이 방법은 ALS와 같은 중추 신경계 질환의 실험 적 치료를 위해 작은 동물을 깨우는 아데노 관련 바이러스 성 바이러스 성 트랜스게놈의 효율적인 장내 전달을 용이하게한다. 이 방법의 주요 장점은 바이러스 용액이 성공적인 주입 후 일시적인 마비를 유도하는 1 % 리도카인 염산염을 포함한다는 것입니다. 이 방법은 인트라더칼 자동화 상황의 성공을 판단하기위한 시각적 지표를 제공하지만, 전달의 성공률을 개선하기위한 충분한 연습이 필요합니다.
시술을 시작하기 전에 27 게이지 바늘을 25 마이크로리터 해밀턴 주사기에 부착하고 바늘의 경부 팁을 주사기의 체적 스케일과 정렬합니다. 그런 다음 조심스럽게 거품을 피하기 위해 주의, 주사기에 바이러스 용액의 10 게놈 사본에 4 x 10의 8 마이크로 리터를로드합니다. 다음으로, 12~30일 생후 12~30그램의 마우스를 침대 조각에 생리용 후드에 배치하고 상체를 멸균 거즈로 덮어 마우스를 진정시키고 물린 것을 피한다.
한쪽에 엄지 손가락으로 골반 거들 위에 마우스를 단단히 잡고 다른 쪽의 집게 손가락과 중간 손가락은 엄지 손가락과 집게 손가락으로 팽팽한 양골 골반 거들 사이의 피부를 유지합니다. 그런 다음 양측 골반 거들 사이에 털을 면도하고 요오드 기반 스크럽과 70 %의 에탄올로 노출된 피부를 살균하십시오. 아데노 관련 바이러스 용액의 직접 내트라테칼 전달을 위해, 양측 골반 거들 사이의 중간선을 따라 무척추 동물 공간을 만지고 손톱을 사용하여 피부내들여 들여쓰기를 우울하게 하여 L5 ~ L6 추간판을 나타냅니다.
꼬리의 베이스를 약간 부드럽게 회전하여 척추의 중간선을 드러내고 바늘의 벨을 동물의 머리쪽으로 조정합니다. 마우스가 제자리에 단단히 고정되어 있는 가운데, 척추의 중간선을 따라 바늘을 정렬하고 바늘을 들여쓰기의 중앙에 부드럽게 수직으로 삽입하여 주사기를 중앙 각선 평면에 보관합니다. 바늘이 뼈와 접촉하면 각도를 약 30도로 천천히 줄이고 바늘을 추간판으로 미끄러지게 합니다.
갑작스런 꼬리 영화는 막막 공간에 성공적으로 진입하는 신호입니다. 바늘이 추간판에 들어가면 팁이 단단히 고정된 느낌이 듭니다. 벡터 용액을 주입하고, 1분 동안 막장 공간 내에서 바늘을 유지한다.
그런 다음 누출을 최소화하기 위해 회전으로 바늘을 천천히 철회합니다. 즉시 주사 품질을 평가하고 마비에서 회복을 위해 케이지에 마우스를 반환 마우스 사지의 일시적인 약점을 점수. 적절한 실험적 엔드포인트에서 주입된 마우스의 팔다리와 머리를 폼 박스 커버의 경향이 있는 위치에 고정하고 가위를 사용하여 머리에서 사골까지 피부를 제거하고 제거합니다.
눈 사이에 두개골을 잘라 두개골의 중간선과 소뇌 위의 수평 선을 따라 잘라 양쪽에 두개골을 엽니 다. 핀셋을 사용하여 후두 뼈를 제거하고 안과 가위를 사용하여 양간 척추 운하를 엽니다. 양쪽에 갈비뼈를 자르고 척추의 상부 부분을 조심스럽게 제거합니다.
구부러진 핀셋을 사용하여 뇌를 들어 올리고 두개골 베이스의 신경을 끊습니다. 그런 다음 뇌와 척수 전체를 조심스럽게 추출하고 24 시간 동안 4 %의 파라 포름 알데히드에서 조직을 수정합니다. 고정 기간이 끝나면 냉동고는 뇌와 자궁 경부 및 요추 척수를 섭씨 4도에서 밤새 30 % 자당 용액으로 보호하고 액체 질소에서 동결하기 전에 최적의 절삭 온도 화합물에 포함시합니다.
그런 다음 저온을 사용하여 각 조직의 25 마이크로미터 두께의 섹션을 얻고 냉동 섹션을 섭씨 4도에서 0.01 mm PBS로 저장합니다. 조직의 면역 조직 화학 적 분석을 위해, 10 분 동안 1 %의 과산화수소와 무료 부동 섹션을 퇴각한 다음 PBS에서 10 분 세척하십시오. 다음으로 PBS에서 5%의 혈청과 0.3%의 비이온 세제를 함유한 블로킹 용액에 샘플을 증식한 다음, 적절한 1차 항체를 사용한 섭씨 4도에서 하룻밤 라벨을 부착한다.
다음 날, PBS 플러스 트위엔에서 3 10 분 세척으로 섹션을 세척하고 마지막 세척 후 1 시간 동안 실온에서 적절한 바이오티니드 이차 항체로 슬라이드를 배양한다. 인큐베이션이 끝나면, 방금 시연된 대로 신선한 PBST에서 섹션을 3번 세척하고 40분 동안 무한대 비오틴 peroxidase 복합체로 샘플을 배양한 다음 적절한 염색제로 염색합니다. 표지된 부분을 유리 현미경 슬라이드에 장착하고 장착 된 섹션이 완전히 건조되면 5 분 동안 무수 에탄올에 슬라이드를 담그십시오.
다음으로 슬라이드를 자일렌에 10분 간 담그고 적절한 장착 매체로 밀봉합니다. 그런 다음 100, 200 및 400 배율의 충전 결합 장치가 장착 된 가벼운 현미경으로 슬라이드를 이미지합니다. 자궁 경부 및 요추 척수 조직 섹션의 eGFP 면역 염색은 약점 점수 0, 약점 점수 1의 마우스에 약간 향상된 트랜스덕션을 가진 마우스의 요추 척수에서 거의 또는 전혀 트랜스포팅을 제시하고, 약점 점수가 4 또는 5인 마우스에서 강하고 광범위한 트랜스덕션을 나타낸다.
다양한 정도의 과도 사지 약화를 나타내는 마우스로부터 척수 조직 단면의 GFP 염색 강도의 정량화는 바이러스 용액 주입 후 약점의 심각성이 척수 전도의 정도와 밀접한 상관관계를 나타낸다. 뇌에서, 강력한 eGFP 신호는 후각 전구, 등쪽 전두엽 피질, 전염기류 및 해마의 CA3 영역, 소뇌 피질 및 뇌줄기의 한계 영역에서 검출되며, 얼굴 핵, 코로이드 신경전증 및 에펜디말 상피 세포를 포함한다. 전방 혼의 운동 뉴런은 또한 척수의 다른 수준에서 강하게 전해됩니다.
더욱이, 피질에서, 피라미드 세포를 포함하는 GFP 양성 뉴런은 마이크로글리아, 성상세포 및 올리고덴드로시드를 포함하는 각종 신경교 세포 모형뿐만 아니라 검출됩니다. 이 기술은 신경학 필드에 있는 연구원이 중추 신경계 질병에 작은 깨어 있는 동물에 있는 직접적인 장내 납품의 치료 효력을 탐구하는 가능하게 합니다.
