Name: recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach
Uploaded: 2014-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
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우리는이 작업과 레스터 핵심 생명 공학 서비스의 대학에 사용되는 식 구조를 준비 박사 Xiaowen 양 (PROTEX 복제 서비스) 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 BBSRC 학생이기 의해 지원되었다, 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 프로그램 및 수석 수사관 보조금 WT085408 &amp; WT100237 및 BBSRC는 RM31G0224을 부여합니다.

주 : 프로토콜은 따라서 시약의 볼륨과 수량이 비례 적으로 조정해야한다 식의 규모에 적합하다. 적합한 포유 동물 발현 벡터는이 프로토콜에 사용되어야한다. 여기서는 편리 클로닝 (도 1)에서 사용되는 제한 효소의 선택에 따라 친 화성 태그를 포함 또는 배제를 허용하여 pcDNA 3.1 변경됨 발현 벡터를 사용 하였다. 다음의 프로토콜은 대규모 트랜 스펙을 설명한다. 1 L 롤러 병에 1 대규모 문화 / 형질 성장 및 표준 프로토콜에 따라 HEK293F 서스펜션 적응 세포를 유지한다. 일반적으로 30에서 100 ㎖로 선발 문화 250 ML 원뿔 세포 배양 플라스크에서 재배된다. <ol><li> 각각 1 L 롤러 병에 300 ml의 최종 부피로 0.5 × 106 세포 / ml의 세포 종자. 주 : 롤러 병에서 최대 150 ㎖가 최소 수용현탁 배양의 300 ML. 큰 규모의 형질에 대해 여러 병을 사용합니다. </li><li> 세포를 1.0 × 106 세포 / ml의 농도에 도달 할 때까지 37 ° C에서 진탕 인큐베이터에서 24 시간, 120 rpm으로, 5 % CO 2 동안 배양 (세포는 대략 매 24 시간을 분할한다). </li><li> 필터 살균 DNA의 300 μg의 총을 피펫 3 초 동안 적극적으로 PBS 30 ㎖의 소용돌이에 (보충 방법 참조). 참고 : 만 형질 세포 당 DNA의 1 μg의 총을 사용합니다. 두 개 이상의 플라스미드 될 경우 세포에 DNA의 비율이 일정하게 유지되도록 각각의 양을 감소 공동 형질. </li><li> 1.2 ml의 0.5 ㎎의 추가 / 3 초 동안 적극적으로 PBS / DNA 용액 소용돌이에 PEI를 살균 필터링 ML. </li><li> 20 분 동안 실온에서 믹스를 품어. </li><li> DNA를 추가 / PEI는 세포에 혼합 - 1 × 106 세포 / ml (단계 1.3)의 밀도에 있어야한다. </li><li> 공동 - 형질 감염 후, 세포를 부화또한 37 ° C에서 48 시간, 120 rpm으로, 5 % CO 2의 진탕 배양기에서. </li><li> 5 분 동안 3,000 XG에서 세포를 원심 분리 및 -80 ° C에서 펠렛을 저장하여 수확 세포 내 단백질. 참고 : 또는 문화 위의 분위기가 5 % CO 2로 대체되고, 병 뚜껑을 밀봉하는 경우 (비-CO 2) 배양기를 흔들어 표준을 사용합니다. 분위기는 각 통로 (일반적으로 모든 이일)에서 교체해야합니다. </li></ol> 전 세포 추출물에서 2 단백질 복합 정제 이 프로토콜은 플래그 - 태그 된 단백질을 사용하여 핵 착물의 정제를 위해 최적화된다. <ol><li> 으로 세포 펠렛을 해동 ~ 미리 냉장 용해 완충액 40 ㎖ (100 mM 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH가 7.5, 5 % 글리세롤, 0.3 % 트리톤 X-100, 프로테아제 억제제) 문화의 L 당. </li><li> 다시 일시 중지로 pipetting에 의해 여러 번 아래로 펠렛을 (거품 방지 소용돌이를하지 않는합니다). </l난&gt; <li> 철저히 유리 균질기를 이용하여 세포를 다시 일시. 3주기 (15 초, 15 초 Off)에 대한 초음파 처리. 4 ℃에서 25 분 동안 