우리는이 작업과 레스터 핵심 생명 공학 서비스의 대학에 사용되는 식 구조를 준비 박사 Xiaowen 양 (PROTEX 복제 서비스) 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 BBSRC 학생이기 의해 지원되었다, 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 프로그램 및 수석 수사관 보조금 WT085408 &amp; WT100237 및 BBSRC는 RM31G0224을 부여합니다.

주 : 프로토콜은 따라서 시약의 볼륨과 수량이 비례 적으로 조정해야한다 식의 규모에 적합하다. 적합한 포유 동물 발현 벡터는이 프로토콜에 사용되어야한다. 여기서는 편리 클로닝 (도 1)에서 사용되는 제한 효소의 선택에 따라 친 화성 태그를 포함 또는 배제를 허용하여 pcDNA 3.1 변경됨 발현 벡터를 사용 하였다. 다음의 프로토콜은 대규모 트랜 스펙을 설명한다. 1 L 롤러 병에 1 대규모 문화 / 형질 성장 및 표준 프로토콜에 따라 HEK293F 서스펜션 적응 세포를 유지한다. 일반적으로 30에서 100 ㎖로 선발 문화 250 ML 원뿔 세포 배양 플라스크에서 재배된다. <ol><li> 각각 1 L 롤러 병에 300 ml의 최종 부피로 0.5 × 106 세포 / ml의 세포 종자. 주 : 롤러 병에서 최대 150 ㎖가 최소 수용현탁 배양의 300 ML. 큰 규모의 형질에 대해 여러 병을 사용합니다. </li><li> 세포를 1.0 × 106 세포 / ml의 농도에 도달 할 때까지 37 ° C에서 진탕 인큐베이터에서 24 시간, 120 rpm으로, 5 % CO 2 동안 배양 (세포는 대략 매 24 시간을 분할한다). </li><li> 필터 살균 DNA의 300 μg의 총을 피펫 3 초 동안 적극적으로 PBS 30 ㎖의 소용돌이에 (보충 방법 참조). 참고 : 만 형질 세포 당 DNA의 1 μg의 총을 사용합니다. 두 개 이상의 플라스미드 될 경우 세포에 DNA의 비율이 일정하게 유지되도록 각각의 양을 감소 공동 형질. </li><li> 1.2 ml의 0.5 ㎎의 추가 / 3 초 동안 적극적으로 PBS / DNA 용액 소용돌이에 PEI를 살균 필터링 ML. </li><li> 20 분 동안 실온에서 믹스를 품어. </li><li> DNA를 추가 / PEI는 세포에 혼합 - 1 × 106 세포 / ml (단계 1.3)의 밀도에 있어야한다. </li><li> 공동 - 형질 감염 후, 세포를 부화또한 37 ° C에서 48 시간, 120 rpm으로, 5 % CO 2의 진탕 배양기에서. </li><li> 5 분 동안 3,000 XG에서 세포를 원심 분리 및 -80 ° C에서 펠렛을 저장하여 수확 세포 내 단백질. 참고 : 또는 문화 위의 분위기가 5 % CO 2로 대체되고, 병 뚜껑을 밀봉하는 경우 (비-CO 2) 배양기를 흔들어 표준을 사용합니다. 분위기는 각 통로 (일반적으로 모든 이일)에서 교체해야합니다. </li></ol> 전 세포 추출물에서 2 단백질 복합 정제 이 프로토콜은 플래그 - 태그 된 단백질을 사용하여 핵 착물의 정제를 위해 최적화된다. <ol><li> 으로 세포 펠렛을 해동 ~ 미리 냉장 용해 완충액 40 ㎖ (100 mM 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH가 7.5, 5 % 글리세롤, 0.3 % 트리톤 X-100, 프로테아제 억제제) 문화의 L 당. </li><li> 다시 일시 중지로 pipetting에 의해 여러 번 아래로 펠렛을 (거품 방지 소용돌이를하지 않는합니다). </l난&gt; <li> 철저히 유리 균질기를 이용하여 세포를 다시 일시. 3주기 (15 초, 15 초 Off)에 대한 초음파 처리. 4 ℃에서 25 분 동안 30,000 XG에 원심 분리기와 뜨는을 유지합니다. </li><li> 평형 수지 평형 완충액 (100 mM 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7.5)로 