MRC LMB 결정 화 시설이입니다 친절 하 게 의료 연구 위원회 (영국)에 의해 지원. 우리는 그들의 지원에 대 한 좌 클릭의 회원 감사 합니다: 올가 Perisic (PNAC), 토니 Warne, Fusinita 반 덴 Ent와 팻 에드워즈 (구조 연구), 스티브 Scotcher와 다른 구성원 기계 워크숍의 닐 그랜트와 조 웨스트 모어 랜드 (시각 보조 기능), 폴 하트와 톰 프랫 (그것)입니다. 우리는 또한 조지 스티븐 스와 도널드 Ogg (Alphabiotech, 스티브 엘리엇 (Tecan, 영국), 미첼 스튜어트 및 헤더 Ringrose (해밀턴 로봇, 영국), 폴 해 동, 로버트 루이스 및 Joby 젠킨스 (TTP Labtech, 영국), 폴 리어 (Swissci AG는, 스위스), 감사 하 고 싶습니다. 영국), 닐 윌리엄스 (: Markem Imaje, 영국)와 그레이엄 해리스 (클리블랜드 기관) 기술.

1. 두 개의 완전히 자동화 시스템 (초기 심사)
<ol><li>
시스템 1: 72 96 잘 결정 화 접시의 준비 키트 (좌 판) 상영으로 가득
	<ol>
<li>절차를 수행 하기 전에 시스템의 로봇 초기화 되 고 그들의 제어 소프트웨어는 확인 합니다. 주요 프로그램을 시작 하기 전에 약 30 분 튜브 냉각 캐리어의 냉각 장치를 켭니다.</li>
		<li>플레이트 마감재의 동력된 SBS 캐리어에 테스트 접시를 놓습니다. 플레이트 마감재를 실행 하 고 영화 제대로 적용 된 확인 하십시오. 이 테스트 판 마감재 준비 되었는지 확인을 두 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>그런 다음 액체 처리기의 주요 컨테이너에 이온 물 20 L를 추가 합니다. 작은 컨테이너 (20% 에탄올 솔루션을 rinsing)에서 커플링 삽입을 분리 하 고 주요 컨테이너에 삽입 연결.</li>
		<li>잉크젯 프린터 터치 스크린에 적절 한 화면 이름 (표 1)을 입력 합니다. 그런 다음 열고 회전 목마 회전 하는 회전 목마 문을 닫습니다. 첫 번째 스택 자체를 선물 하는 때 문을 엽니다.</li>
		<li>완전히 로드 22 결정 화 접시, 각각 열 1 방향으로 첫 번째 스택 밖으로. 완전히 동일한 방법으로 다음 두 스택 로드.</li>
		<li>나머지 6 접시 4 스택의 가장 높은 위치에 로드 합니다. 그런 다음, 회전 목마 문을 닫습니다.</li>
		<li>냉각 장치 디스플레이 14 ° c.를 표시 되는지 확인 부드럽게 하 고 반복적으로 1 분 선택한 검사 키트를 반전. 그런 다음 액체 처리기의 전면 패널을 엽니다.</li>
		<li>튜브를 열고 표준 96-잘 레이아웃 (A1, A2, 등등)에 따라 냉각 캐리어에 넣어. 캐리어에서 각 튜브를 배치, 시 같은 96 잘 레이아웃에 쟁반에 그것의 뚜껑을 놓습니다.</li>
		<li>크로스 체크 튜브 위치 하 고 모든 관 수준의 고 캐리어에 정착 합니다. 다음, 전면 패널을 닫습니다.</li>
		<li>액체 처리기 소프트웨어의 '시작' 창에서 '실행 유지 관리'를 선택 하 고 물 내리는 프로그램을 엽니다. 시스템에서 20%의 에탄올을 플러시 액체 분배 팁의 outsides를 세척 하 고 프로그램을 실행 합니다.</li>
		<li>플러시 완료 되 면 '' '시작'으로 돌아가려면 취소를 클릭 합니다. '기존 프로세스 실행'을 선택 하 고 '선택 시작'을 클릭 합니다. 'MRC 키트 분배' 프로그램을 엽니다. 입력 '18' '인스턴스' 구성에서 화면 하 고 프로그램을 실행 합니다.</li>
		<li>처음 4 개의 플레이트 표시, 가득, 고 봉인 시스템을 모니터링 합니다.</li>
		<li>일단 모든 72 접시는 준비 하 고 다시 회전 목마에에서 배치, 작은 컨테이너 주요 컨테이너에서 커플링 삽입을 전환 합니다. '플러시 시작' 프로그램을 실행 (단계 1.1.10 참조).</li>
		<li>냉각 장치를 해제 하 고 빈 삭제 키트 튜브를 상영. 회전 목마에서 72 준비 접시를 조심 스럽게 제거. 잘못 채워진 또는 제대로 밀폐 접시를 삭제 합니다. 10 ° c.에 준비-사용 판 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시스템 2: 20 좌 판에서 단일 샘플에서 결정 화 방울 (100 nL 단백질 + 100 nL 조건)을 설정
	<ol>
<li>첫째, 그 시스템의 로봇에는, nanoliter 디스펜서는 그것의 소프트웨어, 오픈 되며 액체 처리기의 메서드 관리자는 확인 합니다. 메인 프로그램 시작 됩니다 전에 15 분 정도 microtube 냉각 캐리어를 켭니다.</li>
