이 작품은 ALS 협회, Karyopharm 치료제, Inc., Meira GTx, 토마스 Lawson을 우리는 감사에서 ALS 연구에 대 한 자선 기부에 의해 투자 되었다. 우리 감사 Elysse 과수원과도 나 Burney 조언과 훈련. JAS 거짓말 재단이 지원 하 고 건강의 국가 학회 GM103418를 부여 합니다.

모든 절차에 따라 적절 한 NIH 지침. 모든 절차는 동물 관리 및 사용 위원회 위조에 LSU 건강 과학 센터에 의해 승인 된 동물 프로토콜을 따 랐 다. 여성 Sprague-Dawley 쥐 나이의 6 주에는이 절차에 대 한 사용 되었다.
 1. 필요한 벡터의 복용량/볼륨 결정 <ol><li>무게 벡터 준비 titer (농도)를 기반으로 하는 주입 각 동물에 필요한 바이러스 성 벡터의 크기를 결정 하 쥐. 이전 쥐 CNS에에서 효율적인 식 성공 했습니다 벡터 복용량을 사용 하 여 (잭슨 외를 참조 하십시오. 6). 참고: AAV9 TDP-43 또는 AAV9 GFP, 전형적인 복용량은 3 × 10 13-1 x 10 14 벡터 게놈/kg 사이. 나이의 6 주에 젊은 성인 쥐 무게 약 150 g.</li>
	<li>체계적인 비교에 대 한 모든 동물에 kg 당 동등한 복용량을 확인합니다. 볼륨 표준 권고 주입 볼륨 (250 g 쥐 250-500 µ L)를 초과 하지 않는 확인 하십시오. 전형적인 주입 볼륨은 젊은 성인 쥐에 200 μ.</li>
</ol> 2. 준비 작업 역 <ol><li>필요한 모든 용품을 수집: 한 파라핀 영화 동물, 동물, 거 즈 패드 (2-3 동물 당) 당 하나의 알코올 준비 패드 당 (약 5 x 5 cm) 사각 피펫으로 팁, 그리고는 micropipette.</li>
	<li>70% 에탄올으로 표면 청소 작업 면을 준비 합니다. (~ 37 ° C) 낮은 설정 온도 아래로 열 패드를 놓습니다. 벤치 패드 난방 패드 위에 놓습니다.</li>
	<li>가스 마 취 (isoflurane) 준비합니다. 적절 한 산소와 절차에 대 한 마 취 가스를 확인 합니다. 70% 에탄올, 유도 약 실 및 마 취 마스크를 청소 하 고 벤치 패드에 마 취 마스크를 놓습니다.</li>
</ol> 3. 벡터를 준비 <ol><li>벡터 실 온에서 해 동 하 고 각 동물에 대 한 살 균 microcentrifuge 튜브 라벨.</li>
	<li>피펫으로 AAV의 볼륨에 결정 1.1 적절 한 관을 원하는 주입 볼륨 (여기, 200 μ)까지 볼륨 lactated 벨소리가지고 &#39; s 솔루션 또는 염 분.</li>
	<li>소용돌이 1-2에 대 한 샘플 펄스와 다음 펄스 5 원심 분리기 튜브의 하단에 샘플을가지고 s.</li>
	<li>피펫으로 튜브와 파라핀 영화의 광장에 쥐에 대 한 총 주입 볼륨.</li>
	<li>1 mL 주사기 30 게이지 바늘 위.</li>
	<li>는 파라핀 영화에 벡터에 아래로 향하게 하는 경사와 바늘을 놓습니다. 때까지 모든 바이러스 바늘과 주사기 주사기 플런저에 다시 당겨. 연습 쉽게 되는 바늘으로 공기 방울 그리기 않도록 주의 하십시오.</li>
</ol> 4. 쥐를 준비 <ol><li>1 L/min까지 산소 고 isoflurane 마 취 5%로 설정. 모든 연결 호스 및 자 지의 방향을 확인 하 여 가스 마 취 유도 챔버를 흐르는입니다 확인 하십시오.</li>
	<li>쥐 응답 하지 않는 때까지 약 3 분, 가스 마 취 유도 실에서 쥐를 장소.</li>
	<li>는 발가락을 곤란 하 게 하 여 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다. 발가락 핀치 후 발 또는 다리에 운동 되어야 합니다.</li>
	<li>Isoflurane 마 취 마 취의 유지 보수에 대 한 2%로 감소 하 고는 자 지를 조정 하는 마 취는 마 취 마스크를 흐르는.</li>
	<li>쥐 장소 &#39; s 마 취 마스크에서 코와 그것의 측면에 거짓말은 쥐를 조정.</li>
	<li>식별 측면 꼬리 정 맥. 
	참고: 약 10 2 o에서 측면 꼬리 정 맥 거짓말 &#39; 12 꼬리의 지 느 러 미 상단 시계 o &#39; 시계. 쥐의 측면에 누워와 측면 꼬리 정 맥 한다 직면 자책점</li>
