저자는 어떤 승인이 없습니다.

1. TTFields In Vitro Application System -베이스 플레이트 및 접시 유지 관리 <ol><li> 흐르는 수돗물에서 접시와 접시 커버를 헹구십시오. 그런 다음 탈 이온수로 헹구고 공기가 마른면이 아래를 향합니다. </li><li> 이전의 실험에서 화학 요법 제 / 약물을 접시에 첨가 한 경우, 각 접시에 5 %의 가벼운 세제 용액을 채우고 밤새도록 두십시오. <ol><li> 접시 안의 세제가 묻지 않도록 흐르는 수돗물에서 철저히 헹구십시오. 접시와 접시 커버를 탈 이온수로 헹구고 공기가 마른면이 아래로 향하게합니다. </li></ol></li><li> 뚜껑이있는 깨끗하고 건조한 접시를 멸균 봉투에 넣습니다. 봉인하고 접시를 아래로 향하게하여 봉투를 고압 증기 멸균기에 넣으십시오. 121 ° C 이하에서 30 분간 오토 클레이브합니다. </li><li> 건식 프로그램에 오토 클레이브를 넣고 오토 클레이브 도어를 열고 30 분 동안 접시를 말립니다. </li><li> 70 % 에탄올로 가볍게 적신 천으로 밑판을 닦으십시오. </li> &lt;/ OL&gt; 2. 실험 설정 참고 :이 프로토콜에서 사용되는 모든 장비 및 재료는 재료 목록에 설명되어 있습니다. 멸균 조건이 유지되는 동안 모든 단계 이하 층류 캐비닛 내부에서 수행되어야한다. <ol><li> 섹션 1에서 설명 된 바와 같이 깨끗하고 멸균 TTFields 요리 및 커버를 준비 가볍게 70 % 에탄올로 적신 천으로 기판을 닦아 낸다. </li><li> 접시에 가볍게 누르면서 상기베이스 플레이트의 핀에 세 접시 잠금 가장자리까지 약 5mm 시계 방향으로 회전하여 기판 상에 덮개와 TTFields 요리를 설치한다. 각 접시의 바닥에 멸균 22 mm의 커버 슬립 (처리 된 플라스틱 또는 유리)를 놓는다. </li><li> 완전 성장 배지에서 세포 현탁액 (U-87 MG 및 F98에 대한 둘 베코 변성 이글 배지를 준비;를 RPMI A2780 및 OVCAR-3]에 기재된 바와 같이 보충 재료 목록). 참고 : CE1 농도는 세포 유형과 실험 기간에 따라 다르며, 80 % -90 %의 합류 세포 성장은 실험이 끝날 때까지 초과되어서는 안됩니다. 주의 : 사람의 세포주는 생물학적 위험을 나타낼 수 있으므로 적절한 안전 조치를 취해야합니다. </li><li> 접시의 뚜껑을 덮고 각 coverslip의 중심에 드롭으로 세포 현탁액 (배증 시간에 따라 72 시간 실험 200 μL에 일반적으로 5,000-20,000 셀) 200 μL를 놓으십시오. </li><li> 세포가 고착 될 때까지 CO2 배양기에서 37 ° C로 인큐베이션하십시오. 이 단계에서 하룻밤 배양이 가능합니다. </li><li> 200 또는 1,000 μL 피펫을 사용하여 액체 방울을 토출하십시오. </li><li> 부드럽게 각 접시를 채우기 위해 완벽한 성장 매체 2 ML 피펫. 멸균 팁을 사용하여 피펫 팅하고 부드럽게 슬라이드 아래에 붙잡힌 기포를 풀어 coverslip 가장자리를 누릅니다. </li><li> 그들의 뚜껑을 가진 접시를 덮고 그 (것)들을 안으로 두십시오TTFields 처리 개시까지 37 ° C에서 CO 2 인큐베이터 IDE. </li></ol> 3. TTFields 응용 프로그램 <ol><li> 냉장 CO 2 인큐베이터에 부착 TTFields 요리베이스 플레이트를 옮긴다. 참고 : 체외 TTFields 응용 프로그램이 열을 발생시킵니다에서; 따라서, 냉장 인큐베이터는 요리의 온난화 보상하기 위해 필요합니다. TTFields 높은 강도는 더 많은 열을 생성하며 배양기 낮은 주위 온도를 (표 1 참조)를 필요로한다. TTFields 애플리케이션 인큐베이터 온도는 18-30 ℃의 범위에있을 때, 임상 적 TTFields 강도를 얻을 수있다. </li><li> 베이스 플레이트에 플랫 케이블의 암 커넥터를 연결합니다. 에 TTFields 발생기를 전환합니다. </li><li> 생체 응용 시스템 소프트웨어의 TTFields를 시작하고 실험 설정을 선택합니다. <ol><li> 새로운 실험을 정의합니다. 특급의 이름을 입력컴퓨터 화면의 소프트웨어 사용자 인터페이스에서 실험 주체와 실험자를 선택합니다. 각 접시 또는베이스 플레이트의 주파수 및 목표 온도를 조정하십시오. </li></ol></li><li> 소프트웨어를 사용하여 TTFields 응용 프로그램을 시작하십시오. </li><li> 모든 요리가 제대로 연결되고 모니터에 하늘색으로 표시되는지 확인하십시오. 