		<li>플레이트 마감재의 동력된 SBS 캐리어에 테스트 접시를 놓습니다. 플레이트 마감재를 실행 하 고 접시 제대로 밀봉을 확인 합니다. 테스트 판 마감재 세 번.</li>
		<li>그런 다음 테스트 플레이트에서 100-nL 방울 테스트 솔루션을 설정 하는 nanoliter 디스펜서를 실행 합니다. 현미경 방울 올바르게 설정 되어 있는지 확인 합니다. Nanoliter 디스펜서 소프트웨어 닫고 갑판에서 스트립 홀더 블록을 제거 합니다.</li>
		<li>그런 다음 사용자 정의 설계 플레이트 홀더 삽입 ( 대표 결과참조 하십시오: LMB에 결정 화 장치 개발) (표 1)의 조건에서 휘발성 약의 높은 상대 수량 좌 판. 접시에서 접착 필름을 제거 합니다.</li>
		<li>액체 처리기 전면 패널을 열고 첫 번째 슬라이딩 캐리어 뒤쪽 갑판에 봉인 되지 않은 접시를 장소 (사업자 슬라이딩 수 있습니다 꺼내 접근의 용이성에 대 한).</li>
		<li>SBS 알루미늄 뚜껑 접시 커버. 캐리어의 후면 왼쪽으로 뚜껑 뚜껑의 반대 코너에 부드러운 압력을 적용 하 여 정착.</li>
		<li>벗기, 슬라이딩 사업자로 로드 하 고 같은 방식으로, 적어도 휘발성 조건에 가장에서 일하고 나머지 19 번호판 커버. 일단 microtube 냉각 캐리어 4 ° C에서 녹색 빛에 의해 표시 된 대로, 그것의 덮개를 제거 합니다.</li>
		<li>단백질 샘플 (표 2)의 (적어도) 440 µ L을 포함 하는 microtube의 뚜껑을 잘라. 있는지 확인 하십시오 샘플 초승달 모양, 위의 아무 거품으로이 액체 감지 시스템에 방해가 됩니다. 튜브 microtube 냉각 캐리어의 위치 1에 배치 합니다.</li>
		<li>어댑터 플레이트 이동 캐리어 앞 액체 처리기 갑판에 PCR 접시를 놓습니다. 다음, 전면 패널을 닫습니다.</li>
		<li>갑판을 로드 한 후 nanoliter 디스펜서 갑판은 분명 스트립 홀더 블록의 50 µ L 팁 스택 뒤 캐리어는 알루미늄 SBS 뚜껑의 명확한 확인 합니다.</li>
		<li>액체 처리기 ' 관리 방법 ' 인터페이스에서 '판 설치'를 선택 합니다. 두 시스템의 초기화를 모니터 하 고 실행된 매개 변수를 입력 합니다. 메서드 관리 인터페이스 (프롬프트, 수치 및 준비에 도움이 팁 관리 시스템)의 지침을 따르십시오.</li>
		<li>필요한 모든 구성 요소는 준비 하 고 다음 과정을 시작 다시 확인 합니다.</li>
		<li>모니터 시스템으로 nanoliter 디스펜서를 첫 번째 접시와 접시 마감재에 연속적으로 접시를 봉인.</li>
		<li>일단 모든 20 접시는 결정 화 방울으로 준비 하 고 자동으로 슬라이딩 통신 사업자에 게 반환, 전면 패널을 열고 플레이트를 부드럽게 제거 합니다. 확인 판 결정 화에 대 한 그들을 저장 하기 전에 제대로 밀봉 된다.</li>
		<li>스토리지에 대 한 액체 처리기의 왼쪽에 그들을 적재 하기 전에 20% 에탄올 솔루션 SBS 뚜껑 청소. PCR 플레이트와는 microtube 삭제 합니다.</li>
		<li>Microtube 냉각 캐리어를 끄고 응축을 닦아. 응축을 더 흡수 냉각기 표면 위에 종이 수건을 남겨 주세요. 다음, 캐리어 덮개를 장착 하 고 전면 패널을 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 조건의 최적화
<ol><li>
주사기-기반 액체 처리기: 결정 화 접시 (4 구석 방법)의 저수지에 농도의 2 개의 선형 그라디언트를 생산.
	<ol>
<li>먼저, 액체 처리기에 고 오픈 소프트웨어 초기화를 확인 합니다.</li>
		<li>'그라데이션' 탭: 필요한 프로그램, 저수지 (표 3)에서 결정 화 접시 유형 및 최종 볼륨을 선택 합니다. [소 프로 파 놀] > 10 %v / v와 [MPD] > 20 %v 포함 하는 솔루션을 사용 하는 경우 / 대 3000 6000에서 '최대 총된 집'에 대 한 고급 설정을 인하 해야 한다
</li>
		<li>주사기를 준비 합니다. 각 주사기 (뾰족한 끝 아래)에 피스톤을 놓고 로봇 머리 아래 지정 된 홈에 주사기의 뒷면을 삽입 합니다. 주사기 (프로그램 제대로 연결 하는 모든 필요한 주사기 만으로 시작 됩니다) 위치에 고정 시계 방향으로 트위스트.</li>
		<li>골짜기를 준비 합니다. 스테인리스 스틸 프레임을 제거 하 고 골짜기를 삽입. 왼쪽에는 4 개의 위치 4 모서리 A, B, C, D. 스위치 ( 표 3, 0.5 mL 죽은 볼륨 표시 볼륨에 추가 된)에 각 주사기에 필요한 솔루션의 볼륨을 표시 ' 설정 ' 탭에 해당 합니다. 그들의 각각 골짜기에 모서리 솔루션을 부 어 하 고 프레임 (프레임 고 위치는 갑판의 정면에 있는 2 작은 자석) 갑판에 배치. 이 단계를 계속 하는 다른 방법 때 그들은 이미 갑판에 배치 하는 골짜기에 솔루션을 부 어 하는 것입니다.