30,000 XG에 원심 분리기와 뜨는을 유지합니다. </li><li> 평형 수지 평형 완충액 (100 mM 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7.5)로 3 회 세척하여 배양 리터당 아가 로스 수지를 충전 방지 플래그 1.25 ML. </li><li> 하나 이상의 50 ㎖의 원심 분리기 튜브의 친 화성 수지와 단계 2.3에서 전체 세포 추출액을 품어 부드럽게 4 ° C에서 30 ~ 120 분 동안 샘플을 회전 할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C, 폐기 상층 액에서 1 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 미리 차게 한 완충액 45 ㎖로 씻어 수지 (100 mM 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH가 7.5, 5 % 글리세롤, 0.3 % 트리톤 X-100). 1 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기 및 상층 액을 제거한다. </li><li> 반복 단계 2.7 높은 염 완충액을 이용하여 낮은 염 완충액 (50 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7로 (300 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH가 7.5, 5 % 글리세롤), 이어0.5, 5 % 글리세롤)과 TEV 쪼개짐 완충액 (50 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7.5, 0.5 mM의 TCEP). 참고 : 각 세척을 확인 완전히 더 이상 수지를 다시 일시 중단하기에 충분한 간단한 즉,이다. </li><li> 수지의 10 ㎕의 샘플을 수집 및 분석을위한 배 단백질 로딩 버퍼 (바인딩 단백질 제어)의 1 부피로 희석한다. 수지에서 항체를 해제 피하기 위해 환원제를 사용하지 마십시오. </li><li> 15 ㎖의 원심 분리 관에 미리 냉장 TEV 절단 버퍼와 전송의 8-10 ML에 수지를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 추가 ~ 40 원래 문화의 L 당 (1 ㎎ / ㎖에서 재고) TEV 단백질 분해 효소 ㎍의 아래로 여러 번을 피펫 팅에 의해 잘 섞는다. </li><li> 단백질 산화를 방지하기 위해 100 % N 2 가스 튜브 분위기를 교체합니다. </li><li> 조심스럽게 4 ℃에서 O / N 회전합니다. </li><li> 10 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기. 적절한 분자량 컷 - 오프와 초 원심 필터에 뜨는을 전송하고 집중500 μL에 이르기까지. </li><li> 농축 된 단백질의 10 ㎕의 샘플을 수집 및 분석을위한 배 단백질 로딩 버퍼의 1 부피로 희석한다. (TEV 제어를 용출액). </li><li> 수지의 10 ㎕의 샘플을 수집 및 분석을위한 배 단백질 로딩 버퍼의 1 부피로 희석한다. 수지에서 많은 양의 항체를 방출 방지하기 위해 환원제를 사용하지 마십시오. (후 TEV 수지 제어). </li><li> 겔 여과 완충액 (50 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7.5, 0.5 mM의 TCEP)와 크기 배제 크로마토 그래피 컬럼을 평형화. </li><li> 0.22 μm의 필터를 통해 단백질을 필터링 </li><li> 열에 샘플을로드하고 분수를 수집합니다. </li><li> 단계 2.9, 2.15 및 2.16와 분석을 위해 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색 공정에 2.19에서 겔 여과의 분획에서 실행 샘플. 참고 : 목적 단백질의 발현을 확인하는 단계 2.9, 2.15 및 2.16 이전 겔 여과에서 샘플의 SDS-PAGE를 실행하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

