다음과 같은 프로토콜을 요약 보여주기위한 그림 1을 참조하십시오. 안전주의 : 조립 바이러스 입자들과 접촉을 해 왔습니다 모든 자료 Virkon 솔루션 또는 기타 적합한 살균제로 소독해야합니다. 1. 플라스미드 DNA 주식 (~ 2 일)의 준비 <ol><li> 다음 plasmids는 1이 필요합니다 : <ul><li> pRV1 - AAV2 담당자와 모자 시퀀스를 포함 </li><li> pH21 - AAV1 담당자와 모자 시퀀스를 포함 </li><li> pFdelta6 - 아데노 바이러스 - 헬퍼 플라스미드 </li><li> 플라스미드 AAV는 AAV2 포장 신호 (거꾸로 터미널 반복, ITRs) 어귀 재조합 표현 카세트를 포함하는 </li></ul></li><li> pFdelta6이 부분 삭제를 방지하기 위해 Stbl2 유능한 세포 성장해야하지만, pRV1와 pH21는 DH5alpha 유능한 세포의 성장 수 있습니다. 부분 삭제가 DH5alpha 세포에서 발생하는 경우에는 AAV의 plasmids은 Stbl2 세포의 성장 수 있습니다. </li><li>플라스미드 DNA는 고품질의 RNA 오염 물질의 무료 있어야합니다. Plasmids는 다음과 소화를 사용하여 무결성 검사를 할 수 있습니다 : <ul><li> pRV1 - 소화와 XbaI은 7.5 킬로바이트 및 3.8 킬로바이트의 밴드를 제공 </li><li> pH21 - EcoRI로 소화 4.5 킬로바이트의 밴드 2.8 킬로바이트 및 0.2 킬로바이트를 제공 </li><li> pFdelta6 - HindIII와 소화가 5.5 킬로바이트의 밴드, 3킬로바이트, 3킬로바이트 2.3 킬로바이트 및 1.5 킬로바이트를 제공 </li></ul></li></ol> 2. (- 3 일 2) transfection에 대한 인간의 배아 신장 293 (Hek293) 세포의 준비 <ol><li> 플레이트이 80% 합류 150cm 다섯 15cm 직경 Nunc 조직 문화 요리에 Hek293 전지 2 flasks. 세포는 70해야 - transfection (약 48 시간이 도금 후) 전에 80% 합류. 10% 소태아 혈청과 100 U / ML 페니실린 / 100 μg / ML 스트렙토 마이신을 포함하는 낮은 포도당 표준 Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)에 문화 세포. </li><li> transfection 전에 3 시간 DMEM을 제거하고 Iscove로 교체의 수정된 Dulbecco의 중간 (IMDM)는 소태아 혈청 5 %를 포함. </li></ol> 3. 바이러스 plasmids의 Transfection (transfection에 대해 ~ 1 시간 부화 3 일) <ol><li> 바이러스의 단일 배치 (5 X 15cm 조직 문화 플레이트)에 대한 다음과 같은 준비 : <ul><li> 플라스미드 62.5 μg AAV </li><li> 125 μg pFdelta6 </li><li> 31.25 μg pRV1 </li><li> 31.25 μg pH21 </li><li> 1650 μl 2.5 M CaCl 2 </li><li> 12 ML DH 2 O </li></ul></li><li> 50 ML 튜브에 2 급 조직 문화 후드 살균 필터 transfection 혼합물에. </li><li> 솔루션을 vortexing 반면, 신속하게이 X의 HEPES 13 ML을 추가 (산도 7.05) 염분 버퍼. 50 ML 튜브의 뚜껑을 교체하고 15 초 동안 와동로 진행합니다. 일분 45 초 동안 서 떠나 훌륭한 흰색 침전물이 형성됩니다. </li><li> 부드럽게 각 15cm 조직 문화 요리에 transfection 솔루션의 5 ML를 추가합니다. 소용돌이 모양의 접시는 믹스 앤 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> transfection 후 16시간은 IMDM 미디어를 제거하고 DMEM로 바꿉니다. </li></ol> 4. (2 시간) 세포의 Lysing 및 rAAVs의 수확 <ol><li> transfection 후 72 시간, 세포 배양 접시에서 미디어를 제거하고 폐기. 모든 폐기물은 Virkon 솔루션 또는 기타 적합한 살균제로 소독 치료를해야합니다. </li><li> 부드럽게 따뜻한 1X 인산염의 세포를 세척 식염수는 (; 산도 7.4 PBS) 버퍼. </li><li> 각 판 25 ML 따뜻한 PBS를 추가하고 부드럽게 세포 스크레이퍼와 세포를 제거합니다. 