</li>
		<li>자동화 한 SBS 캐리어에 결정 화 접시를 놓습니다.</li>
		<li>'발음'을 클릭 하 고이 단계 (피스톤 중지 된 경우까지 그들의 방법을에) 완료를 기다립니다.</li>
		<li>'실행' 탭으로 전환 하 고 프로그램을 실행 합니다.</li>
		<li>완료 되 면 프로그램, 다시 설정 탭으로 이동 하 고 '제거' 클릭: 시스템 남은 솔루션에서 주사기를 제거 하 고 다음 모든 방법을 최대 피스톤을 리프트. '제거' 대신 '제거'를 요구할 수 있습니다;이 하단에 위치, 발음 같은 주사기와 더 많은 솔루션 준비에 디트로이트를 떠날 것 이다.
</li>
		<li>반시계 그들을 왜곡 하 여 주사기를 제거 합니다.</li>
		<li>주사기와 적절 한 빈 골짜기를 버리십시오 (또는 이온된 수 및 다음 다시 20 %v / v 에탄올 솔루션 린스).</li>
		<li>접시를 봉인 하 고 높은 점성 솔루션 혼합 되는 1000 rpm에서 3 분 또는 10 분 microplate 믹서에 두십시오. 접시는 nanoliter 디스펜서에 결정 화 방울을 설정 하기 위한 준비가 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
프로토콜 1 (미리 첨가제 화면 가득 96 잘 결정 화 접시에 결정 화 방울 설정)을 상영 하는 첨가제
	<ol>
<li>첫째, 초기 농도의 약 10% (분 제 15 mL 액체 처리기 추가 화면에 컨테이너에서 상태를 전송 하는 경우)에 의해 증가 된 상태를 준비 합니다.</li>
		<li>액체 처리기가 작동 준비가 있는지 확인 하십시오. '추가 화면을 첨가제' 단일 플레이트에 대 한 프로그램 (저수지에서 볼륨을 입력: '72 µ L'). 라는, 인물 및 로봇의 선택에 따라 작동 준비가 되었는지 만들기와 정보 관리 시스템 (12 x 1000 µ L 팁 필요) 도움말.
</li>
		<li>-20 ° C 배양 기에서 추가 화면을 검색 하 고 알루미늄 인감 즉시 (플레이트 홀더 사용), 다음 접시 액체 처리기의 갑판에 배치. 프로그램 (접시는 캐리어의 전면 왼쪽에 있는 A1-코너 배치) 세로 레이아웃에 따라 운영 한다. 또한 또한 조건으로 채워진 컨테이너를 놓습니다. 프로그램을 실행 합니다.</li>
		<li>접시의 저수지를 입력 미 판 통에 그것을 놓고 프로그램을 실행 합니다. 재사용을 위한 이온 물, 20% 에탄올 상태의 컨테이너를 씻어.</li>
		<li>
Nanoliter 디스펜서에 방울을 설정합니다. 먼저, 결정 화 접시 (접시 홀더 사용)의 봉인을 해제. 다음, 접시와 8 잘 단백질 스트립 스트립 홀더 블록의 첫 번째 위치에 장소. '설정' 탭 제어 소프트웨어에 갑판에 각 부품의 실제 위치를 표시합니다. 각 로드 드롭 크기 필요 (표 4) 단백질 샘플 스트립의 잘. 방울을 준비 하는 프로그램을 실행.
</li>
		<li>완료 되 면 프로그램, 갑판에서 접시를 제거 하 고 즉시 그것을 봉인 (접시 마감재, 3 인치 넓은 접착 테이프를 사용 하 여). 적절 한 상자에 스트립을 삭제 합니다.</li>
		<li>크기, 모양, 평가 및 저장 하기 전에 현미경 방울의 중심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
프로토콜 (재사용 가능한 첨가제 화면 96 잘 결정 화 접시에 결정 화 방울 설정) 2를 상영 하는 첨가제
	<ol>
<li>먼저, 첨가제 화면 준비: 해당 냉동된 96 잘 셀 문화 접시 40 분 동안 실 온에서 해 동을 떠나. 그런 다음 2 분 1000 x g에서 첨가제 화면 원심.</li>
		<li>조건 (분 제 15 mL 액체 처리기 추가 화면에 컨테이너에서 상태를 전송)을 준비 합니다.</li>
		<li>상태와 결정 화 96 잘 접시의 저수지를 채우십시오. 액체 처리기에 프로토콜 1으로 같은 방식으로 진행, 2.2.2, 단계 하지만 저수지에서 볼륨에 대 한 '80 µ L'을 입력.</li>
		<li>(결정 화 접시와 8 잘 단백질 스트립 스트립 홀더 블록, 표 4의 첫 번째 위치에 추가 화면을 포함 하는 접시) 갑판에 3 구성 요소와 함께 nanoliter 디스펜서에 방울을 설정 합니다.</li>
		<li>알루미늄 시트와 화면을 포함 하는 셀 문화 접시를 봉인 하 고 다시-20 ° C 인큐베이터에에서 배치.</li>
		<li>크기, 모양, 평가 및 저장 하기 전에 현미경 방울의 중심.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