접시에 빨간색 프레임이 원을 그리면 (제대로 연결되어 있지 않음을 의미) 부드럽게 아래로 누르고 연락처가 복원되고 접시가 하늘색으로 나타날 때까지 앞뒤로 천천히 회전합니다. </li><li> TTFields 체외 진단 시스템을 최대 24 시간 동안 작동 상태 로 두십시오. </li><li> 실험이 종점에 도달하면 소프트웨어에서 END EXPERIMENT 버튼을 클릭하여 실험을 중지하고 5 단계로 진행합니다. 그렇지 않은 경우 PAUSE 실험을 클릭합니다. </li><li> 베이스 플레이트에서 플랫 케이블 커넥터를 분리하십시오. 인큐베이터의 접시로 바닥 판을 층류 캐비닛으로 옮긴다. </li><li> 모든 접시에 매체를 넣으십시오.ES마다 24 시간 및 냉장 인큐베이터로 기판을 반환. 플랫 케이블을 사용하여 발생기에베이스 플레이트를 연결합니다. 계속 버튼을 클릭하여 실험을 계속합니다. </li></ol> 4. 제어 샘플 참고 : TTFields 응용 프로그램을 제외한 TTFields 처리 된 세포와 유사한 조건에서 대조군 세포를 성장. <ol><li> 동일한 서스펜션과 TTFields 처리 된 샘플을 도금에 사용되는 유사한 표면 플레이트 대조 시료. </li><li> 37 ℃에서 CO2 인큐베이터에서 제어 요리를 놓는다. </li><li> 요리의 매체에게 TTFields 처리 접시 매체 환경에 맞는 24 시간마다 교체합니다. </li></ol> 5. 실험 종료 <ol><li> 최종 실험을 클릭하면, 시스템에서 모든 레코드를 검색하기 위해 소프트웨어를 기다리고 컴퓨터에 기록을 저장합니다. </li><li> 온도, 전류, 저항 로그 F를 검토 보고서 버튼을 사용하여각베이스 플레이트 세틸 모든 음식이 실험 계획에 따라 처리되었는지 확인한다. 참고 : 모든 보고서 및 로그 실험이 끝난 후 컴퓨터에 저장되어 언제든지 검토 할 수 있습니다. </li><li> TTFields 생성기를 끕니다. </li><li> 상기베이스 플레이트로부터 플랫 케이블을 분리하고 배양기로부터 제거한다. </li><li> 아래 세라믹 접시 눌러 제거하고베이스 플레이트에서 잠금을 해제 시계 반대 방향으로 접시를 돌립니다. </li><li> 층류 캐비닛에 요리를 가지고 무균 커버 슬립을 제거합니다. 상기 검사 및 평가를위한 신선한 배지 또는 인산 완충 식염수 (PBS)를 함유하는 페트리 접시를 멸균로 전송. </li></ol> TTFields 효과의 평가 6 참고 : TTFields &#39;효과는 여러 가지 방법으로 측정 할 수있다. 처리되지 않은 대조군 세포에 처리 한 세포를 비교하려면 다음 방법 중 하나 이상을 사용합니다 : <ol><li> 셀 수<ol><li> 각 coverslip - 포함 접시에서 매체 / PBS를 제거합니다. </li><li> 각 접시에 0.25 % 트립신 / EDTA 0.5 ML을 추가하고 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 최대 10 분 ( 즉, 세포가 coverslip 표면에서 분리 시작할 때까지)에 품어. </li><li> 트립신을 중성화하고 위아래로 부드럽게 pipetting하여 세포를 다시 일시 중지 완전한 성장 매체 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 낮은 세포 농도 ( 즉, 약 20,000 세포 / ML) 계산과 호환되는 표준 세포 계수 기술을 사용하여 세포를 세십시오. </li></ol></li><li> 클로 론젠 지아 분석법 <ol><li> 신선한 완전한 성장 매체의 2 ML을 포함하고 새로운, 살균 페트리 접시 또는 6 잘 접시에 각 접시에서 세포 (접시 당 100-500 셀)의 비슷한 번호를 접시. </li><li> ~ 50 세포로 구성된 식민지가 형성 때까지 1-3 주 (각 세포 라인의 속성에 따라) 37 CO 2 배양기에서 품어 ° C. 세포 평가광학 현미경에 의한 식민지 당 번호입니다. </li><li> 매체를 제거하고 PBS로 씻어. </li><li> PBS를 제거하고 빙냉 메탄올 (1ml)에 추가한다. 10 분 이상 -20 ° C에서 품어. </li><li> 메탄올을 제거합니다. </li><li> 크리스탈 바이올렛 용액 (0.1 % w / 물 25 % V / V의 메탄올 V)를 첨가하고, 20 분 동안 배양한다. 주의 : 크리스탈 바이올렛은 잠재적 인 발암 물질; 크리스탈 바이올렛과 함께 작업하는 동안 장갑을 사용합니다. </li><li> 상기 크리스탈 바이올렛을 분리, 탈 이온수로 3 회 세척하고, 공기 건조. </li><li> 각각의 접시에 형성 식민지를 계산합니다. </li></ol></li></ol>