50 ML 튜브의 중지를 수집합니다. </li><li> 10 분 800 XG에 펠릿 세포. </li><li> NaCl 150 MM, 20 MM 트리스 산도 8.0에서 뜨는 및 resuspend 펠렛을 폐기, 조직 문화 판 당 10 ML을 사용합니다. 이 50 ML 튜브로 가라. </li><li> DH 2 O.에서 10 %의 나트륨 deoxycholate의 새로운 솔루션을 준비 0.5 %의 최종 농도 각 튜브에이 1.25 ML을 추가합니다. ML 당 50 단위의 최종 농도 benzonase nuclease를 추가합니다. 철저하게 튜브를 섞습니다. </li><l저는 37&gt; 품어 ° C 1 시간. </li><li> 15 분에 대한 3000 XG에 centrifuging하여 세포 파편을 제거합니다. 신선한 50 ML 관에 전송 모든 세포 부스러기가 (5 단계 참조) 헤파린 열 차단 방지하기 삭제되었습니다 보장합니다. 이 단계에서는 샘플을 계속하기 전에 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 우리는 감염의 감소없이 -20 ° C에서 몇 주 동안 샘플을 저장합니다. </li></ol> 5. rAAVs의 헤파린 열 정화 (2-3시간) <ol><li> 해당 솔루션은 흐름 있도록 5.4 단계 5.2에 대한 분당 1 ML에있는 컬럼을 통해 연동 펌프를 사용하여 설치 HiTrap의 헤파린 열. 기포가가 헤파린 컬럼에 도입되지 않도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 10 ML 150 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0로 컬럼을 평형. </li><li> 칼럼 50 ML 바이러스 솔루션을 적용하고 흐름을 통해 수 있습니다. </li><li> 20 ML 100 MM NaCl, 20 MM 트리스, pH를 8.0로 컬럼을 씻으십시오. </li><li> 5 ML의 주사기를 사용하면 열 w을 씻어 계속한 ML 300 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 다음​​ ith 일 ML 200 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0,. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 적용하여 열에서 5 ML 주사기와 부드러운 압력 elute 바이러스를 사용 : <ul><li> 1.5 ML 400 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 </li><li> 3.0 ML 450 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 </li><li> 1.5 ML 500 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 </li><li> 15 ML의 원심 분리기 튜브에서 이러한를 수집합니다. </li></ul></li></ol> 6. 농도와 rAAVs의 무균 여과 (1 시간) <ol><li> 100,000 분자량의 컷오프와 Amicon 울트라 - 4 원심 필터 유닛을 사용하여 벡터를 집중. 이분 (실온에서) 2000 XG에 농축기와 원심으로 열 eluate 4 ML을로드합니다. 나머지 바이러스 솔루션과 반복 원심 분리와 flowthrough 및 재장전 농축기를 폐기하십시오. 집중 볼륨 약 250 μl해야합니다. 집중 볼륨이보다 훨씬 더 많은 경우, 흐름 T를 폐기hrough는 볼륨이 약 250 μl 때까지 일분 단계에서 원심 분리기를 계속합니다. </li><li> 500 μl의 최종 볼륨 바이러스에 PBS 250 μl를 추가하고 농축기에서 제거합니다. </li><li> 13mm 직경 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터 벡터. 