우리는 표현 및 재조합 단백질 및 포유 동물 세포에서 다중 서브 유닛 단지 많은 양의 정제 (PEI는 시중에서 판매하는 친 유성 형질 전환 시약보다 훨씬 적은 비용) 간단하고 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 프로토콜 절에서 설명한 바와 같이 고순도의 플라스미드 DNA (280 분의 260 1.8 내지 2.0) PEI와 조합하여 사용하는 경우 최적의 형질 전환 및 발현 효율에 도달 할 수있다. 세포 serum-과 항생제가없는 배지에서 배양해야하므로, 멸균 기술은 엄격히 비용과 시간이 소요되는 감염을 방지하기 위해 계대 및 형질 세포 요구된다. 세포 생존율이 90 % 이상이어야하며 문화가 2.5 × 10 6 세포보다 더 큰 밀도로 성장하지 말아야 / 즉시 형질 전환하기 전에, 이렇게 같이 단백질 생산량을 줄일 ML. 성공적인 형질의 경우, 문화는 단일 또는 분할 세포를 포함해야합니다. 클러스터는 활기에 의해 나누어 질 수있다30 초 (그림 5) OU를 소용돌이로 교반 (20). 공동 - 형질 전환에 사용 된 각 플라스미드의 비율은 연구 복잡한 존재의 화학량 론에 따라 사용자에 의해 변경 될 수있다. 적합한 발현 시간이 설정 될 수 있도록 발현 효율, 관심 단백질에 대해 최적화 될 수있다. 정제는 불필요한 단백질 가수 분해의 위험을 감소시키기 위해 시점의 단백질 샘플 차가운 유지 수행되어야한다. 그들은 종종 감소 된 용해도 및 / 또는 효소 활성의 손실의 결과, 구조적 요소 또는 특정 단백질의 활성 부위를 방해 할 수 있기 때문에, 태그와 정화 버퍼의 선택은 중요하다. 소규모 형질 큰 단백질 복합체의 정제를위한 다른 구조를 테스트하기 위해 특히 유용하다. 오늘, 대체 방법의 큰 다양성 재조합 진핵 생물의 단백질 (표 2)의 표현을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Baculovi곤충 세포에서 발현 RUS 널리 높은 전달 효율과 기타 바이러스 종 6과 비교하여 세포 독성의 결여로 인해 사용된다. 그러나 바이러스의 제조 공정은 시간 소모적이며 불안정성 바이러스 오랜 기간 동안 저장 될 수 없습니다. 한편, 효모 발현 시스템은 높은 단백질 수율 7의 결과, 발효기 배양에서 세포에 매우 높은 밀도의 증가 가능성을 제공한다. 그러나 그들은 여전히​​ 제대로 접과 단백질 파트너와 상호 작용하는 진핵 생물의 단백질에 필요한 번역 후 변형의 전체 다양성이 부족하다. HDAC3은, 예를 들면, 발현 되나 E.를 접을하지 대장균. 293F 세포에서 발현 때, 우리는 공동 억제 (SMRT)와 원핵 세포에서 발견되지 이노시톨 tetraphosphate (IP4) 8의 분자 복잡한에서 활성 효소를 정제 할 수 있었다. 이 방법은 성을 정화하고 결정을 해결하기 위해 우리를 허용했다HDAC1 유사 IP4 구에 의해 활성화되는 NuRD 단지에서 MTA1와 상호 작용 ructure. 이상적으로, 우리는 항상 자연, 생리적 환경에서 진핵 생물의 단백질을 표현하고 싶습니다. 생물 반응기에서 10-12 HEK-293 세포를 EBNA1 이용한 포유 동물 발현 시스템을 설명하고 단백질의 매우 높은 수준을 수득하지만, 이러한 사용이 복잡 할 수있다. 우리의 방법은 박테리아, 효모 및 생물 반응기 시스템의 표현에 대한 간단하고 접근 대안입니다. 발현 방법은 빠르고 롤러 병 또는 플라스크 분위기 5 % CO 2 인큐베이터 진탕 및 표준을 사용하는 대체되는 경우에 특히 고가의 장비의 사용을 요구하지 않는다. 우리는 여러 플라스미드 - 형질을 공동 문화&gt; 1 ㎎ / ℓ의 수율 최대 5 단백질과 복합체를 정화하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 흥미롭게도, 시스템이 안정적으로 잘 작동 단지의 식별을하는 데 도움이됩니다. 예, 예를 들어HDAC1과 Sin3A의 이진 단지의 Pression의 단백질의 제한 수율을 준, 아직 SDS3의 추가는 더 높은 금액을 5 배, 따라서 적절한 구조와 결정화 안정적인 단지 선택에 구조 생물학을 안내 결과.