LifeArc가 다음 항목 이후 우리는 이로써 충돌 상업적인 관심 상태: 96-및 48-잘 MRC 번호판, MRC 매달려 드롭 물개, 모 피어스, Pi, ANGSTROM와 LMB 결정 화 화면.

1-준비 및 초기 스크린 판에 저장 된의 사용
가벼운 강 수 또는 단계 분리 저장 하는 동안 일부 튜브에서 발생 하기 때문에 접시에 분배 되 고 전에 키트 상영을 혼합 한다. 화면 두 키트 (2 x 48 튜브)로 구성 되어, 두 번째 키트의 첫 번째 튜브 E1 냉각 캐리어의 위치에서에 배치 됩니다. 때 화면 4 키트 (4 x 24 튜브)로 구성 되어, 두 번째 키트의 첫 번째 튜브에 위치 c 1에에서 배치 됩니다, 세 번째 키트의 첫 번째 튜브 E1 위치에 놓이고 4 키트의 첫 번째 튜브 위치 g 1에에서 배치 됩니다. 그들의 냉각 캐리어에 튜브를 삽입 하는 동안 뚜껑 표준 96-잘 가로 레이아웃에 따라 트레이에 배치 됩니다. 잘 번호 제조 업체에 의해 뚜껑 위에 표시 됩니다, 이후 수 있습니다 검사 경우 모든 튜브 올바른 순서에 배치 되었습니다. 이 또한 접시의 감소 된 수를 채울 때 튜브에 올바른 뚜껑을 대체 하기 도움이 됩니다.
10 ° C, 및 씰링과 악화 조건 및 문제를 일으킬 수 있는 4 ° C에서 스토리지를 피하기 위해 타협에서 미리 채워진된 접시 저장 합니다. 접시를 위한 저장 됩니다 일반적으로 눈에 띄는 비응결 내부 얼굴에는 인감의로 몇 개월. 이것은 LMB05, LMB06, LMB09 및 LMB10 번호판에 대 한 적은 사실 휘발성 약 (표 1)의 상대적으로 높은 농도 가진 조건 포함. 인감의 안쪽에 작은 양의 응축 봉인 하는 효율을 감소 시키고 번호판 봉인 하는 동안 우물 사이의 교차 오염을 일으킬 수 있습니다. 도움이 동안 초기 냉각 응축 방지, 접시는 하룻밤 4 ° C의 찬 룸에 저장 되어 있는 절연된 피크닉 쿨러에 회전 목마에서 먼저 전송할 수 있습니다. 봉인 된 우물 내의 온도 기울기의 개발을 최소화 하 고 따라서 응축을 감소 매우 느린 냉각 전체15. 또한, 일단 판을 10 ° C 인큐베이터에 저장 됩니다, 사내 사용자 지정 SBS 폴리스 티 렌 뚜껑 (표시 되지 않음) 각 스택 상단에 접시에 배치 됩니다.
우리의 미리 채워진된 접시의 전체 집합은 소설, 수용 성, 단백질 샘플에 대 한 큰 초기 화면으로 사용할 수 있습니다. 또는, 더 적은 접시 특정 요구 사항과 일치 하도록 선택할 수 있습니다. 예를 들어 LMB15 및 LMB19 막 단백질 샘플26,27, 특별히 공식화 화면 또는 LMB20 회절 데이터28 의 실험적인 단계적으로 촉진 하기 위하여 무거운 원자와 공식화 화면 (참고 : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">모 피어스 단백질 결정 화 스크린의 공식</a>).
2. 결정 화 방울 설정
2 시스템을 사용 하면 상당한 양의 휘발성 시 약 키트를 심사 해야 처리 처음. 이 뚜껑 처리 및 플레이트 씰링에 영향을 미칠 수 있는 SBS 뚜껑의 고무에 형성 하는 결로 방지 합니다. SBS 뚜껑은 처음 정렬 하는 데 필요한 이유는 접시 위에 때 클리어런스의 비트 ( 프로토콜, 단계 1.2.6 참조). PCR 격판덮개의 우물에서 단백질 죽은 볼륨은 상대적으로 관대 (0.8 µ L, 표 2의 참조 전설). Note는 동등 하 게 관대 한 죽은 볼륨은 고용 8 잘 스트립 (표 4)에 단백질으로 nanoliter 디스펜서를 개별적으로 사용 하는 경우. 그러나 작은 죽은 볼륨 작동 수 있습니다 일부 샘플 팁에 고착 하는, 로봇의 캘리브레이션 약간 정확 하지 않은 될 수 있습니다, 그리고 방을 평소, 등보다 따뜻한 될 수 있습니다. 모든 접근을 통합 하기 위하여 관대 한 죽은 볼륨에 의해 처리 하는 샘플 손실 이어질.
최근 개발 사용 추가 실험의 소형화 및 결정 화 조건 심사에 필요한 샘플의 볼륨을 해당 기술29,30 통합 하 여 크게 줄어들 수 있다 따라서 . 그러나, 더 소형화의 몇 가지 측면 방울31 의 증발 및 microcrystals32의 조작 등 신중한 검토가 필요합니다.
마지막으로, 결정 화 방울 (구형 위-웰 스)에서 설정할 때 원심 분리 (2000 rpm, 1 분) 접시의 일상적인 마지막 단계로 통합 될 수 있습니다. 보다 일관성 있는 크기와 모양 방울 원심에서 결과의 재현성 문제33,34을 줄일 수 있습니다. 확실 하 게 가운데 방울 전체 접시에 걸쳐 필요한 초점 거리와 비슷한 것으로 현미경을 사용 하 여 실험의 최신 평가 쉽게 것입니다.
3. 4 구석 방법의 장점