벡터는 ° C까지 필요한 -80에서 aliquoted하고 저장해야합니다. </li></ol> 7. (3 일간) 바이러스 주식 Titering 이 기자의 유전자 또는 유전자 immunocytochemically 감지 제품을 운전 Hek293 세포에서 활성화되어 발기인이 필요합니다. Hek293 세포는 다른 세포 라인이나 기본 셀 문화가 사용할 수와 호환되지 않습니다 벡터를 제작하는 경우. <ol><li> 50% 합류 - 그들이 40되도록 Hek293 세포를 시딩하여 18 폴리 - L - 라이신 코팅 유리 coverslips 또는 Nunc 챔버 슬라이드 18 우물을 준비합니다. Cre - 의존 rAAVs의 적정 위해 안정 표현 Cre recombinase이 Hek293 세포를 사용합니다. </li><li> 시리얼 D 각각 잘 감염AAV 벡터 (그림 2A)의 ilutions. 희석 당 3 우물을 사용합니다. 우리는 일상적으로 각각 물론 직접 바이러스를 추가합니다. </li><li> 72시간은 실온 10 분 (2 % PFA의 최종 농도를주는) 중간에 4 % paraformaldehyde의 동일한 볼륨 (PFA)를 추가하여 Hek293 세포를 수정 후. </li><li> 세포에게 PBS로 세 번 씻어, DH 2 O와 coverslip에 린스. </li><li> 가장 높은 희석 요인을 세 우물에서 transduced 세포의 수를 세어하지만 여전히 감염된 세포를 포함하는 이들의 평균을 찾아 microliter 당 전염성 단위 (그림 2B)의 번호를 가르쳐주기 희석 요소를 기준으로 곱하면됩니다. </li></ol> 8. 예상 결과 Hek293 세포는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)가 그림 2B에 표시하는 바이러스 인코딩 transduced. 우리는 일반적으로 마이크로 리터 당 약 6 × 10 6 전염성 입자의 일관성 titers을 얻을 수 있습니다. 우리는 일상적으로 stereotaxic 인제 이러한 벡터를 사용성인 쥐 두뇌에 ction. 이것은 특정 지역과 관련된 유전자 발현 2에 대한 강력한 기술을 제공합니다. 우리가 Cre - 형질 전환 마우스 2 대상 지역으로 Cre recombinase 종속 rAAVs을 주입 셀 타입의 선택적 유전자 발현이 지역의 특이성을 결합합니다. 그림 2C - E는 성인 parvalbumin - Cre 유전자 변형 마우스 3 가지 뇌 영역에 eGFP 인코딩 Cre - 의존 rAAVs의 stereotaxic 주사의 예를 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> 그림 1. rAAV 생산을위한 프로토콜의 도식 그림. 1.) Hek293 전지는 도금 및 70 재배 - 80 % 합류합니다. 2.) AAV와 도우미 plasmids은 준비하고 Hek293 세포로 transfected 수 있습니다. 3.) 매체는 transfection 후 DMEM 16시간으로 변경되고 Hek293 세포는 다른 56시간에 대한 양식입니다. 4.) Hek293 세포는 수확 및 lysed 있습니다. rAAV 벡터는 C에 의한 세포의 잔해로부터 분리entrifugation. 5.) 바이러스성 입자 농도 및 살균하기 전에 헤파린 컬럼을 통해 정화됩니다. 6.) Hek293 세포 24 잘 접시에 성장과 전염성 단위의 수를 결정하는 AAV 벡터의 시리얼 dilutions로 감염됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> 그림 2. Titering 및 rAAV1 / 2의 생체내 응용 프로그램 인치 바이러스 titer를 측정 Hek293 세포의 (A) 설정. Hek293 세포 rAAVs 일련 dilutions와 transduced 있습니다. C, 감염되지 않은 제어, N, undiluted 바이러스 주식 1 μl. (B) Hek293 세포 eGFP을 표현 rAAVs에 감염. (CE) 바이러스성 eGFP 표현은 제한됩니다 Cre - 표현 Cre가 활성화된 rAAVs의 stereotaxic 주입 후 parvalbumin - Cre 유전자 변형 마우스의 다른 대상 지역에서 뉴런합니다. 예 이미지 (C) 망상 시상 및 globus pallidus에서 GFP의 immunoreactivity를 보여, (D) 이가있는 이랑과 해마의 (E) CA1 지역. DG, 드ntate 이랑, RT, 망상 thalamic 핵, GP, globus pallidus의. 스케일 바 : B, 500 μm의, C, 100 μm의, D, 100 μm의, 전자, 500 μm의.