3 회 세척하여 배양 리터당 아가 로스 수지를 충전 방지 플래그 1.25 ML. </li><li> 하나 이상의 50 ㎖의 원심 분리기 튜브의 친 화성 수지와 단계 2.3에서 전체 세포 추출액을 품어 부드럽게 4 ° C에서 30 ~ 120 분 동안 샘플을 회전 할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C, 폐기 상층 액에서 1 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 미리 차게 한 완충액 45 ㎖로 씻어 수지 (100 mM 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH가 7.5, 5 % 글리세롤, 0.3 % 트리톤 X-100). 1 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기 및 상층 액을 제거한다. </li><li> 반복 단계 2.7 높은 염 완충액을 이용하여 낮은 염 완충액 (50 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7로 (300 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH가 7.5, 5 % 글리세롤), 이어0.5, 5 % 글리세롤)과 TEV 쪼개짐 완충액 (50 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7.5, 0.5 mM의 TCEP). 참고 : 각 세척을 확인 완전히 더 이상 수지를 다시 일시 중단하기에 충분한 간단한 즉,이다. </li><li> 수지의 10 ㎕의 샘플을 수집 및 분석을위한 배 단백질 로딩 버퍼 (바인딩 단백질 제어)의 1 부피로 희석한다. 수지에서 항체를 해제 피하기 위해 환원제를 사용하지 마십시오. </li><li> 15 ㎖의 원심 분리 관에 미리 냉장 TEV 절단 버퍼와 전송의 8-10 ML에 수지를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 추가 ~ 40 원래 문화의 L 당 (1 ㎎ / ㎖에서 재고) TEV 단백질 분해 효소 ㎍의 아래로 여러 번을 피펫 팅에 의해 잘 섞는다. </li><li> 단백질 산화를 방지하기 위해 100 % N 2 가스 튜브 분위기를 교체합니다. </li><li> 조심스럽게 4 ℃에서 O / N 회전합니다. </li><li> 10 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기. 적절한 분자량 컷 - 오프와 초 원심 필터에 뜨는을 전송하고 집중500 μL에 이르기까지. </li><li> 농축 된 단백질의 10 ㎕의 샘플을 수집 및 분석을위한 배 단백질 로딩 버퍼의 1 부피로 희석한다. (TEV 제어를 용출액). </li><li> 수지의 10 ㎕의 샘플을 수집 및 분석을위한 배 단백질 로딩 버퍼의 1 부피로 희석한다. 수지에서 많은 양의 항체를 방출 방지하기 위해 환원제를 사용하지 마십시오. (후 TEV 수지 제어). </li><li> 겔 여과 완충액 (50 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7.5, 0.5 mM의 TCEP)와 크기 배제 크로마토 그래피 컬럼을 평형화. </li><li> 0.22 μm의 필터를 통해 단백질을 필터링 </li><li> 열에 샘플을로드하고 분수를 수집합니다. </li><li> 단계 2.9, 2.15 및 2.16와 분석을 위해 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색 공정에 2.19에서 겔 여과의 분획에서 실행 샘플. 참고 : 목적 단백질의 발현을 확인하는 단계 2.9, 2.15 및 2.16 이전 겔 여과에서 샘플의 SDS-PAGE를 실행하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