	<li>는 알코올 준비 패드 주입 영역을 닦으십시오. 주사 부는 꼬리의 길이 아래로 2/3.</li>
</ol> 5. 벡터를 주입 <ol><li>단단히 잡고 꼬리 약간 한 손가락으로 주입 영역 위에 측면 꼬리 정 맥에 직접;이 정 맥을 팽창 합니다.</li>
	<li>빗면 위로 향하도록 정렬 같은 방향으로 보이는 꼬리 정 맥으로 바늘.</li>
	<li>을 피하기 위해 다른 한편으로는 꼬리를 잡고 고 꼬리 정 맥에 큰 관심을 복용 하는 동안 꼬리 정 맥을 통해 피부를 피어스.</li>
	<li>정상 혈액 흐름 수 있도록 꼬리 정 맥에서 압력을 풀어.</li>
	<li>정 맥에 바늘을 이동합니다. 바늘 꼬리 정 맥 구멍은 되도록 뒤로 당겨 약간 플런저 합니다. 정 맥에 바늘 있으면 바늘으로 혈액 흐름 것입니다.
	<li>조정 필요에 따라 바늘 <ol>입니다. 바늘을 안정, 사출 사이트 아래에 주사 부 위에 손을 이동 그리고 꼬리에 대 한 주사기의 끝을 잡고.</li>
	</ol></li> <li>꼬리 (약 20 µ L/s)에 벡터를 천천히 주입. 
	참고: 정 맥은 그것을 통해 벡터 흐름으로 색상을 잃을 수 있습니다. 징후는 솔루션 혈관 밖에 주입 했다 포함 blebbing, 벡터를 주입 하는 경우는 피부, 또는 저항의 창백. 연습으로, 여분 혈관 노출 최소화 될 수 있다.</li>
	<li>벡터를 투여 후 쥐에서 바늘을 제거 하 고 30-60 미에 대 한 출혈을 막기 위해 주사 사이트에 대 한 거 즈 패드를 눌러</li>
</ol> 6. 정리 <ol><li>해제는 isoflurane 마 취와 산소. 의식, 차릴 때까지 쥐를 모니터링 하 고 다음 그것의 감 금에 반환.</li>
	<li>신중 하 게 sharps 컨테이너에 모든 바늘을 배치합니다. 잠재적으로 오염 된 AAV 적절 한 생물 용기에 다른 모든 일회용 재료의 처분. 70% 에탄올과 작업 역 청소.</li>
</ol> 7. 평가 hindlimb 탈출 반사 참고: Hindlimb 적자 일반적으로 발생 하는 벡터 복용량에 따라 TDP-43 유전자 이동 후 2-6 주.
<ol><li>두 손가락으로 파편의 평면 클리어에는 쥐를 잡아 &#39; s는 몸에서 약 2 cm 꼬리. 앞 발은 쥐의 복 부 아래쪽을 보는 동안 걸려 때까지 쥐를 부드럽게 들어올립니다.
	<ol><li>수행 주간 과정에 걸쳐 실험 시간-유전자 이동 후 절차 (예를 들어, 유전자 이동 후 12 주까지). 
		참고:이 방법으로 또한 점수를 forelimb 적자 하지만 hindlimb 적자는이 모델을 사용 하는 벡터 복용량에 따라에서 발생할 가능성이 높습니다.</li>
	</ol></li> <li>하나 또는 둘 모두 hindlimbs 10 동안 중간 선 향해 닥 10 미 메모는 hindlimbs 관찰 s.</li>
	<li>반복 30 세 번의 총에 대 한이 테스트 시험 사이 s. 하나 또는 둘 모두 hindlimbs는 3 개의 시험의 각각에 대 한 꽉, 쥐 모터 역 기능을 보이고 있다. 경우에 모든 3 개의 시험에서 떨림 일관 된 어느 일방 또는 양자 hindlimb 적자 존재로 (주)에서 수동으로 데이터를 기록.</li>
</ol> 8. 평가 rotarod에 모터 기능 <ol><li>rotarod, 설정 하는 rotarod 아래 벤치 패드를 배치 하 고 2 분 이상 (속도 증가 ~0.3 rpm/s) 4-40 분당 회전 (rpm)를 가속 설정. 12 주 시간-과정, 2, 4, 8에서 주제를 실행 하 고 유전자 후 12 주 전송.</li>
	<li>허용 20 분에 대 한 테스트 룸에 두었던 쥐</li>
	<li>는 rotarod 처음으로 사용 하 여 쥐를 훈련 하는 먼저 4 rpm의 설정된 속도에서 rotarod 시작 다음는 rotarod에 쥐를 놓고. 쥐 4 rpm에서 한 전체 혁명에 대 한 걸 다음 가속을 시작 하 고 쥐 그것 떨어지 때까지 rotarod에 걸을 수 있도록. 쥐 적어도 40에 대 한 지속적으로 걸을 수 있을 때까지 훈련을 계속 s. 건강 한, 젊은 성인 쥐 쉽게 이러한 방식으로 훈련 될 것 이다.