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rAAV 벡터 동물의 생체내 연구에 대한 가치가 점점지고 있습니다. 여기, 우리는 기업에 바이러스 생산의 값비싼 아웃소싱을 피하고하여이 유용한 벡터의 광범위한 응용을 용이하게 할 수있는, 생산 rAAVs을위한 간단하고 저렴한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜 (참고 1 기준) 동등한 비율 4 양쪽 부모 serotypes의 capsid 단백질을 포함하는 키메라 rAAV1 / 2 벡터의 생산을 설명합니다. 헤파린 컬럼에 바인딩하여 rAAV 벡터의 정화는 AAV2 capsid 단백질의 표현에 의존하지만, 여기에 설명된 AAV1 이외 serotypes과 함께하실 수 있습니다. 또한, AAV6은 감소 친화력과 함께 있지만, 헤파린에 바인딩하는 것으로보고되었습니다, 그리고 잠재적으로이 절차를 사용하여 헤파린 5,6 열이 정화 수 있습니다. 그것은 다른 serotypes는 헤파린 칼럼 용출 5,7에 대한 NaCl의 다른 농도가 필요합니다, 그러나 지적해야합니다. 포장 rAAV의 genomes은 5.2 킬로바이트 8까지 포장 효율 날카로운 감소로 4.1 및 4.9 킬로바이트 사이에 최적으로 표시되었다. transgene 표현의 셀 유형 - 특정 규제는 일반적으로 작은 AAV 입자 내에 수용 수없는 요소를 행동을 대형 CIS에 의해 달성되기 때문에이 포장 제한은 rAAV 시스템의 가장 큰 단점으로 간주 수 있습니다. 이러한 우리가 아니라 같은 단계 6.3에서 설명하는 PBS를 추가하는 것보다 한 500 μl 배치에 250 μl에 집중 별도의 바이러스 배치를 결합하는 AAV 포장 한도에 가까운 패키지 유전자 시도로 인한 것과 같은 낮은 titer의 일괄를 극복하기. 신뢰성 셀 타입의 특정 형질 도입은 통합 Cre - 드라이버 마우스 및 포장 한도를 스트레칭 피하기 위해 조건부 rAAV 카세트 (아래 참조)에 의해 얻을 수 있습니다. 지폐,이 프로토콜은 높은 t의 생산에 쉽게 따라 지침을 제공하기 위해 시도하는 동안iter rAAV, 그건 헤파린 친화도 크로마 토그래피에 의한 정화를위한 AAV2 capsid 단백질 moieties의 존재를 필요로합니다. AAV2 이외 Serotypes는 대체 절차에게 9를 사용 정화해야합니다. 헤파린 열 정화의 장점은 그것이 세슘 염화물 경사도 10을 사용 제작 그 이상의 감염 속도를 가지고 AAV 벡터를 생성하는 생각입니다. 그러나이 방법에는 몇 가지 단점도 있습니다. 예를 들어, 헤파린을 묶고 다른 단백질은 또한 정화 바이러스 재고가 나타날 수 있습니다. 헤파린 - 정화 벡터의 tropism이 벡터 titer 10, 구체적으로 흥분성의 20 억제 뉴런 (그림 2) 중 하나를 대상으로 우리의 접근 방법에 의해 영향을받을 수 있지만 AAV - 중재 transgene 표현의 Cre - 유도된 활성화를 고용하고 titre - 독립적입니다. 헤파린 열 정화하는 대안의 사용을보다 높은 바이러스 titer와 순수한 준비를 생산 iodixanol 밀도 구배의 사용이다세슘 염화물 기울기 10. 이 방법은 99% 순도 11보다 큰 벡터를 생성하기 위해 헤파린 열 정화와 함께하실 수 있습니다. 따라서 신중한 검토가 바이러스성 정화 방법은 자신의 특정 다운 스트림 응용 프로그램에 가장 적합한하는 개별 그룹으로 이동해야합니다. 이 프로토콜과 관련된 가장 일반적인 문제는 낮은 바이러스 titer입니다. 우리의 경험에서 이것은 일반적으로 낮은 transfection 효율, 또는 헤파린 칼럼에서 바이러스의 용출로 추적할 수 있습니다. 모든 transfection 자료 transfection하기 전에 상온에서해야하고, 테스트 transfections는 각 연구실에 최적의 조건을 찾기 위해 수행되어야합니다. transfection의 다른 방법은 lipofectamine과 같은, 고효율 있지만, prohibitively 비싼 수 있습니다. 또한, 헤파린 열 용출 솔루션의 농도와 산도는 헤파린 열 witho에서 virions 완벽하게 용출에 대한 중요UT 손상. 또 다른 중요한 포인트는 패키징 세포 조직 문화 요리의 표면에 잘 준수해야한다는 것입니다. 