우리는 표현 및 재조합 단백질 및 포유 동물 세포에서 다중 서브 유닛 단지 많은 양의 정제 (PEI는 시중에서 판매하는 친 유성 형질 전환 시약보다 훨씬 적은 비용) 간단하고 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 프로토콜 절에서 설명한 바와 같이 고순도의 플라스미드 DNA (280 분의 260 1.8 내지 2.0) PEI와 조합하여 사용하는 경우 최적의 형질 전환 및 발현 효율에 도달 할 수있다. 세포 serum-과 항생제가없는 배지에서 배양해야하므로, 멸균 기술은 엄격히 비용과 시간이 소요되는 감염을 방지하기 위해 계대 및 형질 세포 요구된다. 세포 생존율이 90 % 이상이어야하며 문화가 2.5 × 10 6 세포보다 더 큰 밀도로 성장하지 말아야 / 즉시 형질 전환하기 전에, 이렇게 같이 단백질 생산량을 줄일 ML. 성공적인 형질의 경우, 문화는 단일 또는 분할 세포를 포함해야합니다. 클러스터는 활기에 의해 나누어 질 수있다30 초 (그림 5) OU를 소용돌이로 교반 (20). 공동 - 형질 전환에 사용 된 각 플라스미드의 비율은 연구 복잡한 존재의 화학량 론에 따라 사용자에 의해 변경 될 수있다. 적합한 발현 시간이 설정 될 수 있도록 발현 효율, 관심 단백질에 대해 최적화 될 수있다. 정제는 불필요한 단백질 가수 분해의 위험을 감소시키기 위해 시점의 단백질 샘플 차가운 유지 수행되어야한다. 그들은 종종 감소 된 용해도 및 / 또는 효소 활성의 손실의 결과, 구조적 요소 또는 특정 단백질의 활성 부위를 방해 할 수 있기 때문에, 태그와 정화 버퍼의 선택은 중요하다. 소규모 형질 큰 단백질 복합체의 정제를위한 다른 구조를 테스트하기 위해 특히 유용하다. 오늘, 대체 방법의 큰 다양성 재조합 진핵 생물의 단백질 (표 2)의 표현을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Baculovi곤충 세포에서 발현 RUS 널리 높은 전달 효율과 기타 바이러스 종 6과 비교하여 세포 독성의 결여로 인해 사용된다. 그러나 바이러스의 제조 공정은 시간 소모적이며 불안정성 바이러스 오랜 기간 동안 저장 될 수 없습니다. 한편, 효모 발현 시스템은 높은 단백질 수율 7의 결과, 발효기 배양에서 세포에 매우 높은 밀도의 증가 가능성을 제공한다. 그러나 그들은 여전히​​ 제대로 접과 단백질 파트너와 상호 작용하는 진핵 생물의 단백질에 필요한 번역 후 변형의 전체 다양성이 부족하다. HDAC3은, 예를 들면, 발현 되나 E.를 접을하지 대장균. 293F 세포에서 발현 때, 우리는 공동 억제 (SMRT)와 원핵 세포에서 발견되지 이노시톨 tetraphosphate (IP4) 8의 분자 복잡한에서 활성 효소를 정제 할 수 있었다. 이 방법은 성을 정화하고 결정을 해결하기 위해 우리를 허용했다HDAC1 유사 IP4 구에 의해 활성화되는 NuRD 단지에서 MTA1와 상호 작용 ructure. 이상적으로, 우리는 항상 자연, 생리적 환경에서 진핵 생물의 단백질을 표현하고 싶습니다. 생물 반응기에서 10-12 HEK-293 세포를 EBNA1 이용한 포유 동물 발현 시스템을 설명하고 단백질의 매우 높은 수준을 수득하지만, 이러한 사용이 복잡 할 수있다. 우리의 방법은 박테리아, 효모 및 생물 반응기 시스템의 표현에 대한 간단하고 접근 대안입니다. 발현 방법은 빠르고 롤러 병 또는 플라스크 분위기 5 % CO 2 인큐베이터 진탕 및 표준을 사용하는 대체되는 경우에 특히 고가의 장비의 사용을 요구하지 않는다. 우리는 여러 플라스미드 - 형질을 공동 문화&gt; 1 ㎎ / ℓ의 수율 최대 5 단백질과 복합체를 정화하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 흥미롭게도, 시스템이 안정적으로 잘 작동 단지의 식별을하는 데 도움이됩니다. 예, 예를 들어HDAC1과 Sin3A의 이진 단지의 Pression의 단백질의 제한 수율을 준, 아직 SDS3의 추가는 더 높은 금액을 5 배, 따라서 적절한 구조와 결정화 안정적인 단지 선택에 구조 생물학을 안내 결과.