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Porat Yaara, Giladi Moshe, Schneiderman S. Rosa, Blot Roni, Shteingauz Anna, Zeevi Einav, Munster Mijal, Voloshin Tali, Kaynan Noa, Tal Orna 및 Kirson D. Eilon D는 이스라엘의 Novocure Ltd에서 유급 직원입니다. Weinberg Uri는 Luzern의 Novocure GmbH의 유급 직원입니다. Yoram Palti는 NY의 Novocure Ltd의 주주입니다.

TTFields는 1 , 2 , 8 , 9 , 10 , 17 번 전기장을 적절하게 조정 한 지속적인 응용을 바탕으로하는 새로운 항 종양 치료법입니다. 항 종양 효능을 극대화하는 것은 모든 치료 양식에있어 바람직한 결과입니다. 따라서 암세포 성장 억제의 모든 추가 백분율에 대한 &quot;싸움&quot;은 환자의 장기적인 임상 결과에 유의 한 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 TTFields 응용 프로그램의 필수 연속 특성 및 그 결과 누적 효과 때문입니다. TTFields 적용 극대화는 여러 가지 방법으로 달성 할 수 있습니다. (1) 전계 강도를 높이고 (1), (2) 치료 기간을 길게하십시오 ( 5) , (3) 가장 효과적인 조합을 찾는 것최적의 주파수 1 , 2 , 4 , 6 , 7을 정의하는 다른 치료 양식 18 , 19 , (4)를 사용하십시오. 종양 부위의 전계 강도를 최대화하는 것은 환자 피부에서 어레이의 위치를 ​​최적화함으로써 달성된다; 이것은 환자의 개별적인 해부학에 근거하여 종양에 최대 전계 강도를 전달할 수있게 해줍니다. 치료 기간 연장은 대부분 환자의 치료법 준수에 달려 있습니다 (하루 18 시간 이상). 다른 치료법과 적절한 조합을 찾고 최적의 빈도를 결정하는 것은 현재 TTFields 치료 결과에 대한 유효성이 입증 된 마커가 없기 때문에 시험 관내 결과에 크게 의존합니다. 이 작업에서 우리는 실험적 procedures는 TTFields 체외 응용 시스템을 이용하여 암 세포주에 대한 최적 TTFields 주파수를 결정하는 데 필요한. 여기에 설명 된 방법은 잠재적 TTFields 다른 암 치료 방법 (예를 들어, 화학 요법 제 또는 방사선)의 조합을 선별하고, 각 특정 조합 치료 TTFields 관리에 대한 최적의 주파수를 결정하는 데 사용될 수있다. 이전의 간행물에 맞춰, 여기 나타낸 결과는 양쪽 교종 세포 및 난소 암 세포의 치료를위한 최적의 주파수가 200 kHz의 1, 7임을 보여준다. 본 연구에서 우리는 클론 원성 잠재 성을 감소시키는 최적 TTFields 주파수가 최대 세포 독성 효과를 유도하는 주파수와 관련되는 것을 처음으로 보여 주었다. 이 연구에서 사용되는 방법은 TTFields의 영향을 정량화하는 (즉, 세포 독성 및 클론 원성)을치료 결과를 평가할 수있는 가능한 많은 표준 종료점 분석 중 단지 2 가지만을 사용하십시오. 추가 치료 결과 검사는 다음을 포함합니다 : (1) 고정, 염색 및 세포 내 구조의 시각화를 위해 현미경 위에 세포가 도금되는 coverslips 장착; (2) TTFields 자체 또는 새로운 일회용 접시에 coverslip을 옮긴 후에 단백질 및 RNA 추출물의 분석을 수행합니다. 및 (3) 유동 세포 계측법 분석을 위해 염색 된 세포를 트립신 처리한다. 주의 깊은 실험 계획은 TTField를 전달한 후 치료 결과에 영향을 줄 것입니다. 중요한 단계는 민감한 세포주에 적용될 때 너무 높은 강도로 인해 실험을 통해 세포 증식이 지나치게 성장하지 않고 적절한 전계 강도를 사용하도록 보장하는 것입니다. 최적의 주파수. 반대로, TTField는 매우 낮은 강도로 적용됩니다.덜 민감한 세포주에서는 고유 한 변이에 의해 가려 질 수있는 작은 영향을 초래할 수 있습니다. 치료 로그는 실험 전반에 걸쳐 각 접시에 대한 온도 안정성, 전류 및 저항에 대한 중요한 정보를 조사해야합니다. 치료 시작시 결함있는 접시를 교체하고 원하는 치료 매개 변수를 충족시키지 못한 접시에서 데이터를 제외하면 복제 간 변동성을 최소화 할 수 있습니다. 요약하면, TTFields는 임상 설정 8 , 9 , 10 에서 이미 효능과 안전성을 입증 한 새로운 항암 치료 요법입니다. 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 시험관 환경 에서 TTField를 테스트하면 임상 환경에서 TTFields 치료 매개 변수를 최적화 할 수 있으며 기본 메커니즘에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다.