	<ol><li>눈에 띄는 모터 손상 된 쥐의 경우는 기준 대기 시간 40의가을 달성에서 쥐를 되지 않을 수 있습니다 s, 쥐 rotarod 득점을 시작 하기 전에 3-5 교육 시도 제공.</li>
	</ol></li> <li>Rotarod 테스트를 시작 하는 쥐에는 rotarod 놓고는 rotarod의 가속을 시작. 참고 rotarod;에서 쥐가는 시간 이것은을에 대기 시간 이다. 쥐 120 후는 rotarod에 남아 경우 s,이 시점에서 세션 모자는 rotarod에서 쥐를 제거 하 고 120의가 대기 시간을 기록 s.</li>
	<li>테스트 3 재판의 총에 대 한 두 번 더 반복 합니다. 피로의 효과 최소화 하기 위해 떨어져 재판 적어도 5 분 간격. 3 시험의 점수를 평균 한다. 손상 되지 않은 성인 쥐 일반적으로의을에 평균 대기 시간을가지고 &#62; 40 s.</li>
	<li>장에 다시 쥐를 놓고 rotarod 및 70% 에탄올과 주변 지역 청소.</li>
</ol> 9. 소 뇌에 GFP 식의 정량화 <ol><li>Anesthetize 쥐 및 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 다음 4% paraformaldehyde perfuse. 두뇌 및 척수를 dissect 하 고는 정착 액에 담가 하룻밤 조직 30% 자당 해결책에 그들을 이동. 평형, 후에 동결 단계 4 , , 5 6와 슬라이딩 톰 50 μ m 코로나 섹션 컷.</li>
	<li>는 Vermis, 소 뇌의 중앙 엽에에서 균등 하 게 배치 하는 소 뇌의 3-6 섹션을 선택 합니다. 신호를 최대화 하기 위해 GFP 레이블을 붙일. 1: 500에 GFP에 대 한 1 차적인 항 체를 사용 하 고 알 렉 사-488 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 1:300 4 , , 5 6의 희석에. 
	참고: 참조 참조 4 , , 5 6 자세히는 샘플링에 대 한 단면, 그리고 절차를 얼룩.</li>
	<li>낮은 배율 렌즈 현미경을 사용 하 여 관심의 정의 된 영역에 각 섹션을 photomicrograph. 2.5 X 목표 (0.12 없음)를 사용 하 여 필터 설정 10, 450-490/515-565 여기/방출). 카메라 설정 (노출 시간, 예를 들어, 2 s) 샘플 분석을 통해 동일. 다른 이름으로 저장 한. TIF 파일.</li>
	<li>널리 귀 공자 이미지 프로그램에는 photomicrograph를 열고; 2 개의 창이 열립니다. 닫기 창으로 표시 &#34; 인덱스 색상 &#34;.</li>
	<li>선택 &#34; 옵션 &#34;, 다음 &#34; 밀도 SliceŔ 그늘의 범위는 룩 업 테이블 (LUT) 창에 빨간색으로 표시 됩니다. 창에서 커서를 사용 하는 특정 GFP 라벨만 입력 하 고 일반적인 배경 이미지에 뽑 시작 중지. 
	참고:이 측정할 수를 photomicrograph에 형광 영역을 강조 표시 됩니다. 설정을은 구체적으로 모든 가시 형광 셀을 잡으려고 최적화 되어야 합니다. 연습으로,이 방법은 정확 하 게 특정 형광 강조 수 있습니다.</li>
	<li>형광 영역을 측정 하기 전에 먼저 올바른 단위 (픽셀)는 측정 인지 확인. 이렇게 하려면 &#34; 분석 &#34;, 다음 &#34; 설정 ScaleŔ 네 번째 줄 라고 한다 &#34; 단위 &#34;. 픽셀 픽셀 단위로 측정을 클릭을 선택 드롭-다운 목록에서 &#34; 확인 &#34;. 분석 옵션을 설정/해제 &#34; 인테리어 구멍 포함 &#34; 분석에서 몸 전체 세포의 포함 되도록.</li>
	<li>형광 면적 측정 클릭 &#34; 분석 &#34;을 클릭 하 고 &#34; 측정 &#34;. 이 값을 표시 하려면 &#34; 분석 &#34; 클릭 &#34; 표시 ResultsŔ 결과 창이 나타납니다. 라는 제목 아래 형광 영역 측정 될 것입니다 &#34; 지역 &#34;.</li>
	<li>측정에 걸쳐 표준화를 위해 LUT 창에서 강조 표시 된 값을 변경 하지 마십시오.</li>
	<li>모든 측정 기록 되었습니다, 일단 평균 (동물 당 3-6 절)에서 각 동물에 대 한 값입니다. 적절 한 통계 테스트를 사용 하 여 그룹 간의 transduced 영역 비교. 6</li></ol>