분자 세포 생물학의 급속한 발전과 의학에서 개선 된 의약품에 대한 지속적인 필요가 구조 생물 학자들이 점점 더 복잡한 단백질 구조를 보면 할 필요를 만들었습니다. 이들은 종종 자신의 정교한 폴딩 및 효소 활동을 지원하기 위해 특정 번역 후 변형, 분자 보호자와 공동 요인을 요구할 수 있습니다. 박테리아 발현 시스템을 사용하여 수득 된 단백질 데이터 뱅크에 존재하는 구조의 대부분 동안, 원핵 이러한 변형의 다수를 수행 할 수없는 많은 진핵 필수적인 공동 요인이 부족하다. 이 작은 신호 전달 물질에 의해뿐만 아니라 핵, 세포 표면과 정교한 접는 기계를 필요로 분비 단백질 활성화 대형 멀티 - 서브 유닛 단지의 연구에 문제가 될 수 있습니다. E.의 숫자 대장균 균주는 이러한 한계 일의 일부를 극복하기 위해 설계되었다. m의 최근에는, 그러나, 사용그들이 안정적으로 다른 시스템 2에 표현 그렇지 않으면 문제가된다 진핵 세포 단백질을 생산하기 때문에 ammalian 발현 시스템이 증가하고있다. 오늘은 화학 매개 형질 전환에 바이러스 성 전달에 이르기까지 다양 다양한 기술을 통해 안정적이고 과도 포유 동물 발현 세포주를 얻을 수있다, 이러한 일렉트로 및 직접 분사 3과 같은 물리적 유전자 전달. 이들 방법 모두가 장점과 단점을 자신의 세트를 가지고 있지만, 그 중 일부는 어느 너무 비싸고 및 / 또는 시간 소모적 인 구조적 연구에 적합하다. 여기에서 우리는 서스펜션 성장 포유 동물 세포에서 구조 생물학에 대한 단백질 복합체를 표현하기위한 매우 간단하고, 빠르고, 저렴하면서도 효율적인 방법을 설명합니다. 접근 방법 (예를 들어, 자유형 HEK 293F 세포) 인간 배아 신장 (HEK) 세포주의 과도 공동 형질을 사용합니다. 이러한 세포는 HEK 293 CE로부터 유도 된LL 라인은, 혈청이없는 배지를 사용하여 고밀도 (예 : 자유형 293 식 매체로서)에 도달, 현탁 배양 물에서 성장하도록 적응된다. 세포는 일시적으로 폴리에틸렌 이민의 분지 버전 (PEI), 엔도 시토 시스 (5)에 의해 숙주 세포를 입력 DNA / PEI 복합체를 형성함으로써 포유 동물 세포 (4)의 넓은 범위에서 작동하는 것으로보고되었다 저렴 중합체 시약을 사용하여 형질 전환된다. 이 방법은 소규모 (30 ml) 및 (300 mL로) 큰 규모의 실험 모두에 적합하며 정제 단백질 복합체의 높은 수준을 생성 할 수있다. 그것은 복잡한 접는 기계, 공동 요인 또는 박테리아, 효모 및 곤충 세포에 의해 수행 할 수없는 특정 번역 후 변형을 필요로하는 단백질을 연구에 특히 유용합니다. 이 프로토콜에서 우리는 Sin3A 전사 억제 복합체의 세 가지 단백질 중앙 지지체의 발현 및 정제를 제시한다. 이 히스톤 구성아세틸 라제 일 (HDAC1), 결함이 음소거 세 (SDS3)의 보호 회로 및 스위치 독립적 인 세 (Sin3A). 정제 된 단지는 높은 처리량 결정화 실험에 사용됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle HEK 293F cells&#160;</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:315px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td style="width:119px;">12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td style="width:140px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Roller bottles with vented caps</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">01836-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Polyethylinamine, 25 kDa, branched</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">408727</td>
			<td style="width:292px;">Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mammalian expression vector</td>
			<td style="width:140px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Superdex&#160; 10/300 GL</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-5175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