종양 치료 필드 (TTFields)은 교 모세포종의 홍반 및 잠재적으로 다른 암 종류의 치료를위한 항 유사 분열 양상이다. 필드는 암 (1, 2)의 영역에 교번 전계를, 저 강도의 연속 프로그램 (1-3 V / cm) 중간 주파수 (100 내지 500 kHz에서)를 통해 전달된다. 시험 관내 및 생체 내 TTFields 애플리케이션은 다양한 암 세포주의 성장 및 여러 동물 종양 모델 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7에서 종양의 진행을 모두 억제하는 것으로 나타났다. 아교 모세포종과 비소 세포 폐암을 포함하여 고형 종양 환자에서 파일럿 임상 시험 더 큰 무작위 연구 demonst이연속 TTFields 응용 프로그램 8, 9, 10의 안전성과 효능을 평가. TTFields의 효능 인 것으로 밝혀졌다 : (1) 주파수 별 상이한 기원 1, 2, 4, 5, 6에서 세포주의 세포 수의 최대 감소로 이어지는 특정 최적의 주파수를 갖는, 7; (2) 전계 강도 의존성 약 1 V / cm보다 더 강력한 강도 1, 2, 7, 11 활동 최소 임계치와; 처리 시간은 5 이상이었을 때 (3) 개선; (4) 더 높은 2 방향 TTFields 각 OTH 수직으로인가 될 때ER, 단일 방향 (1)로부터인가 전계에 비해. 위의 연구 결과를 바탕으로, TTFields 종양 침대 (12), (13)의 전기장 강도를 극대화하기 위해 환자의 피부에 국소 트랜스 듀서 어레이의 2 개 세트를 사용하여 오랜 기간에 대한 환자에게 적용 할 수 있습니다. 체외에서 암 세포에 TTFields의 효과를 공부하는 것은 현재 특정 종양 유형에 적용 할 수있는 최적의 주파수를 결정하는 유일한 방법을 제공합니다. 최적의 주파수에 대한 테스트는 세포 배양에 (RMS) 제곱 평균 100 ~ 500 kHz의 범위의 상이한 주파수의 애플리케이션에 대한 최대 3 V / cm의 강도를 루트로 할 수있는 장치가 필요하다. TTFields 응용 프로그램이 열을 발생로서, 응용 시스템은 온도에 엄격한 제어를 유지하면서 과도한 열을 방출 할 수있는 능력이 필요합니다. 여러 가지 장치 WER수년에 걸쳐 개발 된 전자는 세포 배양 1, 2, 5, 14, 15, 16 TTFields 응용 프로그램을 허용합니다. 이러한 모든 장치에서 사용되는 전극 등의 전자 전극 표면에서 교환 매체 (1)에 유독 금속 이온의 방출과 같은 전도성 전극의 사용과 관련된주의 사항을 방지하기 위해 절연 하였다. 시험 다양한 TTFields 응용 시스템의 주요 차이점은, 예를 들어 절연체 (2), 14, 15, 16의 얇은 필름 또는 고 유전율 재료로 절연 된 금속 배선으로 이루어지는 하나의 전극 (함께 사용될 전극 절연막의 유형 납 마그네슘 나이 오 베이트 - 납 titanate (PMN-PT)) 6 . 절연 와이어 전극은 TTField 애플리케이션에 비교적 간단하고 비용 효율적인 솔루션을 제공하지만 1V / cm 임계 값 이상의 유효 전계 강도를 달성하고 셀 도금에 사용할 수있는 표면에 필요한 고전압, 전극 사이의 거리가 상대적으로 작기 때문이다. 고 유전 상수 물질을 사용하여 절연 된 전극을 기반으로 한 시스템은 특별한 설계 및 제조 기능을 필요로하지만, 고전압을 필요로하지 않으며 전극 사이의 세포 성장을위한보다 넓은 영역을 제공 할 수 있습니다. 이 연구 에서 사용 된 TTFields in vitro 응용 시스템은 후자의 시스템 계열에 속하며 핵심 단위는 고유 전율 세라믹 (PMN-PT)으로 구성된 페트리 접시 (TTFields dish, 그림 1 참조)입니다. 두 쌍의 전극이 외벽에 수직으로 인쇄됩니다.2 방향에서 전기장을 가할 수 있도록 TTFields 접시가 있습니다. 전극은 정현 파형 발생기와 증폭기에 연결되어 50-500 kHz의 주파수 범위에서 TTField를 적용 할 수 있습니다. 과도한 열을 분산시키기 위해, TTFields 요리는 접시 온도의 지속적인 모니터링과 시스템에 의해 적용된 전압 조정을 사용하여 수행되는 중온 조절과 함께 냉각 된 인큐베이터 내부에 보관됩니다. 실제로, 인큐베이터를보다 낮은 온도로 설정하면, 시스템은 접시 내의 목표 온도가 달성 될 때까지 전압을 증가시키기 때문에,보다 높은 전계 강도를 유도 할 것이다. 접시 내의 온도와 인큐베이터 온도의 차이는 온도 구배에 따라 약간의 증발을 유발할 수 있습니다. 따라서 적절한 성장 조건을 유지하기 위해 매 24 시간마다 배지를 교체해야합니다. 아래의 프로토콜셀에서의 최대 감소를 계산하고 생존 한 세포의 가능성의 감소가 달성된다 콜로니 형성하기 때문에 암 세포에 TTFields 주파수의인가를 최적화하기 위해 실험 절차를 설명한다.