<ol>
	<li>Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons.">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injections+in+neonatal+mice.">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansive+gene+transfer+in+the+rat+CNS+rapidly+produces+amyotrophic+lateral+sclerosis+relevant+sequelae+when+TDP-43+is+overexpressed.">Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed.</a> Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).</li><li>Dayton, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+forelimb+impairment+in+rats+expressing+a+pathological+TDP-43+25+kDa+C-terminal+fragment+to+mimic+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV9+supports+wide-scale+transduction+of+the+CNS+and+TDP-43+disease+modeling+in+adult+rats.">AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats.</a> Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).</li><li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+targeting,+better+efficiency+for+wide-scale+neuronal+transduction+with+the+synapsin+promoter+and+AAV-PHP.B.">Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B.</a> Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).</li><li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+respiratory+changes+at+end+stage+in+a+FUS-induced+disease+state+in+adult+rats.">Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 69 (2016).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice.">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+vector+&amp;#34;magic+bullet&amp;#34;:+targeted+expression+in+the+central+nervous+system+after+peripheral+delivery+using+the+synapsin+promoter.">Gene vector &amp;#34;magic bullet&amp;#34;: targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).</li><li>van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+embolism:+pathophysiology+and+treatment.">Gas embolism: pathophysiology and treatment.</a> Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).</li></ol>