여기에서 우리는 HDAC1, SDS3, Sin3A 삼원 복합체의이 L (8 × 250 ㎖의 문화) 과도 공동 형질 전환 및 정제를 보여줍니다. HDAC1과 SDS3는 Sin3A의 HDAC 상호 작용 도메인 (HID)를 통해 Sin3A와 상호 작용합니다. 문화의 리터 당 단지의 1 mg의 최대 일반적인 정제 수율. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> 도 변경됨하여 pcDNA 3.1 발현 벡터의 개략도. 플라스미드 Sin3A의 아미노 말단에 친 화성 태그와 TEV 절단 부위를 포함하도록 ECORV 및 효소 EcoRI로 분해 하였다. HDAC1과 SDS3의 태그가 지정되지 않은 버전을 복제하려면 벡터를 KpnI과를 EcoRI로 소화했다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2 SDS-PAGE 정화의 첫 번째 단계를 표시합니다. &quot;결합 단백질&quot;차선의 친 화성 수지에 결합 된 복합체를 보여줍니다. TEV 소화 후, Sin3A-HID에 태그 본 오프 절단하고 겔의 두 번째 및 세 번째 레인에 도시 한 바와 같이 복합체 수지로부터 용출된다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 단백질 - 복합 정제하여 크기 배제 크로마토 그래피의 3 크로마토 그램.이 용액에 이합체를 형성하기 때문에 순수한 복잡한 공극 부피에서 용출합니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> 도 3에 도시 된 겔 여과의 분획을 보여주는도 4 SDS-PAGE. 6 세포 / ㎖ 준비 2.3x10에서 그림 5 트리 판 블루 염색 HEK 293F 세포를 형질 전환합니다. 큰 클러스터가 약 25 초 동안 격렬한 소용돌이로 교반에 의해 나누어 질 수있는 반면 세포는, 단일 또는 분할 세포와 같은 존재해야한다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 문제 </td><td> 가능한 원인 </td><td> 액션 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 낮은 단백질 수율. </td><td> 세포의 낮은 수는 형질. </td><td> 확인 세포 밀도가 1.0 × 10 6의 문화에 형질 전환 반응 혼합물을 추가하기 전에 약합니다. </td></tr><tr><td> 세포는 여러 번 계대 배양되었을 수 있습니다. </td><td> 약 90 패스를 신선한 스톡 세포를 사용하여나이. </td></tr><tr><td> DNA는 성능 저하 또는 불순물의 많은 양이 될 수있다. </td><td> 확인 플라스미드 DNA를 사용하고 있는지 확인하십시오 1.8과 2.0 사이의 280 분의 260 비율을 가지고있다. 아가로 오스 겔에서 DNA를 실행하면 그 품질을 평가하는 것이 좋습니다. </td></tr><tr><td> 단백질 (들)로 표현되는 안정 또는 충분히 용해되지 않습니다. </td><td> 이전에 형질 스케일링 업에 작은 규모의 다른 구조를 테스트합니다. 반드시 태그 관심 단백질 (들)의 구조를 방해하지 않도록해야. </td></tr><tr><td> 세포는 흐린 모양과 특이한 색상 및 / 또는 냄새가. </td><td> 세포는 세균이나 효모에 감염된다. </td><td> 좋은 멸균 기술은 항상 사용할 수 있어야합니다. 층류 후드를 소독하고 감염의 경우에는 세포 배양 공간은 UV-소독하는 문제를 포함 할 수 있습니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 세포는 낮은 가능성을 가지고있다. </td><td> 미디어의 잘못된 산도. </td><td> 확실히 문화 CO 2 5-8%에서 재배되어 있는지 확인항상. </td></tr><tr><td> 세포 3.0x10 6 세포 / ㎖ 이상 농도를 배양하고있다. </td><td> 세포는 2.5 × 10 6 세포 / ㎖ 즉시 형질 전환 이전과 결코 6 10 X 3.0 이상 세포 / ml 이상 밀도로 성장 할 수 없습니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 선호도 정화 작동하지 않았다 </td><td> 단백질 (들) 표시되지 않습니다. </td><td> 위의 내용을 참조하십시오. </td></tr><tr><td> 정제 조건은 잘못 될 수 있습니다. </td><td> (예를 들어, 높은 소금, 낮은 소금, 산도를.) 