10. 이 프로토콜을 이용하여 발현 벡터의 신속한 생성을 설명 두 단계 PCR 중첩 확장 (OE-PCR) 및, 대장균에서 플라스미드 DNA의 표준 클로닝. 플라스미드는 이중 트랜 상업적으로 이용 가능한 배양 된 곤충 세포에 사용되는 대표적인 단백질을 생산 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 두 개의 서로 다른 형광 표지 세포 내 마커 단백질의 생산과 사용을 설명하고 곤충 Bemisia의 담배가 루이의 두 아쿠아 포린 단백질 colocalization을 보여줍니다. 다음 프로토콜 OE-PCR, 표적 단백질의 세포 지역화 곤충 세포 및 형질 유지하고, 형광 현미경의 기본 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA Polymerase</td><td>EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td>High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products</td></tr><tr><td>ExTaq DNA Polymerase</td><td>TaKaRa-Clontech</td><td>RR001B</td><td>DNA polymerase used for A-tailing of PCR products</td></tr><tr><td>EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix</td><td>Lucigen</td><td>30033-1</td><td>DNA polymerase used for bacterial colony PCR</td></tr><tr><td>Biometra TProfessional Gradient Thermocycler</td><td>Biometra/LABRepCo</td><td>070-851</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Benchmark Scientific</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Montage DNA Gel Extraction Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>LSKGEL050</td><td></td></tr><tr><td>pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>K89020</td><td>Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube Robotic Workstation</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>Purifier Vertical Clean Bench</td><td>Labconco</td><td>3970401</td><td></td></tr><tr><td>Tni cultured insect cell Line</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-CEL-10005</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 cultured insect cell Line</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-CEL-10002</td><td></td></tr><tr><td>Serum-Free Insect Culture Medium</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-MED-10002</td><td></td></tr><tr><td>TNM-FH Insect Culture Medium</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-MED-10001</td><td></td></tr><tr><td>IPL-41 Insect Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>11405081</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>10362100</td><td></td></tr><tr><td>16 cm Disposable Cell Scrapers</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td>Cell scrapers with two-position blade</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps</td><td>Life Science Products</td><td>CT-229331</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Fisher</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes</td><td>Life Science Products</td><td>CT-229475</td><td></td></tr><tr><td>PipetteBoy</td><td>VWR</td><td>14222-180</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serological Pipettes</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes</td><td>Fisher</td><td>14230200</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene Biohazard Autoclave Bags</td><td>Fisher</td><td>01828C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes</td><td>Matsunami Glass</td><td>D35-14-1.5-U</td><td>35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated</td></tr><tr><td>Incubator, Model 1510E</td><td>VWR</td><td>35823-961</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Cell Counter</td><td>ThermoFisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV10i-LIV</td><td></td></tr><tr><td>HsPLA2/pCS6 plasmid DNA</td><td>transOMIC Technologies</td><td>TCH1303</td><td></td></tr><tr><td>pmCherry Vector</td><td>Clontech</td><td>632522</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37605</td><td></td></tr></tbody></table>

transient expression and cellular localization of recombinant proteins in cultured insect cells

이종 단백질 발현 시스템은 재조합 단백질의 생산에 사용되는, 셀룰러 피킹 / 제이션의 해석 및 서브 유기체 수준에서 단백질의 생화학 적 기능의 결정. 배큘로 바이러스 발현 시스템은 점점 더 많은 생명 공학, 제약 및 산업용 애플리케이션이 분명한 혜택을 바이러스 감염을 포함하지 않지만 종종 간과하고 충분히 활용하는 nonlytic 시스템에서 단백질 생산을 위해 사용되지만. 여기서는 nonlytic 발현 벡터 및 과도 재조합 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 재조합 단백질의 효율적인 세포 제이션을 허용하고 신속하게 세포 내 단백질 피킹을 식별하는데 사용될 수있다. 우리는뿐만 아니라, 곤충 Bemisia의 담배가 루이의 두 아쿠아 포린 단백질을 포함하여 시중에서 판매하는 곤충 세포주에서 네 개의 재조합 단백질의 발현을 보여세포 원형질막 세포 이하의 특정 마커 단백질로서 세포 내 리소좀에 대한. 모든 재조합 단백질은 재조합 단백질의 직접 검출을 가능하게 그들의 카복실 말단에서 형광 단백질 마커 키메라 같이 제조 하였다. 플라스미드 관심과 알려진 세포 내 마커의 유전자 구조를 숨겨와 세포의 이중 형질 전환 라이브 세포 이미징 및 세포 단백질 현지화의 개선 확인이 가능합니다.

OE-PCR OE-PCR 일단 관심 형광 마커 단백질의 임의의 테스트에 대응하는 유전자 재조합 키 메릭 단백질의 생성을 허용, 발현 벡터에 삽입 키메라 DNA 산물의 합성을 허용한다. 도 1은 형광 단백질 마커 EGFP에 프레임 시퀀스 (BtDrip1 및 BtDrip2_v1)를 부호화 B.의 담배가 루이의 아쿠아 포린 PIB를 함유하는 발현 벡터의 제...

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Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

transient-expression-cellular-localization-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K 조회수.  Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture.  Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다. 

비디오: Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서<em&gt; 트리코더마 reesei</em&gt; 담배 식물에서

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

연구

환경과학

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

유전학

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The baculovirus-mediated insect cell expression system is one of the systems used to express recombinant eukaryotic secretory proteins with some post-translational modifications. The secretory proteins need to be routed through the secretory pathways for protein glycosylation, disulfide bonds formation, and other post-translational modifications. To improve the existing insect cell expression of secretory plant proteins, a baculovirus expression vector is modified by the addition of either a GP67 or a hemolin signal peptide sequence between the promoter and multiple-cloning sites. This newly designed modified vector system successfully produced a high yield of soluble recombinant secreted plant receptor proteins of Arabidopsis thaliana. Two of the expressed plant proteins, the extracellular domains of Arabidopsis TDR and PRK3 plasma membrane receptors, were crystallized for X-ray crystallographic studies. The modified vector system is an improved tool that can potentially be used for the expression of recombinant secretory proteins in the animal kingdom as well.

Here, we present the protocols for utilizing the insect cell and baculovirus protein expression system to produce large quantities of plant secreted proteins for protein crystallization. A baculovirus expression vector has been modified with either GP67 or insect hemolin signal peptide for plant protein secretion expression in insect cells.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

생화학

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

생물학

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

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재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서