<table><tbody><tr><td>inovitro system and software</td><td>Novocure</td><td>ITG1000 and IBP1000</td><td>Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sterilization bags</td><td>Westfield medical</td><td>24882</td><td></td></tr><tr><td>Plastic cover slides</td><td>Thermo Scientific (NUNC)</td><td>174977</td><td>Pre treated and sterilized</td></tr><tr><td>Glass cover slides</td><td>Thermo Scientific (Menzel-Gl&amp;auml;ser)</td><td>CB00220RA1</td><td>Sterilize if necessary</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>01-055-1A</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>04-007-1A</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-029</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10,000 U/mL Penicillin, 10,000 &amp;micro;g/mL Streptomycin)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate solution 100 mM&amp;nbsp;</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hepes buffer 1 M</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Insuline solution from bovine pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>03-050-1B</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck</td><td>1.06009.2511</td><td>Cool to -20 &amp;deg;C in the freezer before use</td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>120M1445</td><td>Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water.</td></tr><tr><td>Light detergent</td><td>Alcononx</td><td>242985</td><td>Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer&#039;s instrutions.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>02-023-1A</td><td>Without calcium and magnesium</td></tr><tr><td>A2780</td><td>ECACC</td><td>93112519</td><td>Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100&amp;nbsp;U/mL / 100&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL), sodium pyruvate (1&amp;nbsp;mM) and Hepes buffer (12&amp;nbsp;mM).</td></tr><tr><td>F98</td><td>ATCC</td><td>CRL-2397</td><td>Grow in Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100&amp;nbsp;U/mL / 100&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL), sodium pyruvate (1&amp;nbsp;mM) and glutamine (2&amp;nbsp;mM).</td></tr><tr><td>Ovcar-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-161</td><td>Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100&amp;nbsp;U/mL / 100&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL), sodium pyruvate (1&amp;nbsp;mM), Hepes buffer (12&amp;nbsp;mM) and insulin (10&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL).</td></tr><tr><td>U-87 MG</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td>Grow in Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100&amp;nbsp;U/mL / 100&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL), sodium pyruvate (1 mM) and glutamine (2&amp;nbsp;mM).</td></tr><tr><td>refrigirated CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>CARON</td><td>7404-10-3</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow cabinet</td><td>ADS Laminair</td><td>Bio12 and VSM12</td><td></td></tr></tbody></table>

determining the optimal inhibitory frequency for cancerous cells using tumor treating fields (ttfields)

종양 치료 필드 (TTFields)는 수백 KHz의 주파수 범위에서 저 강도 (1-3 V / cm)의 교류 전계를 연속적이고 비 침습적으로 적용하여 효과적인 치료 방법입니다. 조직 배양에서 TTField의 연구는 높은 유전 상수 (≥ 5,000)를 갖는 세라믹 페트리 접시에 다양한 주파수와 강도의 전기장을 적용 할 수있는 TTFields in vitro 응용 시스템을 사용하여 수행됩니다. 세라믹 페트리 접시의 바닥에있는 coverslips에 도금 암세포 라인은 세포 카운트 및 clonogenic assays와 같은 치료 결과 테스트를 용이하게하기 위해 다양한 주파수에서 두 개의 직각 방향으로 전달되는 TTField에 적용됩니다. 이 보고서에 제시된 결과는 난소 및 신경 교종 세포 모두에서 세포 수와 clonogenic assay와 관련하여 TTField의 최적 빈도가 200kHz임을 보여줍니다.