버퍼 상태를 조정 </td></tr></tbody></table> 표 1 문제 해결. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 시스템 </td><td> 장점 </td><td> 단점 </td></tr><tr><td> E. 콜라이 </td><td><ul><li> 빠른발현 시스템 </li><li> 고 단백질 수율 </li><li> 저렴 </li><li> 동위 원소로 표지 된 단백질의 경제적 인 제조에 적합한 </li></ul></td><td><ul><li> 단백질 접힘이 필요할 수 있습니다 중요한 보호자의 부족 </li><li> 많은 포스트 번역 상 수정의 부족 </li><li> 단백질 기능 및 / 또는 복잡한 어셈블리에 중요한 공동 인자를 결여있다. </li></ul></td></tr><tr><td> P. 파스 </td><td><ul><li> 포스트 병진 변형의 대부분을 수행 할 </li><li> 저렴 </li></ul></td><td><ul><li> 일부 번역 후 변형을받지 못한 </li><li> 단백질 기능 및 / 또는 복잡한 어셈블리에 중요한 공동 인자를 결여있다. </li></ul></td></tr><tr><td> 곤충 세포에서 배큘로 바이러스 발현 </td><td><ul><li> 모든 게시물 번역 수정을 수행 할 수 있습니다 &lt;/ 리&gt; <li> 배큘로 바이러스는 다른 바이러스 균주보다 세포 독성 </li></ul></td><td><ul><li> 전달에 대한 바이러스를 준비하는 데 많은 시간이 소요될 수 있습니다 </li><li> 바이러스는 안정되지 않고, 장기간 저장할 수없는 </li><li> 곤충 세포는 단백질 기능 및 / 또는 복잡한 어셈블리에 중요한 공동 인자를 결여있다. </li></ul></td></tr><tr><td> 포유류 시스템과 생물 반응 장치 </td><td><ul><li> 모든 게시물 번역 수정을 수행 할 수 있습니다 </li><li> 단백질 기능 및 복잡한 조립에 필요한 모든 공동 요인을 제공 할 수 </li><li> 매우 높은 밀도의 수는 세포를 배양 </li><li> 복잡한 접는 기계를 필요로하는 모든 포유 동물의 단백질을 표현할 수 </li><li> 매우 높은 단백질 수율 </li></ul></td><td><ul><li> 생물 반응기를 사용하는 전문 직원이 필요합니다. </li><li> 고가의 장비가 필요합니다. </li><li> 최적화 표현 조건의 시간이 소요될 수 있습니다. </li></ul></td></tr><tr><td> HEK 293F 서스펜션 세포 </td><td><ul><li> 모든 게시물 번역 수정을 수행 할 수 있습니다 </li><li> 단백질 기능 및 복잡한 조립에 필요한 모든 공동 요인을 제공 할 수 </li><li> 복잡한 접이식 기계를 필요로하는 모든 포유 동물의 단백질을 표현할 수 </li><li> 빠르고 직관적 인 형질 전환 프로토콜 </li><li> 생물 반응기 및 / 또는 다른 상업적으로 이용 가능한 형질 감염 시약에 비하여 상대적으로 저렴. </li></ul></td><td><ul><li> 세균의 발현으로 비록 저렴한 가격으로 저렴하지 </li></ul></td></tr></tbody></table> 표 2에 장점 및 주요 발현 시스템의 단점.

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Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

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Biology

53.3K 조회수.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

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A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

곤충 세포에서 재조합 단백질의 생산 mCD1d하는 방법.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

연구

생물학

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...