저자는 공개 없다.

다양 한 전달 경로 AAV 벡터에 대 한 테스트 되었습니다: 내부 parenchymal 내부-cerebroventricular, 내부 thecal, 정 맥, intranasal, 내부 근육, 등. 각 경로 특정 장점 뿐만 아니라 단점으로 할 수 있습니다. AAV의 성인 쥐의 꼬리 정 맥 행정은 CNS의 일관 된 변환 달성 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 주변 주입 방법 CNS 조직으로는 주입 정 맥의 소개를 방지 하 고 최소 침 습 이므로. 이 방법으로 얻을 수 있?...

왜냐하면 그들은 너무 신경 vivo에서 시험에 대 한 효율적인 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터 CNS 연구를 위한 필수적인 도구는. AAV 벡터는 매우 다른 transgenes 및 단백질 isoforms, 다른 조직, 다른 호스트 종, 그리고 관리의 다른 노선 공부에 대 한 다양 한. 예를 들어, AAV 관리할 수 마우스 주변 기기로, 상대적으로 비-침략 적, 처음으로 신경 통해 CNS transduce를 정 맥 주사 설명 Foust 외 에 두 끼 외. Gombash 그 외 여러분 에 의해 (참조 정돈 종이 (2014))입니다. 1 , 2 , 3 이 유전자 납품 방법은 어느 녹색 형광 단백질 (GFP)를 효율적으로 표현 하 쥐에 사용 됩니다 또는 ALS 관련 단백질, 양자가 응답 CNS에서 43 kDa (TDP-43)의 DNA 묶는 단백질. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 중요 한는 쥐에서 일 쥐의 생리 및 대사 매개 변수는 마우스에 비해 인 간에 게 가까이 있으며 행동 및 독물학 분석 실험 쥐를 위해 특별히 설계 된 때문입니다. 또한, 더 많은 유전자 변형 쥐 라인 제공 되고있다는 AAV 유전자 전달 연구에 이용 될 수 있다.
메서드는 쥐, 그리고 결과의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 정량화에 광대 한 CNS 유전자 이동에 대 한 자세한. 대규모 CNS 변환 척수 전체 TDP-43으로 표현 하 여 쥐에서 ALS의 징후를 모방 하는 데 사용 됩니다. 방법은 TDP-43 벡터 잭슨 외 에 사용으로 젊은 성인 쥐의 꼬리 정 맥 주사 6 , 8 , 9 몇 주 후, TDP-43-유도 모터 적자는 승리 두 가지 방법으로: 반사와 데이 턴 외 에 잭슨 그 외 여러분 사용 rotarod 탈출 5 , 6 , 7 , 9 사후 분석, 제어 GFP 벡터에 대 한 소 뇌의 형광 영역으로 계산 됩니다 변환 효율 잭슨 외 에서 사용 되는 인덱스 6 , 8 소 뇌의 분석 주변 유전자 납품 후 CNS 변환의 정도의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 색인 것을 입증 했다 고 주변 중앙 유전자 전송을 시도 하는 접근의 다양 한에 적용 해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>Scale</td><td>Pelouze</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene bucket</td><td>Thermo Scientific</td><td>12014000</td><td>4000 mL</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer&#039;s Solution</td><td>Baxter Healthcare</td><td>0338-0114-04</td><td></td></tr><tr><td>Mini vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>128101</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22624415</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory film</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>1-mL syringe</td><td>BD</td><td>309626</td><td>Comes with a 25g needle attached.&lt;br/&gt; Replace with 27-30g needle for injection</td></tr><tr><td>30g needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>66794-013-25</td><td>Isoflurane USP 250 mL</td></tr><tr><td>Anesthesia mask</td><td>Kopf Instruments</td><td>906</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Henry Schein</td><td>100-2524</td><td>2&quot; x 2&quot; (5cm x 5cm)</td></tr><tr><td>Pipet tips</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0816</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet</td><td>Gilson</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>Gas anesthesia vaporizer</td><td>SurgiVet</td><td>4214322</td><td>Classic T3</td></tr><tr><td>Gas anesthesia scavenger</td><td>SurgiVet</td><td>32373B10</td><td>Enviro-PURE</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sears</td><td>17280</td><td></td></tr><tr><td>Bench pad</td><td>VWR</td><td>56617-006</td><td></td></tr><tr><td>Rotarod</td><td>Panlab/Harvard Apparatus</td><td>76-0772</td><td>4 rats/ 4 mice</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2401</td><td>140 proof</td></tr><tr><td>70% Isopropanol</td><td>VWR</td><td>89108-160</td><td></td></tr><tr><td>Scion Image</td><td>Scion Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Polyclonal Antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Primary Antibody - 1:500 dilution</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td>Secondary Antibody - 1:300 dilution</td></tr><tr><td>Axioskop 40 microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction

정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR), optogenetics, cre lox 타겟팅, 등 클러스터 Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 신경 과학에 키 시는. 이 원고의 목적은 AAV의 꼬리 정 맥 주입을 통해 쥐에 광대 한 중앙 신경 시스템 (CNS) 유전자 전송을 시도 하는 탐정을 원조 하기 위하여. 대규모 식 광범위 한 병 리, 조건에 대 한 관련 이며 쥐 모델은 중요 한 그것의 큰 크기와 쥐에 비해 인 간에 게 생리 적인 유사성 때문입니다. 이 예제에서는 응용 프로그램에서 대규모 신경 전달 전체 척수, 루 경화 증 (ALS)에 영향을 미치는 신경 질환을 모방 하는 데 사용 됩니다. 효율적인 대규모 CNS 변환 전 임상 연구에서 치료 단백질 요소를 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다. 몇 주 후 주입 식 간격 후 변환의 효과 평가 됩니다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 제어 벡터에 대 한 소 뇌에 GFP 양의 기본적인 이미징 프로그램에 의해 신속 하 고 안정적으로 추정 된다. ALS에 의해 유도 모터 질병 고기 관련 단백질 양자가 응답 43 kDa (TDP-43)의 DNA 묶는 단백질, 적자 탈출 반사와 rotarod에 의해 득점 된다. 질병 모델링 및 유전자 치료, 대규모 진 여기에 설명 된 대상에 대 한 다양 한 잠재적인 신청이 있다. 이 메서드를 사용 하 여 확장 된 가설 신경 과학에서 neurogenetics 테스트를 신속에 도움이 됩니다.

TDP-43 유도 모터 장애 AAV TDP-43 사용 (그림 1)의 복용량에 따라 2-6 주 이내에 발생 한다. 실패 한 꼬리 정 맥 주사 될 부분 또는 없음; AAV 효과 생산 하기 위해 혈 류를 도달 해야 합니다. AAV GFP의 성공적인 주입 벡터 복용량 의존 방식으로 뇌와 척수에 걸쳐 GFP 식에서 발생 합니다. 드라이브 식, 세포 치킨 베타 걸 하이브리드 발기인, CAG 발기인 라고도 강?...

Watch this Scientific Journal Video about Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction at JoVE.com

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

쥐에서 대규모 중앙 신경 유전자 배달 방법 적용 됩니다. 이 예제에서는 목적은 전체 척수에 영향을 미치는 질병을 모방 이다. 광범위 한 변환, 주변 관리에서 CNS에 치료 단백질을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

methods-tips-for-intravenous-administration-adeno-associated-virus-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K 조회수.  Louisiana State University Health Sciences Center. 쥐에서 대규모 중앙 신경 유전자 배달 방법 적용 됩니다. 이 예제에서는 목적은 전체 척수에 영향을 미치는 질병을 모방 이다. 광범위 한 변환, 주변 관리에서 CNS에 치료 단백질을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

비디오: Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

연구

신경과학

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

면역학 및 감염병학

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

재조합 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터의 정위 주사를 통해 파킨슨 병에 대한 알파 - 시누 클레인 기반 쥐 모델 개발

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

의학

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, and excellent transduction efficacy in the CNS.&#160;Previous studies have demonstrated the therapeutic potency of AAV-delivered gene therapy in neurodegenerative disorders by IT administration. However, high rates of unpredictable failure due to the technical limitation of IT administration in small animals have been reported. Here, we established a scoring system to indicate the success extent of lumbar puncture in small animals by adding 1% lidocaine hydrochloride into the injection solution. We further show that the extent of transient weakness following injection can predict the transduction efficiency of AAV. Thus, this IT injection method can be used to optimize therapeutic trials in mouse models of CNS diseases that afflict wide regions of the CNS.

