표지된 마이크로스케일 열영동은 다양한 생화학적 상호작용의 분리 상수 또는 KD를 효율적으로 획득한다. 이 프로토콜과 동반된 비디오는 효모에서 유일하게 용해되는 SNARE 단백질인 Vam7에 대한 대략적인 친화도를 포스파티드산에 부여한다. 이것은 Vam7이 다른 단백질과 상호 작용하기 전에 두 개의 막과 관련되는 방식입니다.
이 방법은 낮은 비용, 높은 재현성 및 최소한의 단백질 비용으로 다양한 생화학 적 상호 작용에 대한 KD를 신속하게 얻습니다. 이 기술은 첫 번째 단계의 제약 개발에 적합하므로 쉽게 얻을 수있는 KD가 잠재적 인 납 화합물을 결정할 수 있습니다. 분석을 시작하기 전에 MST 장치 뒷면의 전원 스위치를 켜고 제어 소프트웨어를 엽니다.
컴퓨터가 장치에 연결되어 있고 연결된 상태인지 확인하고 MST 전을 3초로, MST를 30초로, 형광 복구를 1초 후로 설정합니다. 각 모세관 튜브에 대해, 표적 리간드의 이름, 리간드 분석물의 이름, 표적의 농도, 및 자동 충전 적정 비율을 사용하여 최고 적정 농도를 입력하십시오. MST 전원 범위를 선택하고 각 전력에 대한 값을 입력하여 가장 강력한 바인딩 적합성을 테스트합니다.
표지된 MST 샘플을 제조하기 위해, Vam7-옥타히스티딘 용액을 PBS 중에서 200 나노몰 농도로 희석하고 NTA-Atto 647 염료를 모두 100 나노몰 농도로 희석하였다. Vam7-옥타히스티딘과 NTA-Atto 647 염료를 1:1 부피비로 혼합하고, 혼합물이 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 앉게 한다. 인큐베이션이 끝나면 염료 및 단백질 혼합물을 원심분리하고 사용 전에 최대 몇 시간 동안 섭씨 4도에서 용액을 저장합니다.
그런 다음 샘플을 준비하고 염색 된 리간드를 취하여 분석물을 노출시킵니다. 샘플의 마이크로 스케일 열영동을 위해 장치를 열고 모세관 랙을 밀어 내십시오. 시료 모세혈관을 위치 하나에서 가장 높은 농도로 랙에 로드하고 제어 소프트웨어에서 빨간색 채널을 선택합니다.
그런 다음 계측기에 랙을 로드하십시오. 그런 다음 MST 전력 범위를 선택하고 캡 스캔 MST 측정을 시작하고 시프트 응답을 평가하십시오. Vam7 도메인으로 표지된 50 나노몰 NTA-Atto 647에 대해 500 마이크로몰에서 시작하는 DiC8 PA의 1:1 적정의 하나의 시험으로부터의 열영동 트레이스가 여기에 제시된다.
초기 형광, 시간 점프 및 열영동을 관찰할 수 있으므로 KD를 이들 측정 중 어느 하나 또는 조합으로부터 계산할 수 있습니다. 포화 곡선은 예를 들어, 그래프에 예시된 바와 같이, 시간 점프 출력을 갖는 열영동에 대해 이러한 결과로부터 플롯팅될 수 있다. 일반적으로, MST 결과는 KD 모델을 선택하고 단백질 농도를 입력함으로써 결합 친화도를 결정하기 위해 단백질 농도를 고려하여 로그 스케일을 사용하여 결정된다.
이 프로토콜을 수행할 때 용액이 모세관의 중앙에 있고 기포가 없고 모세관 외부에 먼지나 용액이 없는지 확인하십시오. 등온 적정 열량계 또는 표면 플라즈몬 공명은 수득된 실험 KD를 검증하는데 사용될 수 있다. 잠재적 인 협력 결합이 있다면, ITC는 주어진 자원이 수행 된 다음 논리적 인 방법이 될 것입니다.
이 기술을 통해 전통적인 생물학 연구자들은 경로 관계를 결정하기위한 연구에 생물 물리학 적 선별 기술을 통합 할 수있었습니다. 이 기술의 한 예는 내인성으로 발현된 표적 단백질을 갖는 세포 리자제이며, 여기서 GFP 태그는 전통적인 풀다운 분석을 수행하는 신규한 방법이다.