<html> 상이한 주파수를 스캔 TTFields인가 후의 결과는 이러한 특수 높은 벽 TTFields 내부에 배치 된 Boyden 챔버를 이용하여 침입하는 세포의 수의 변화에 ​​세포 수, 비색 분석법, 클론 원성 분석 및 검사 등 다양한 분석에 기초하여 정량화 될 수있다 세포 배양 접시. 미리 정해진 세포 배가 시간에 따라 신중하게 실험 계획은 세포 따라서 치료 결과를 극대화 치료 기간 동안 유사 분열 이벤트의 최대 수에 도달 할 수 있습니다. (즉, 래트 신경 교종 세포 7 및 F-98 (도 2a 즉, 인간 난소 암 세포)도 2는 평균 세포 수 (즉, 세포의 수) 및 A2780의 클론 원성 분석을위한 전형적인 주파수 스캔 결과를 나타낸다;&quot;&gt;도 2B) 1 (두 방향 TTFields 처리 주파수 범위 : 100 내지 500 ㎑의, RMS는 1.7 V / cm, 및 인큐베이터 온도 :. 18 ° C) 결과를 보여주기 모두에서의 세포 수의 현저한 감소는 주파수를인가 (다중 비교 단방향 ANOVA) 테스트 한 모든 세포주를 200 kHz에서의 최대 감소. 클론 원성 포텐셜 최대 감소로 이어지는 최적 주파수는 모두 A2780 및 F98 세포 (도 2B와 C)에서 동일했다 . 셀 번호, 각 주파수에서의 클론 원성 효과 사이의 피어슨 상관 계수는 0.967 (P = 0.002) 각각 A2780 및 F98에 대한 0.755 (p = 0.083)가 있었다. 도 3은 OVCAR-3에 대한 평균 세포 수에 대한 주파수 스캔 결과를 보여준다 (즉, 인간 난소 암 세포가도 3A) 및 U-87 MG (즉, 인간의 신경 교종 세포;도 3b) 세포는 다양한 농도에서 TTFields의 양방향 처리 (RMS : 1.7, 1.3, 및 1.0 V / cm 각각과 인큐베이터 온도 : 18 ° C, 24 ° C, 28 ° C 각각). 효과는 세포를 처리했을 때 얻은 결과에 비해 상대적으로 작다 : 결과는 여전히 1.3 V / ㎝의 TTFields 치료 (24 ° C 배양기 온도) 이후 OVCAR-3 세포 수의 현저한 감소가있을 것으로 보여 1.7 V / cm로 (인큐베이터 온도 : 18 ° C). U-87 MG 세포를 1.0 V / ㎝의 TTFields 처리 (인큐베이터 온도 : 28 ℃) 1.7 V / cm로 처리 할 때와 같은 세포 수의 감소에 비슷한 경향을 보여, 아직 그 효과는 더 낮은 농도에서 유의하지 않았다 . <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig1.jpg" /> 으로 나뉘어진다전자 1. TTFields 요리는 기판 부 상에 설치된 평면 TTFields 제어 케이블에 접속되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig2.jpg" /> 그림 2. (A) A2780 및 (B) F98 세포 최적 TTFields 억제 주파수의 결정에 대한 주파수 스캔. 셀은 서로 다른 주파수의 TTFields (1.7 V / cm 및 100 ~ 500 kHz로)로 72 시간 동안 처리 하였다. TTFields 치료의 효과는 세포 수 및 클론 원성 분석을 사용하여 추정 하였다. 화살표는 최적의 주파수를 나타낸다. 결과는 시험 주파수마다 적어도 6 회 반복에 기초하여 평균 ± SD를 나타낸다. (C)에 클론 원성 (S)의 대표 이미지<html> 다양한 주파수에서 TTFields 처리 다음 A2780 세포의 urvival. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig3.jpg" /> 그림 3. (A) 및 OVCAR-3 (B)에 대한 최적 TTFields 억제 주파수의 결정에 대한 주파수 스캔 U-87 MG 세포. 셀은 서로 다른 주파수 (100 내지 500 kHz에서) 및 강도의 TTFields로 72 시간 동안 처리 하였다 (OVCAR-3 : 1.3 내지 1.7 V / cm, U-87 MG 1.0 1.7 V / cm)를. TTFields 치료의 효과는 세포 수를 사용하여 추정되었다. 화살표는 최적의 주파수를 나타낸다. 결과는 각 시험 주파수에서 적어도 6 회 반복에 기초하여 평균 ± SD를 나타낸다.페이지 &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt; 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 주위 온도를 인큐베이터 </td><td> 예상 TTFields 강도 </td></tr><tr><td> (기음) </td><td> (V / cm의 RMS) </td></tr><tr><td> (18) </td><td> 1.62 </td></tr><tr><td> (19) </td><td> 1.55 </td></tr><tr><td> (20) </td><td> 1.48 </td></tr><tr><td> (21) </td><td> 1.41 </td></tr><tr><td> (22) </td><td> 1.33 </td></tr><tr><td> (23) </td><td> 1.26 </td></tr><tr><td> (24) </td><td> 1.19 </td></tr><tr><td> (25) </td><td> 1.12 </td></tr><tr><td> (26) </td><td> 1.04 </td></tr><tr><td> (27) </td><td> 0.97 </td></tr><tr><td> (28) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> (29) </td><td> 0.83 </td></tr><tr> &lt;td&gt; 30 </td><td> 0.76 </td></tr></tbody></table> 표 1. TTFields 요리 내부의 인큐베이터 주변 온도 및 예상되는 TTField 강도.