세포 절차를 수행하는 동안 어떤 단계에서 분리하는 경우 그것은 실험과 서리를 없애다 세포의 새로운 약병을 종료하는 것이 좋습니다. 설치류의 transgene 표현의 Spatio - 시간적 제어를 쉽게 정확한 해부 학적 타겟팅과 동물의 발달 단계에 의해 이루어진다. 효율적인 AAV - 중재 유전자 전송은 utero 12,13에 표시되었습니다. 성인 두뇌에서 stereotaxic 주사 후 rAA​​V 입자에 감염된 영역뿐만 아니라 바이러스 titer의 변화에​​ 의해뿐만 아니라 사출 매개 변수를 변경하여 훨씬 더 큰 영역에 아주 작은 타겟 지역에서 조정할 수 있습니다. 이것은 볼륨과 속도 주입과 바이러스 정지 14 폴리올 mannitol의 포함을 포함합니다. Mannitol은 또한 체계 rAAV 주입 15 일 이후에 조직의 다양한 감염을 향상시키기 위해 사용할 수 있습니다 &lt;/&gt;를 한모금. rAAV (약 4.7 KB)의 포장 용량은 아마도 이러한 바이러스 벡터에서 표현할 수있는 유전자의 관점에서 가장 제한 요소입니다. 그러나, 최근 연구는 이것이 부분적으로 별도의 rAAV 벡터에 큰 분할 또는 유전자 발현 카세트에 의해 극복하고 virions이 같은 세포 16 감염시 유전자 발현을 시작, 다리 순서를 소개 할 수있는 것으로 나타났습니다. rAAV 벡터에 의해 운반 유전자의 표현 수준도 크게 자체 무료 rAAV 벡터 17를 사용하여 향상된 수 있습니다. rAAV 벡터의 Stereotaxic 주사는 특정 지역과 관련된 방식으로 유전자 발현을 유도를위한 신속하고 저렴한 가격과 강력한 방법을 제공합니다. 조합 2 차 생성 RNA 간섭 전략 18 rAAVs 또한 특정 지역과 관련된 다운 유전자 노크 사용할 수 있습니다. rAAVs는 회로 및 셀 타입을 달성하기 Cre - 유전자 변형 생쥐 또는 셀 타입의 특정 발기인과 함께 조합하여 사용할 수예 : tet 시스템과 피팅 rAAVs가 바이러스 매개 유전자 발현 22,23 이상의 시간적 제어를 추가하면서, 높은 공간 해상도 2,19-21와 유전자 조작을 허용 특정 유전자의 표현. 이러한 예제는 이러한 벡터의 거대한 조합 가능성을 설명하고 올 년간 rAAV 기반 연구의 급속한 증가를 예측했다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Amicon 울트라 원심 필터 </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100,000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nuclease </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco의 수정 독수리 중간 (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> 10% FCS와 10 대 / ML penicillin/100 μg / ML 스트렙토 마이신과 보충 </td></tr><tr><td> Hek293 세포 </td><td> 미국 유형 문화 수집 </td><td> CRL - 1573 </td><td> 통로 30에서 사용 </td></tr><tr><td> HEPES는 염분 버퍼 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 51,558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap 헤파린 카트리지 </td><td> 시그마- 올드 리치 </td><td> 54,836 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove의 수정 Dulbecco의 중간 </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> 5% FCS와 보충 </td></tr><tr><td> 나트륨 deoxycholate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D5670 </td><td> 각 일괄 처리를위한 신선한 솔루션을 확인하십시오 </td></tr><tr><td> 15cm의 조직 문화 요리 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 157,150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 유능한 세포 </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkon 솔루션 </td><td> 피셔 과학 </td><td> NC9821357 </td><td> 폐기가 유출되기 전에 하룻밤 소독에 맡겨 </td></tr></tbody></table> 프로토콜에 필요한 표 1. 특정 시약