분자 세포 생물학의 급속한 발전과 의학에서 개선 된 의약품에 대한 지속적인 필요가 구조 생물 학자들이 점점 더 복잡한 단백질 구조를 보면 할 필요를 만들었습니다. 이들은 종종 자신의 정교한 폴딩 및 효소 활동을 지원하기 위해 특정 번역 후 변형, 분자 보호자와 공동 요인을 요구할 수 있습니다. 박테리아 발현 시스템을 사용하여 수득 된 단백질 데이터 뱅크에 존재하는 구조의 대부분 동안, 원핵 이러한 변형의 다수를 수행 할 수없는 많은 진핵 필수적인 공동 요인이 부족하다. 이 작은 신호 전달 물질에 의해뿐만 아니라 핵, 세포 표면과 정교한 접는 기계를 필요로 분비 단백질 활성화 대형 멀티 - 서브 유닛 단지의 연구에 문제가 될 수 있습니다. E.의 숫자 대장균 균주는 이러한 한계 일의 일부를 극복하기 위해 설계되었다. m의 최근에는, 그러나, 사용그들이 안정적으로 다른 시스템 2에 표현 그렇지 않으면 문제가된다 진핵 세포 단백질을 생산하기 때문에 ammalian 발현 시스템이 증가하고있다. 오늘은 화학 매개 형질 전환에 바이러스 성 전달에 이르기까지 다양 다양한 기술을 통해 안정적이고 과도 포유 동물 발현 세포주를 얻을 수있다, 이러한 일렉트로 및 직접 분사 3과 같은 물리적 유전자 전달. 이들 방법 모두가 장점과 단점을 자신의 세트를 가지고 있지만, 그 중 일부는 어느 너무 비싸고 및 / 또는 시간 소모적 인 구조적 연구에 적합하다. 여기에서 우리는 서스펜션 성장 포유 동물 세포에서 구조 생물학에 대한 단백질 복합체를 표현하기위한 매우 간단하고, 빠르고, 저렴하면서도 효율적인 방법을 설명합니다. 접근 방법 (예를 들어, 자유형 HEK 293F 세포) 인간 배아 신장 (HEK) 세포주의 과도 공동 형질을 사용합니다. 이러한 세포는 HEK 293 CE로부터 유도 된LL 라인은, 혈청이없는 배지를 사용하여 고밀도 (예 : 자유형 293 식 매체로서)에 도달, 현탁 배양 물에서 성장하도록 적응된다. 세포는 일시적으로 폴리에틸렌 이민의 분지 버전 (PEI), 엔도 시토 시스 (5)에 의해 숙주 세포를 입력 DNA / PEI 복합체를 형성함으로써 포유 동물 세포 (4)의 넓은 범위에서 작동하는 것으로보고되었다 저렴 중합체 시약을 사용하여 형질 전환된다. 이 방법은 소규모 (30 ml) 및 (300 mL로) 큰 규모의 실험 모두에 적합하며 정제 단백질 복합체의 높은 수준을 생성 할 수있다. 그것은 복잡한 접는 기계, 공동 요인 또는 박테리아, 효모 및 곤충 세포에 의해 수행 할 수없는 특정 번역 후 변형을 필요로하는 단백질을 연구에 특히 유용합니다. 이 프로토콜에서 우리는 Sin3A 전사 억제 복합체의 세 가지 단백질 중앙 지지체의 발현 및 정제를 제시한다. 이 히스톤 구성아세틸 라제 일 (HDAC1), 결함이 음소거 세 (SDS3)의 보호 회로 및 스위치 독립적 인 세 (Sin3A). 정제 된 단지는 높은 처리량 결정화 실험에 사용됩니다.