4 구석 방법의 가장 중요 한 장점은 단순, 오류를 최소화 하 고 간단한 자동화 프로토콜을 용이 하 게입니다. 예를 들어 4 코너 솔루션 항상 동일한 레이아웃에 따라 액체 처리기의 갑판에 배치 됩니다. 또한, 모든 프로그램은 (그림 3C) 솔루션 간의 고정된 비율 기반으로 합니다. 4 코너 솔루션의 수동 준비는 고 점도 될 수 있는 높은 농도에서 솔루션의 자동화 된 처리를 선호. 상대적으로 신속 하 고 정확한 포부/분배는 다음 대부분 액체 클래스의 최적화에 대 한 최소 요구 사항을 액체 처리기의 종류. 그럼에도 불구 하 고, 일부 코너 솔루션 여전히 너무 점성 액체-효율적으로 작동 하도록 시스템으로 운영 하는 로봇에 대 한 수 있습니다. 이 때문에 우리는 액체 처리기 긍정적인 변위 (그림 3B)와 운영에 대 한 하기로 했다.
농도의 2 선형 그라디언트, 뿐만 아니라 세 번째 구성 요소 (즉, 버퍼/첨가제의 집합) 편리한 방법으로 일정 농도에서 시험 수 있다. 이 위해, 다양 한 구성 요소를 제외 하 고 적당 하 게 높은 농도에 코너 솔루션의 핵심 집합의 비교적 큰 볼륨 먼저 준비 된다. 그런 다음이 구성 요소를 포함 하 여 재고 솔루션 최종 농도 조정에 추가 됩니다. 예를 들어 50 mL 4 코너 솔루션의 세트의 처음 보다 10% 높은 농도에서 준비 된다. 이 코어 세트는 다음 4 5 더 작은 하위 집합으로 분할 됩니다. 마지막으로, 다른 버퍼 pH 해결책의 볼륨의 10%는 각 하위 집합에 추가 됩니다.
4. 형식 및 첨가제 스크린의 종류
화면 때문에 그들은 정기적으로 사용 되지 않습니다-20 ° C (그림 4)에서 일반적으로 저장 되 고 휘발성/불안정 한 화합물을 포함. 깊은 우물 블록 (1 mL 스에서)에 저장 하는 냉동된 첨가제 스크린의 사용은 12-24 시간 실 온에서 완전히 해 동 모든 첨가제 솔루션에 대 한 걸릴 것입니다 때문에 일찍 계획 해야 합니다. 또한, 다양 한 사용자가 잠재적으로 교차 오염 문제를 일으키는 동일한 첨가제 화면을 공유 합니다. 마지막으로, 깊은 우물 블록의 높이 그들이 부적 절 한 대부분 nanoliter 디스펜서에 대 한 있습니다. 편리한 솔루션으로 이러한 문제를 회피, 로우 프로 파일 번호판 (그림 4) 화면 깊은 우물 블록에서 전송 한다.
역사적으로, 첨가제 화면 (단일 농도)와 단일 시 약의 광범위 한 다양 한 포함 하는 매우 인기 있는35,36되었습니다. 그러나, 다른 유형의 첨가제 화면 개발 되었습니다 첨가제37 또는 다른 농도38에서 발견 한 첨가제의 감소 된 수의 혼합을 통합 하는. 마지막으로, 상호 보완적인 접근 결정 화39,40이전 샘플에 첨가물의 효과 조사입니다.
5. 더 많은 고려 사항
좋은 연습: 나도 독성 물질을 포함 하는 대부분의 화면 하 고 따라서 적절 한 개인 보호 프로토콜 동안 고용 해야 합니다. 마찬가지로, 로봇의 부품을 이동 (비록 로봇의 대부분은 비상 정지 버튼/시스템) 프로그램이 실행 되는 동안 수동으로 방해 하려고 할 때 특히 부상, 발생할 수 있습니다. 참여, 일반 기술 복잡성 때문에 검사 로봇, 스크린 및 프로그램의 이전 특징 테스트 샘플 재현성의 지속적인된 높은 수준에 대 한 중요 하다.
처리량: 표시로 4000 8000 LMB 사이 격판덮개 생산 시스템 1 연간 (과 이후 초기 심사에 대 한 사용자). 그것은 하지 재고 다량 예상된 회전율은 4-5 개월 후, 어떤 조건으로 훨씬 낮은 때 10 ° C에서 미리 채워진된 접시의 악화 및 증발 하기 시작할 것 이다 적응. 작은-중간 크기 실험실41에 대 한 다른 접근 자동화 프로토콜을 구현 되었습니다.
저장 및 실험 평가: 방울을 준비 하 고, 후 접시에 긴밀 하 게 제어 된 온도 (± 0.5 ° C 최대 편차) 4 개 또는 18 ° C에서 낮은 진동 선반에 저장 됩니다. 실험 감기 빛 소스 현미경을 사용 하 여 평가 됩니다. 그러나 하나 신중 하 게 모든 측면을 고려해 다양 한 자동화 된 이미징 시스템 상업적으로 사용할 수 있습니다: 속도 접시를 스캔 하는 데 필요한 높은 처리량에 대 한 충분 한 것? 크리스탈 이외의 개체 자동 초점을 방해할 것 이다? 이미지의 결과 품질 (특히 주위에 작은 물방울의 가장자리) 자리 매우 작은 결정을 충분 한 것인가? 42 , 43 , 44
결정 화 조건 비교: 처음 얻은 결정의 본질에 대 한 신중한 조사 후 하나 <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB 화면 데이터베이스</a> 또는45c 6 <a href="http://c6.csiro.au/">웹 도구</a>사용 하 여 조건을 통해 트렌드와 유사성을 분석할 수 있습니다.