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Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

종양 치료 필드 (TTFields)은 낮은 강도, 중간 주파수, 전기장을 교류의 연속적인 비 관혈적 애플리케이션을 통해 전달되는 효과적인 항암 치료 방법이다. TTFields 체외 응용 시스템을 이용하여 세포주 TTFields 애플리케이션 세포 수의 높은 감소를 유도하는 최적의 주파수의 결정을 허용한다.

필드를 치료 종양을 사용하여 암 세포에 대한 최적의 억제 주파수 (TTFields를) 결정

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

determining-optimal-inhibitory-frequency-for-cancerous-cells-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

14.8K 조회수.  Novocure Ltd., Haifa, Israel.  종양 치료 필드 (TTFields)은 낮은 강도, 중간 주파수, 전기장을 교류의 연속적인 비 관혈적 애플리케이션을 통해 전달되는 효과적인 항암 치료 방법이다. TTFields 체외 응용 시스템을 이용하여 세포주 TTFields 애플리케이션 세포 수의 높은 감소를 유도하는 최적의 주파수의 결정을 허용한다. 

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Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

The chromium release assay, a common assay for detecting cytotoxic T cell activity, has several limitations. Using antigen-specific CD8 T cells and the human breast cancer tumor line, SKBR3, in the present article, an impedance-based approach was examined for the capability of detecting cell killing.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

연구

면역학 및 감염병학

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% with current standard of care. Tumors often recur within 9 months following initial surgery, radiation and chemotherapy, at which point treatment options become limited. This highlights the pressing need for the development of better therapeutics to prolong survival and increase the quality of life for these patients.
Tumor Treating Fields (TTFields) therapy was developed to take advantage of the effect of low frequency alternating electrical fields on cells for cancer therapy. TTFields have been demonstrated to disrupt cells during mitosis and slow tumor growth. There is also growing evidence that they act through stimulating immune responses within exposed tumors. The advantages of TTFields therapy include its noninvasive approach and increased quality of life compared to other treatment modalities such as cytotoxic chemotherapies. The Food and Drug Administration approved TTFields therapy for the treatment of recurrent glioblastoma in 2011 and for newly diagnosed glioblastoma in 2015. We report on the effects of TTFields during mitosis, the results of electric fields modeling, and proper transducer array placement. Our protocol outlines the clinical application of TTFields on a patient post-surgery, using the second-generation device.

Glioblastoma is the most common and aggressive primary brain malignancy in adults, with most tumors recurring after initial treatment. Tumor Treating Fields (TTFields) therapy is the newest treatment modality for glioblastoma. Here, we describe the proper application of TTFields-transducer arrays on patients and discuss theory and aspects of treatment.

종양 세포종 필드 치료 치료의 임상 적용

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

암 연구학

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

Cancer therapies which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly desirable. The use of RF electric-fields that penetrate deep into the body, causing minimal toxicity, are currently being studied as a viable means of non-invasive cancer therapy. It is envisioned that the interactions of RF energy with internalized nanoparticles (NPs) can liberate heat which can then cause overheating (hyperthermia) of the cell, ultimately ending in cell necrosis.
In the case of non-biological systems, we present detailed protocols relating to quantifying the heat liberated by highly-concentrated NP colloids. For biological systems, in the case of in vitro experiments, we describe the techniques and conditions which must be adhered to in order to effectively expose cancer cells to RF energy without bulk media heating artifacts significantly obscuring the data. Finally, we give a detailed methodology for in vivo mouse models with ectopic hepatic cancer tumors.

We describe the protocols used to investigate the interactions of 13.56 MHz radiofrequency (RF) electric-fields with gold nanoparticle colloids in both non-biological and biological systems (in vitro/vivo). These interactions are being investigated for applications in cancer therapy.