Here we present a direct intrathecal injection technique using 1% lidocaine hydrochloride in a viral solution to ensure efficient adeno-associated virus delivery to small animals and establish a scoring system to predict transduction efficiency in the central nervous system according to the degree of transient weakness induced by lidocaine.

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Single-Step Heparin Affinity Chromatography를 이용한 AAV 벡터 정제

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. However, the commonly used methods to purify AAVs make use of cesium chloride or iodixanol density gradient ultracentrifugation. Despite their advantages, these methods are time-consuming, have limited scalability, and often result in vectors with low purity. To overcome these constraints, researchers are turning their attention to chromatography techniques. Here, we present an optimized heparin-based affinity chromatography protocol that serves as a universal capture step for the purification of AAVs.
This method relies on the intrinsic affinity of AAV serotype 2 (AAV2) for heparan sulfate proteoglycans. Specifically, the protocol entails the co-transfection of plasmids encoding the desired AAV capsid proteins with those of AAV2, yielding mosaic AAV vectors that combine the properties of both parental serotypes. Briefly, after the lysis of producer cells, a mixture containing AAV particles is directly purified following an optimized single-step heparin affinity chromatography protocol using a standard fast protein liquid chromatography (FPLC) system. Purified AAV particles are subsequently concentrated and subjected to comprehensive characterization in terms of purity and biological activity. This protocol offers a simplified and scalable approach that can be performed without the need for ultracentrifugation and gradients, yielding clean and high viral titers.

저자 스포트라이트: Adeno-Associated Viral Vectors의 생산 및 정제를 위한 개선된 방법

This manuscript describes a detailed protocol for the generation and purification of adeno-associated viral vectors using an optimized heparin-based affinity chromatography method. It presents a simple, scalable, and cost-effective approach, eliminating the need for ultracentrifugation. The resulting vectors exhibit high purity and biological activity, proving their value in preclinical studies.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. ...

생체공학

CNS 유전자 치료를 위한 어린 쥐에서 AAV9의 요추 천자 전달

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a toxic gene, or provide a gene whose product can modulate the biology of the disease. The delivery method for the therapeutic vector can take many forms, ranging from intravenous infusion for systemic delivery to direct injection into the target tissue. For neurodegenerative disorders, it is often desirable to skew transduction towards the brain and/or spinal cord. The least invasive approach to target the entire central nervous system involves injection into the cerebrospinal fluid (CSF), allowing the therapeutic to reach a large fraction of the central nervous system. The safest approach to deliver a vector into the CSF is the lumbar intrathecal injection, where a needle is introduced into the lumbar cistern of the spinal cord. This technique, also known as a lumbar puncture, has been widely used in neonatal and adult rodents and in large animal models. While the technique is similar across species and developmental stages, subtle differences in size, structure, and elasticity of tissues surrounding the intrathecal space require accommodations in the approach. This article describes a method for performing lumbar puncture in juvenile rats to deliver an adeno-associated serotype 9 vector. Here, 25-35 &#181;L of vector were injected into the lumbar cistern, and a green fluorescent protein (GFP) reporter was used to evaluate the transduction profile resulting from each injection. The benefits and challenges of this approach are discussed.

저자 스포트라이트: Assessing Intrathecal Gene Therapy Effect in Juvenile Rats

A surgical procedure is described to perform injections into the lumbar cistern of the juvenile rat. This approach has been used for the intrathecal delivery of gene therapy vectors, but it is anticipated that this approach can be used for a variety of therapeutics, including cells and drugs.

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

재조합 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터의 정위 주사를 통해 파킨슨 병에 대한 알파 - 시누 클레인 기반 쥐 모델 개발

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)