X 선 결정학은 더 원자 수준에서 생물학 및 질병 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 전진 하 고 이후에 약물 발견1합리적인 접근을 지원 하기 위해 광범위 하 게 적용 됩니다. 이 위해 순화 되며 단백질, DNA, RNA, 다른 ligands, 및 그들의 복합물의 집중된 (2-50 mg/mL) 고분자 샘플 trialed 양식에 그들의 성향을 결정 화2,3 통해 3 차원 격자 주문에 대 한 ,4. 높은 품질 결정 엑스레이 diffract를 얻을 수 있습니다 때 결정 구조 원자 해상도5,6근처에서 해결 될 수 있습니다. 결정적인 소설 샘플을 구체화 하는 조건을 예측할 수 없는 그리고 높은 품질 결정의 수익률은 대개 매우 낮은. 근본적인 이유는 관심의 많은 샘플 불안정 결정 (일반적으로 몇 일) 화에 대 한 해당 날짜 표시줄에 그들을 만드는 도전 생화학 속성. 마지막으로, 과정 샘플 및 샘플 변형, 생성 하 고 그들의 정화 및 결정 화7,8을 최적화 하는 데 필요한 시간에 의해 합성 된다.
결정 화 조건 샘플 용 해도 감소 시키는 비례적으로 솔루션 이며 조건에도 자주 버퍼 및 첨가제 포함. 이러한 시 약의 수백 그들은 낮은 성향 (예: 단백질 또는 핵 산 전개) 샘플 무결성을 방해 하는 결정 화 실험의 매개 변수를 변경 하 잘 적응 된다. 동안 수백만의 결정 화 시 약의 조합 테스트 하는 것이 불가능, 많은 검사 키트-다양 한 전략9와 공식화를 여러 테스트,10 -가능 하다 소형된 시련과 자동화 된 프로토콜. 이 관점에서 가장 의무가 기술이 이다 아마 100-200 nL 방울 전문된 결정 화 접시11 구현 결정 화 조건 (25-250 µ L)를 포함 하는 저수지 위에 작은 우물에 앉아 함께 증기 확산 , 12. 단백질 샘플 및 조건 자주 200의 전체 볼륨에 대 한 1:1 비율로 결합 nL 위 우물에서 물방울을 설정할 때. 로봇 nanoliter 단백질 결정 화는 대체 기술 및 플레이트-오일 일괄13 등 Lipidic 입방 단계14 (최신 하나는 횡단 막 단백질에 구체적으로 적용 되 고 구현 될 수 있습니다. 매우 저조한 물에 용 해).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">MRC LMB에 결정 화 시설</a> 2000 년대 초반에 시작 하 고 우리의 자동화 프로토콜의 초기 요약 200515에 제시 했다. 단백질 결정 화에 대 한 역사적 소개를 제시 했다 하 여도 로봇 nanoliter의 장점의 개요 (다음 일상적인 실험 소설 접근). 고분자의 결정 화 이후 품질 회절 결정16의 수익률 증가 고용 (적합 한) 초기 조건의 광범위 한 다양 한 매우 거의 또는 전혀 유용한 사전 정보를 기본적으로 확률 과정. 게다가, 초기 대형의 자주 간과 이점을 크게 샘플 및 많은 경우에 결정의 최적화에 대 한 필요성을 줄이는 것입니다. 물론, 하나 여전히 나중에 몇 가지 초기 조건의 최적화를 진행 하 고 해야 합니다. 일반적으로, 시 약의 pH 농도 체계적으로 조사 다음. 더 많은 시 약 또한 추가 결정의 매개 변수를 변경 하는 최적화 된 조건으로 도입 수 있습니다. 물론, 하나 신선한 샘플 결정 화를 시도 한다, 따라서 해당 프로토콜 해야 간단 하 고 사용 가능한 언제 든 지.
여기, 두 완전히 MRC LMB (시스템 1과 2)에서 설계 시스템 자동화 되 고 해당 프로토콜을 완벽 하 게 같습니다. 이 두 시스템의 주요 응용 프로그램은 초기 증기 확산 앉아 드롭 결정 화 접시에 의해 심사. 시스템 1 통합 액체 처리기, 재고 번호판 자동된 회전 목마, 플레이트 라벨에 대 한 잉크젯 프린터와는 접착 판 마감재. 시스템 1, 72 96 잘 접시는 상업적으로 이용 가능한 검사 키트 (시험관에 10ml의 시작 볼륨에서 저수지로 조건의 80 µ L)으로 가득, 레이블이 고 봉인. 판 다음 그들이 사용할 수 있는 사용자에 게 언제 든 지 (초기 화면 '좌 판' 이라고 함)으로 10 ° C 인큐베이터에 저장 됩니다.
시스템 2 통합 액체 처리기, nanoliter 디스펜서와 접착 판 마감재. 시스템에서 2, 증기 확산 실험에 대 한 방울 (100-1000 nL) 앉아 조건을 결합 하 여 생산 그리고 20 48 또는 96 잘 접시의 위 우물에서 샘플 미리로 조건. 즉, 1920 초기 심사 조건이 trialed 시스템 2에 20 LMB 접시를 사용 하는 경우.
로봇은 개별적으로 선택한 조건의 최적화에 대 한 및 해당 반자동된 프로토콜도 같습니다. 4 구석 방법17 최적화 화면을 생산 하기 위해 정기적으로 채택 된다. 해당 프로토콜은 처음 4 솔루션 ('A, B, C 및 D')의 수동 준비를 필요합니다. 다음 두 개의 선형 그라디언트 (두 가지 주요 결정 화 에이전트)에 대 한 농도의 결정 화 접시의 저수지에 직접 자동으로 생성 됩니다. 이 위해, 주사기 기반 액체 처리기는 다른 비율에서 4 코너 솔루션 dispenses.
추가 조건 최적화, 잠재적으로 결과 결정18의 속성을 향상 시키는 첨가제 화면 사용할 수 하나. 두 방법 첨가물 심사에 사용할 수 있습니다: 결정 화 접시의 저수지에 방울 (프로토콜 1)을 설정 하기 전에 적절 한 첨가제로 시작 하는 프로토콜 및 다른 프로토콜 추가 화면이 나 옵 직접에 방울 (프로토콜 2).
다른 유용한 개발 자동화 된 고분자 결정 화를 촉진 하기 위하여 MRC LMB에 시작 했다 또한 제공 됩니다. 기본적으로, 결정 화 접시와 관련 된 장치 등을 쌓을 수 있는 사회의 바이오 심사 (SBS)는 뚜껑에 2 시스템을 사용 하 여 조건의 증발을 최소화 해야 합니다.
간단히, 사용자가 기본 기능 및 nanoliter 디스펜서, 잉크젯 프린터와 접착 판 마감재의 유지 보수에 익숙한 가정 합니다. 달리 명시 하지 않는 한 접시 로봇의 갑판에 배치 되도록 잘 A1 ('A1-코너 ')는 플레이트 캐리어의 후면 좌측 구석으로.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Robots</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freedom EVO&#174;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microlab&#174; STAR&#8482;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&#8482; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquito&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dragonfly&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive plate sealer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inkjet printer 9232</td>
			<td>Markem-Imaje</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallization screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-110</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen 2&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-112</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009530</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009531</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Ammonium Sulfate</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-211</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG/LiCl</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-217</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Screen&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-221</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Sodium Chloride</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-219</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG 6000</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-213</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; MPD</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-215</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemFac&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-114</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEG/Ion&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-126</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Natrix&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-116</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen Lite&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Lite screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009536</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009537</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS1</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-101L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS2</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-102L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS3</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-103L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS4</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-104L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS5</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-105L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS6</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-106L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS7</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-107L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS8</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-108L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS9</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-109L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS10</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-110L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Index&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-144</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-107</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 2</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-109</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemStar&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-21</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemSys&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-25</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JCSG-plus&#8482; Suite</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >130720</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-46</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi minimal screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-127</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi-PEG screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; II screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-91</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LMB crystallization screen&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-98</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Additive screens</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT additive screen</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-138</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-93-500</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (500 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-93</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped wells (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100-FX</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped well (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HIPPOCRATES additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>n/a</td>
			<td >48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&#174; III).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other consumables</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well MRC 2-drop plate</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MRC 96T-UVP</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well MRC 1-drop plate&#160; (&#39;MAXI plate&#39;)</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MMX01-UVP&#160;</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &#181;L. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRC hanging drop seal</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive sealing tape</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR4-50</td>
			<td >3-inch wide Duck&#174; HD Clear&#8482; for sealer and manual sealing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive aluminium sheet</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >538619</td>
			<td >Used to reseal additive screens.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ink cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>9651</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Solvent cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>8652</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L tips&#160;</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>235947</td>
			<td >System 2 (STAR&#8482; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&#8482; tips in disposable stacks.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent container</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>194052</td>
			<td >Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate</td>
			<td >Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td >AB-2150</td>
			<td >System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&#174;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microsyringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03020</td>
			<td >Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&#174; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >strip-holder block</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >3019-05013</td>
			<td >SSB device for the Mosquito&#174; strips, aka &#39;4-way Reagent Holder&#39;.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03110</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03100</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL syringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07100</td>
			<td >Syringe body and piston for the Dragonfly&#174; liquid handler. Pack of 100.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troughs/Reservoirs</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07103</td>
			<td >Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&#174;. Pack of 50.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital microplate shaker</td>
			<td>CamLab Limited</td>
			<td>n/a</td>
			<td >Variomag&#174; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate mixer</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>3121-01015</td>
			<td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