<table><tbody><tr><td>FreeStyle HEK 293F cells&amp;nbsp;</td><td>LifeTechnologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>LifeTechnologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>SIGMA</td><td>A220</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td><td>Corning</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>Roller bottles with vented caps</td><td>Corning</td><td>01836-02</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, 25 kDa, branched</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Make 0.5 mg/ml stocks in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>Mammalian expression vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Centrifugal Filter Units</td><td>Amicon</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td><td>Amicon</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex&amp;nbsp; 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr></tbody></table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

여기에서 우리는 HDAC1, SDS3, Sin3A 삼원 복합체의이 L (8 × 250 ㎖의 문화) 과도 공동 형질 전환 및 정제를 보여줍니다. HDAC1과 SDS3는 Sin3A의 HDAC 상호 작용 도메인 (HID)를 통해 Sin3A와 상호 작용합니다. 문화의 리터 당 단지의 1 mg의 최대 일반적인 정제 수율. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> 도 변경됨하여 pcDNA 3.1 발현 벡터의 개략도. 플라스미드 Sin3A의 아미노 말단에 친 화성 태그와 TEV 절단 부위를 포함하도록 ECORV 및 효소 EcoRI로 분해 하였다. HDAC1과 SDS3의 태그가 지정되지 않은 버전을 복제하려면 벡터를 KpnI과를 EcoRI로 소화했다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2 SDS-PAGE 정화의 첫 번째 단계를 표시합니다. &quot;결합 단백질&quot;차선의 친 화성 수지에 결합 된 복합체를 보여줍니다. TEV 소화 후, Sin3A-HID에 태그 본 오프 절단하고 겔의 두 번째 및 세 번째 레인에 도시 한 바와 같이 복합체 수지로부터 용출된다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 단백질 - 복합 정제하여 크기 배제 크로마토 그래피의 3 크로마토 그램.이 용액에 이합체를 형성하기 때문에 순수한 복잡한 공극 부피에서 용출합니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> 도 3에 도시 된 겔 여과의 분획을 보여주는도 4 SDS-PAGE. 6 세포 / ㎖ 준비 2.3x10에서 그림 5 트리 판 블루 염색 HEK 293F 세포를 형질 전환합니다. 큰 클러스터가 약 25 초 동안 격렬한 소용돌이로 교반에 의해 나누어 질 수있는 반면 세포는, 단일 또는 분할 세포와 같은 존재해야한다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 문제 </td><td> 가능한 원인 </td><td> 액션 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 낮은 단백질 수율. </td><td> 세포의 낮은 수는 형질. </td><td> 확인 세포 밀도가 1.0 × 10 6의 문화에 형질 전환 반응 혼합물을 추가하기 전에 약합니다. </td></tr><tr><td> 세포는 여러 번 계대 배양되었을 수 있습니다. </td><td> 약 90 패스를 신선한 스톡 세포를 사용하여나이. </td></tr><tr><td> DNA는 성능 저하 또는 불순물의 많은 양이 될 수있다. </td><td> 확인 플라스미드 DNA를 사용하고 있는지 확인하십시오 1.8과 2.0 사이의 280 분의 260 비율을 가지고있다. 아가로 오스 겔에서 DNA를 실행하면 그 품질을 평가하는 것이 좋습니다. </td></tr><tr><td> 단백질 (들)로 표현되는 안정 또는 충분히 용해되지 않습니다. </td><td> 이전에 형질 스케일링 업에 작은 규모의 다른 구조를 테스트합니다. 반드시 태그 관심 단백질 (들)의 구조를 방해하지 않도록해야. </td></tr><tr><td> 세포는 흐린 모양과 특이한 색상 및 / 또는 냄새가. </td><td> 세포는 세균이나 효모에 감염된다. </td><td> 좋은 멸균 기술은 항상 사용할 수 있어야합니다. 