비 침습 온열 암 치료를위한 금 나노 입자 및 생물 시스템과 고주파의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

의학

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA approved in April 2011 for the treatment of patients 22 years or older with rGBM. The device delivers alternating electric fields and is programmed to ensure maximal tumor cell kill1.
Glioblastoma is the most common type of glioma and has an estimated incidence of approximately 10,000 new cases per year in the United States alone2. This tumor is particularly resistant to treatment and is uniformly fatal especially in the recurrent setting3-5. Prior to the approval of the TTF System, the only FDA approved treatment for rGBM was bevacizumab6. Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody targeted against the vascular endothelial growth factor (VEGF) protein that drives tumor angiogenesis7. By blocking the VEGF pathway, bevacizumab can result in a significant radiographic response (pseudoresponse), improve progression free survival and reduce corticosteroid requirements in rGBM patients8,9. Bevacizumab however failed to prolong overall survival in a recent phase III trial26. A pivotal phase III trial (EF-11) demonstrated comparable overall survival between physicians&#8217; choice chemotherapy and TTF Therapy but better quality of life were observed in the TTF arm10.
There is currently an unmet need to develop novel approaches designed to prolong overall survival and/or improve quality of life in this unfortunate patient population. One appealing approach would be to combine the two currently approved treatment modalities namely bevacizumab and TTF Therapy. These two treatments are currently approved as monotherapy11,12, but their combination has never been evaluated in a clinical trial. We have developed an approach for combining those two treatment modalities and treated 2 rGBM patients. Here we describe a detailed methodology outlining this novel treatment protocol and present representative data from one of the treated patients.

A novel methodology that is employed for the treatment of recurrent glioblastomas is described. This treatment approach employs the application of alternating electric tumor treating fields (TTFields), known as TTF Therapy in combination with bevacizumab, a targeted agent that is currently FDA approved as monotherapy.

재발 성 아교 모세포종의 치료를 위해 베바 시주 맙과 조합하여 필드 요법 치료 종양

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

고형 종양을 치료하기 위한 이온 채널의 약리학적 표적화

Screening Ion Channels in Cancer Cells

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development of a broad range of disorders or channelopathies. Cancer cells utilize ion channels to drive their own development, as well as to improve as a tumor and to assimilate in a microenvironment that includes various non-cancerous cells. Furthermore, increases in levels of growth factors and hormones within the tumor microenvironment can result in enhanced ion channel expression, which contributes to cancer cell proliferation and survival. Thus, the pharmacological targeting of ion channels is potentially a promising approach to treating solid malignancies, including primary and metastatic brain cancers. Herein, protocols to characterize the function of ion channels in cancerous cells and approaches to analyze modulators of ion channels to determine their impact on cancer viability are described. These include staining a cell(s) for an ion channel(s), testing the polarized state of mitochondria, establishing ion channel function using electrophysiology, and performing viability assays to assess drug potency.

저자 스포트라이트: 암에서 이온 채널의 역할 탐색: 특성화 및 잠재적 치료 접근법 

The pharmacological targeting of ion channels is a promising approach to treating solid tumors. Detailed protocols are provided for characterizing ion channel function in cancer cells and assaying the effects of ion channel modulators on cancer viability.

암세포의 이온 채널 스크리닝

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...

Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.

Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.

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Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In ...

Analysis of Human T Cell Activity in an Allogeneic Co-Culture Setting of Pre-Treated Tumor Cells

Cytotoxic T cells play a key role in the elimination of tumor cells and are, therefore, intensively studied in cancer immunology. The frequency and activity of cytotoxic T cells within tumors and their tumor microenvironment (TME) are now well-established prognostic and predictive biomarkers for numerous tumor types. However, it is well-known that various tumor treatment modalities, including radiotherapy, chemotherapy, immunotherapy, and targeted therapy, modulate not only the immunogenicity of the tumor but also the immune system itself. Consequently, the interaction between tumor cells and T cells requires more intensive study in different therapeutic contexts to fully understand the complex role of T cells during tumor therapy. To address this need, a protocol was developed to analyze the activity and proliferative capacity of human cytotoxic (CD8+) T cells in co-culture with pre-treated tumor cells. Specifically, CD8+ T cells from healthy donors are stained with the non-toxic proliferation marker carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) and stimulated using CD3/CD28-coated plates. Subsequently, T cells are co-cultured with pre-treated tumor cells. As a readout, T cell proliferation is quantified by measuring CFSE signal distribution and assessing the expression of surface activation markers via flow cytometry. This can be further complemented by quantifying cytokine release using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This method facilitates the evaluation of treatment-induced changes in the interaction between tumor cells and T cells, providing a foundation for more detailed analyses of tumor treatment modalities and their immunogenicity in a human ex vivo setting. Additionally, it contributes to the reduction of pre-clinical in vivo analyses.

The present protocol describes an experimental workflow that allows for the ex vivo analysis of human T cell stimulation in an allogenic co-culture system with pre-treated tumor cells.

전처리된 종양 세포의 동종 공동 배양 환경에서의 인간 T 세포 활성 분석

Cytotoxic T cells play a key role in the elimination of tumor cells and are, therefore, intensively studied in cancer immunology. The frequency and ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

필드를 치료 종양을 사용하여 암 세포에 대한 최적의 억제 주파수 (TTFields를) 결정

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Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

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