높은 품질 결정 엑스레이 diffract를 얻을 수 있습니다 때 결정 구조 원자 해상도 근처에서 해결 될 수 있습니다. 그러나 단백질, DNAs, RNAs, 그리고 그들의 복합물을 구체화 하는 조건을 수 없습니다 전망 했다. 고용 조건의 광범위 한 다양 한 품질 회절 결정의 수확량을 증가 하는 방법 이다. 2 완전 자동화 된 시스템 nanoliter 방울에 증기 확산 하 여에서 MRC 연구소의 분자 생물학 (케임브리지, 영국, MRC-LMB) 1920 초기 조건에 대 한 결정 화 심사를 용이 하 게 개발 되었습니다. 반자동된 프로토콜 또한 pH, 시 약의 농도 변경 하 여 또는 잠재적으로 결과 결정의 속성을 향상 시키는 첨가제를 도입 하 여 조건을 최적화 하기 위해 개발 되었습니다. 모든 해당 프로토콜에에서 대해서 자세히 설명 하 고 간단히 설명 됩니다. 그들은 편리 하 고 고효율 고분자 결정 화는 다중 사용자 기능에는 사용자가 그들의 실험의 주요 매개 변수 제어를 제공 하는 동안 활성화 함께 찍은.

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Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

자동화 시스템 및 스크린의 많은 수의 일상적인 준비에 대 한 프로토콜 및 nanoliter 결정 화 방울 증기 확산 실험에 대 한 설명 이며 토론.