층류 후드를 소독하고 감염의 경우에는 세포 배양 공간은 UV-소독하는 문제를 포함 할 수 있습니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 세포는 낮은 가능성을 가지고있다. </td><td> 미디어의 잘못된 산도. </td><td> 확실히 문화 CO 2 5-8%에서 재배되어 있는지 확인항상. </td></tr><tr><td> 세포 3.0x10 6 세포 / ㎖ 이상 농도를 배양하고있다. </td><td> 세포는 2.5 × 10 6 세포 / ㎖ 즉시 형질 전환 이전과 결코 6 10 X 3.0 이상 세포 / ml 이상 밀도로 성장 할 수 없습니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 선호도 정화 작동하지 않았다 </td><td> 단백질 (들) 표시되지 않습니다. </td><td> 위의 내용을 참조하십시오. </td></tr><tr><td> 정제 조건은 잘못 될 수 있습니다. </td><td> (예를 들어, 높은 소금, 낮은 소금, 산도를.) 버퍼 상태를 조정 </td></tr></tbody></table> 표 1 문제 해결. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 시스템 </td><td> 장점 </td><td> 단점 </td></tr><tr><td> E. 콜라이 </td><td><ul><li> 빠른발현 시스템 </li><li> 고 단백질 수율 </li><li> 저렴 </li><li> 동위 원소로 표지 된 단백질의 경제적 인 제조에 적합한 </li></ul></td><td><ul><li> 단백질 접힘이 필요할 수 있습니다 중요한 보호자의 부족 </li><li> 많은 포스트 번역 상 수정의 부족 </li><li> 단백질 기능 및 / 또는 복잡한 어셈블리에 중요한 공동 인자를 결여있다. </li></ul></td></tr><tr><td> P. 파스 </td><td><ul><li> 포스트 병진 변형의 대부분을 수행 할 </li><li> 저렴 </li></ul></td><td><ul><li> 일부 번역 후 변형을받지 못한 </li><li> 단백질 기능 및 / 또는 복잡한 어셈블리에 중요한 공동 인자를 결여있다. </li></ul></td></tr><tr><td> 곤충 세포에서 배큘로 바이러스 발현 </td><td><ul><li> 모든 게시물 번역 수정을 수행 할 수 있습니다 &lt;/ 리&gt; <li> 배큘로 바이러스는 다른 바이러스 균주보다 세포 독성 </li></ul></td><td><ul><li> 전달에 대한 바이러스를 준비하는 데 많은 시간이 소요될 수 있습니다 </li><li> 바이러스는 안정되지 않고, 장기간 저장할 수없는 </li><li> 곤충 세포는 단백질 기능 및 / 또는 복잡한 어셈블리에 중요한 공동 인자를 결여있다. </li></ul></td></tr><tr><td> 포유류 시스템과 생물 반응 장치 </td><td><ul><li> 모든 게시물 번역 수정을 수행 할 수 있습니다 </li><li> 단백질 기능 및 복잡한 조립에 필요한 모든 공동 요인을 제공 할 수 </li><li> 매우 높은 밀도의 수는 세포를 배양 </li><li> 복잡한 접는 기계를 필요로하는 모든 포유 동물의 단백질을 표현할 수 </li><li> 매우 높은 단백질 수율 </li></ul></td><td><ul><li> 생물 반응기를 사용하는 전문 직원이 필요합니다. </li><li> 고가의 장비가 필요합니다. </li><li> 최적화 표현 조건의 시간이 소요될 수 있습니다. </li></ul></td></tr><tr><td> HEK 293F 서스펜션 세포 </td><td><ul><li> 모든 게시물 번역 수정을 수행 할 수 있습니다 </li><li> 단백질 기능 및 복잡한 조립에 필요한 모든 공동 요인을 제공 할 수 </li><li> 복잡한 접이식 기계를 필요로하는 모든 포유 동물의 단백질을 표현할 수 </li><li> 빠르고 직관적 인 형질 전환 프로토콜 </li><li> 생물 반응기 및 / 또는 다른 상업적으로 이용 가능한 형질 감염 시약에 비하여 상대적으로 저렴. </li></ul></td><td><ul><li> 세균의 발현으로 비록 저렴한 가격으로 저렴하지 </li></ul></td></tr></tbody></table> 표 2에 장점 및 주요 발현 시스템의 단점.

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Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

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Research

JoVE Journal

Biology

53.6K 조회수.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

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Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

연구

유전학

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

생체공학

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

공학 세포 투과 단백질

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

생물학

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

면역학 및 감염병학

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

포유 동물 세포에서 인간의 Granzymes의 높은 수율과 비용 효율적인 발현 시스템

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.