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

최근에는 재조합 adeno는 - 관련 바이러스 벡터 (AAV) 동물의 생체내 연구에 대해 점점 더 가치가 있고, 또한 현재 인간 임상 실험에서 테스트되고 있습니다. 야생 형 AAV는 parvoviridae 제품군의 비 병원성 회원 본질적으로 복제 - 결함이다. 광범위한 도입 프로필, 낮은 면역 반응뿐만 아니라 이러한 벡터와 달성 강하고 영구 transgene 표현들을 체외 및 생체내 유전자 전달에 대한 인기와 다양한 도구를 만들었습니다. rAAVs이 쉽고 저렴 실험실에서 생산하고, 자신의 유리한 안전 프로파일에 따라 수, 일반적으로 낮은 안전 등급 부여됩니다. 여기서 우리는 AAV1와 AAV2 모두의 capsid 단백질을 포함하는 키메라 rAAVs의 생산과 titering하는 방법을 설명합니다. 이러한 이른바 키메라 벡터의 사용은 높은 titres 주식 (AAV1)와 정화로 모두 부모 serotypes의 장점을 결합친화성 크로마 토그래피 (AAV2)에 의해. 이러한 AAV의 serotypes 모든 AAV의 serotypes의 연구 최고이며, 개별적으로 광범위한 감염 패턴을했습니다. 여기에서 설명한 키메라 벡터 AAV1과 AAV2의 전염성 속성을해야하기 때문에 신경, 골격 근육, 췌장, 다른 사람 사이에 신장을 포함하여 조직의 넓은 범위를 감염 것으로 기대하실 수 있습니다. 방법은 헤파린 열 정화를 사용하여 여기에 설명된 내용, 방법은 세슘 염화물 기울기 원심 분리를 통해 다른 정화 방법보다 높은 바이러스 titer와 청소기 바이러스 준비를 제공 믿었다. 또한, 우리는 이러한 벡터가 쉽고 빠르게 생산 감염성 입자의 수​​를 정확하게 읽기를 제공 titered 수있는 방법에 대해 설명합니다.

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Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 벡터를 위해 점점 중요 해지고 있습니다<em&gt; 생체내에</em&gt; 동물의 연구. 우리는 rAAVs는 실험실에서 생산되는 수 있으며, 어떻게 이러한 벡터가 생성 전염성 입자의 수​​를 정확하게 읽기를 제공 titered 수있는 방법에 대해 설명합니다.

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.3K 조회수.  University of Aberdeen. 재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 벡터를 위해 점점 중요 해지고 있습니다 생체내에 동물의 연구. 우리는 rAAVs는 실험실에서 생산되는 수 있으며, 어떻게 이러한 벡터가 생성 전염성 입자의 수​​를 정확하게 읽기를 제공 titered 수있는 방법에 대해 설명합니다.

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Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

B 세포의 재조합 생산 및 Retroviral 감염

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

아데노 바이러스 파생 시스템의 도움으로 효율적인 재조합 파르 보 바이러스 생산

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em&gt; Coxiella burnetii의</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...