분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.2K 조회수.  Medical Research Council. 자동화 시스템 및 스크린의 많은 수의 일상적인 준비에 대 한 프로토콜 및 nanoliter 결정 화 방울 증기 확산 실험에 대 한 설명 이며 토론.

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Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

연구

생화학

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice of detergent is critical, because it affects both the stability and monodispersity of the complex. We recently determined the crystal structure of an active state of bovine rhodopsin coupled to an engineered G protein, mini-Go, at 3.1 &#197; resolution. Here, we detail the procedure for optimizing the preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. Dark-state rhodopsin was prepared in classical and neopentyl glycol (NPG) detergents, followed by complex formation with mini-Go under light exposure. The stability of the rhodopsin was assessed by ultraviolet-visible (UV-VIS) spectroscopy, which monitors the reconstitution into rhodopsin of the light-sensitive ligand, 9-cis retinal. Automated size-exclusion chromatography (SEC) was used to characterize the monodispersity of rhodopsin and the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) confirmed the formation of the complex by identifying a 1:1 molar ratio between rhodopsin and mini-Go after staining the gel with Coomassie blue. After cross-validating all this analytical data, we eliminated unsuitable detergents and continued with the best candidate detergent for large-scale preparation and crystallization. An additional problem arose from the heterogeneity of N-glycosylation. Heterologously-expressed rhodopsin was observed on SDS-PAGE to have two different N-glycosylated populations, which would probably have hindered crystallogenesis. Therefore, different deglycosylation enzymes were tested, and endoglycosidase F1 (EndoF1) produced rhodopsin with a single species of N-glycosylation. With this strategic pipeline for characterizing protein quality, preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex was optimized to deliver the crystal structure. This was only the third crystal structure of a GPCR&#8211;G protein signaling complex. This approach can also be generalized for other membrane proteins and their complexes to facilitate sample preparation and structure determination.

This report describes screening of different detergents for preparing the visual GPCR, rhodopsin, and its complex with mini-Go. Biochemical methods characterizing the quality of the complex at different stages during purification are demonstrated. This protocol can be generalized to other membrane protein complexes for their future structural studies.

성공적인 결정화를 위한 시각적 GPCR-mini-G 단백질 신호 복합체의 전략적 스크리닝 및 특성화

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

살아있는 세포의 원형질막에서의 분자 확산 분석을위한 스팟 변이 형광 상관 분광법

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is presented with detailed step-by-step instructions, figures, and videos for smooth data collection.

We present a comprehensive guide to fixed target sample preparation, data collection, and data processing for serial synchrotron crystallography at Diamond beamline I24.

다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are available and display reproducibly high-resolution X-ray diffraction properties, crystallography is among the most preferred methods for fragment screening because of its sensitivity. Additionally, it is the only method providing detailed 3D information of the binding mode of the fragment, which is vital for subsequent rational compound evolution. The routine use of the method depends on the availability of suitable fragment libraries, dedicated means to handle large numbers of samples, state-of-the-art synchrotron beamlines for fast diffraction measurements and largely automated solutions for the analysis of the results.
Here, the complete practical workflow and the included tools on how to conduct crystallographic fragment screening (CFS) at the Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB) are presented. Preceding this workflow, crystal soaking conditions as well as data collection strategies are optimized for reproducible crystallographic experiments. Then, typically in a one to two-day procedure, a 96-membered CFS-focused library provided as dried ready-to-use plates is employed to soak 192 crystals, which are then flash-cooled individually. The final diffraction experiments can be performed within one day at the robot-mounting supported beamlines BL14.1 and BL14.2 at the BESSY&#160; II electron storage ring operated by the HZB in Berlin-Adlershof (Germany). Processing of the crystallographic data, refinement of the protein structures, and hit identification is fast and largely automated using specialized software pipelines on dedicated servers, requiring little user input.
Using the CFS workflow at the HZB enables routine screening experiments. It increases the chances for successful identification of fragment hits as starting points to develop more potent binders, useful for pharmacological or biochemical applications.

Crystallographic fragment screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin is performed using a workflow with dedicated compound libraries, crystal handling tools, fast data collection facilities&#160;and largely automated data analysis. The presented protocol intends to maximize the output of such experiments to provide promising starting points for downstream structure-based ligand design.

헬름홀츠 젠트럼 베를린에서 결정화 조각 검사를 위한 워크플로우 및 도구

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography services to users worldwide. The HTX lab has a strong focus in the development of new methods in macromolecular crystallography. Through the combination of a high throughput crystallization platform, the CrystalDirect technology for fully automated crystal mounting and cryocooling and the CRIMS software we have developed fully automated pipelines for macromolecular crystallography that can be remotely operated over the internet. These include a protein-to-structure pipeline for the determination of new structures, a pipeline for the rapid characterization of protein-ligand complexes in support of medicinal chemistry, and a large-scale, automated fragment screening pipeline enabling evaluation of libraries of over 1000 fragments. Here we describe how to access and use these resources.

Here, we describe how to use the automated macromolecular crystallography pipelines for protein-to-structure, rapid ligand-protein complex analysis and large-scale fragment screening based on the CrystalDirect technology at the HTX Laboratory in EMBL Grenoble.

그르노블의 EMBL HTX 시설의 자동 결정화 파이프라인

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...