저자 분류 및 박사 그레이엄 H. Diering 그의 원심 분리기를 사용 하 여 소규모 프로토콜 PSD 분별에 대 한 제공에 대 한 존스 홉킨스 대학에서 박사 리처드 L. Huganir의 실험실에서 수 박사 에릭 C. 볼 턴 감사 합니다.

동물 주제를 포함 하 여 모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 어바나-샴페인 일리노이의 대학에 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1. 쥐 식민지를 유지 하
<ol><li>Sprague Dawley 쥐 ( 재료의 표참조)를 번 식 하 고 12-h 빛 어두운 주기와 음식과 물에 대 한 ad libitum 액세스 표준 조건에서 그들을 유지 하는 것.</li>
	<li>출생 후 하루 (P) 28에 쥐 새끼를 유아와 2-4 남성 또는 여성 littermates의 그룹에서 그들을 집.</li>
	<li>확인을 위해 비 독성 영구 블랙 마커 남성 쥐의 꼬리를 표시 합니다.</li>
	<li>주 당 3 번 남성 쥐 무게와 그들의 bodyweights를 기록.</li>
</ol>2입니다. ECS 시스템의 준비
<ol><li>오전 7 시 30 분, 동물 준비 실에서 벤치를 소독 하 고 벤치에는 ECS 컴퓨터 (펄스 발생기)를 배치 합니다.</li>
	<li>장소는 개별 남성 쥐 새 장에 깨끗 하 고 빈 뚜껑 200-250 g를 무게. 이 모든 남성 쥐 ECS 유도 치료를 반복 합니다. 30 분 동안 길 들 쥐를 보자.</li>
	<li>쥐가 그들의 감 금 소에서 habituating는, ECS 유도 대 한 펄스 발생기 100 펄스/s, 0.5 ms의 펄스 폭, 0.5의 충격 기간의 주파수로 설정 s, 및 55의 전류 (그림 1A).</li>
	<li>"리셋" 버튼을 누르면 하 고 "준비" 버튼이 켜져 확인 하 여 펄스 발생기를 준비 합니다. 귀 클립 펄스 발생기에 연결 되지 않습니다 다음 몇 초 동안 "충격" 버튼을 누릅니다 있는지 확인 합니다. 참고:이 시점에서, 펄스 발생기는 ECS 유도 대 한 준비.</li>
	<li>펄스 발생기에 귀 클립을 연결 합니다.</li>
</ol>3입니다. 급성 ECS의 유도
: 참고 그림 1B, 상단 패널.
<ol><li>멸 균 식 염 수와 귀 클립 젖은 고 그들은 포화 상태를 확인 합니다.</li>
	<li>식 염 수에 젖은 거 즈에서 그들을 포장 하 여 멸 균 식 염 수와 쥐의 귀를 젖은. 일단 그들이 젖은 거 즈를 제거 합니다.</li>
	<li>귀, 주요 연골 밴드 넘어 위치 당 하나의 클립을 연결 합니다.</li>
	<li>그는 진정한 루프 설립; ECS 시스템에서 확인 그렇지 않으면, 오류 메시지 또는 "1"의 컴퓨터에 표시 됩니다.</li>
	<li>두께, 비-금속 장갑 착용. 부드럽게 gloved 손에서 쥐를 잡고, 몇 초 동안 "충격" 버튼을 누르고 천천히 발작을 관찰 하기 위해 쥐에 그립을 풀어. "발작" 가짜 (NS) 제어, 쥐를 동일 하 게 처리 하지만 현재 제공 하지 않습니다.</li>
	<li>Clonus 시작으로 귀 클립을 분리 하 고 (1 단계), "머리를 끄 덕" (2 단계), "forelimb clonus" "입과 얼굴의 움직임"를 포함 하는 개정된 라신의 규모22 에 따라 발작 동작 기록 (3 단계), "양육 forelimb clonus와" (4 단계), 그리고 "양육과 forelimb clonus 떨어지고" (5 단계). 나포 약 10 마지막으로 해야 s; 타이머를 사용 하 여 발작 기간을 기록 합니다.</li>
	<li>나포 종료, 다음 홈 그것의 감 금에 쥐를 반환 합니다. 쥐의 발작에서 회복 되도록 또 다른 5 분 동안 쥐를 모니터링 합니다. 장에 홀로 지 내게 그것을 유지 하 고 회복 실에 감 금 소를 반환.</li>
	<li>다음 쥐에 ECS 유도 반복 합니다.</li>
	<li>나머지 하루 아침에 한 번 이상 있고 그들은 실험에 대 한 안락사는 때까지 다음 날 오후에 한번 걸쳐 쥐를 모니터링 합니다. 참고: ECS 유도 메서드는 부수적 부작용으로, 주의 요하는 임상 증상을 발생할 수 있습니다. 예를 들어, ECS 유도 프로토콜 수 쥐를 15 s 및 원인 불필요 한 고통 보다 더 오래 지속 되는 발작을 유도 하 고 있다. 이 경우에, 다이아 제 팜 (10 mg/kg, i.p.) 또는 pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.)를 사용 하 여 발작을 종료 합니다. 쥐 호흡 곤란 이나 심한 행동 이상 발작 정지 다음 개발, 경우 잘린 뒤 이산화탄소 흡입에 의해 그들을 안락사.</li>
</ol>4입니다. 만성 ECS의 유도
주: 그림 1B, 하단 패널을 참조 하십시오.
<ol><li>7 일 연속, 위의 1-3 단계에 설명 된 대로 아침에 같은 시간에 하루 한 ECS를 유도.</li>
	<li>모니터는 쥐 두 번 하루에 그들은 그들의 가정에 반환 된 후 연습장.</li>
</ol>5. 균질 및 쥐 된의 분류
참고: 그림 2를 참조 하십시오.
<ol><li>자당 320 m m, 5mm 나트륨 파이 인산, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, 포함 하는 신선한 균질 버퍼 (솔루션) 준비 200 nM okadaic 산 및 효소 억제제. 필터-필터를 사용 하 여 진공 여과 0.22 μ m 기 공 크기와 버퍼를 소독 하 고 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>주어진된 시간에 가리킨 다음 ECS 급성 또는 만성 ECS (그림 1), 5-10 분, 잘린은 단두대를 사용 하 여 다음 공동2 흡입에 의해 쥐를 안락사.</li>
	<li>두뇌를 제거 하 고 앞에서 설명한23,24얼음에 배치 하는 금속 격판덮개에 된 해 부.</li>
	<li>30 m m 조직 문화에 한 쥐에서 장소 2 된 접시 하 고가 위를 사용 하 여 작은 조각으로 그들을 말하다.</li>
	<li>1 mL 피 펫을 사용 하 여 수동 유리 균질 화기를 다진된 된 전송 하 고 차가운 균질 버퍼 (솔루션, 단계 5.1)의 1 mL를 추가 합니다. 유리 균질 화기에 둥근 유 봉을 삽입 합니다. 얼음에 유리 균질 화기를 실행 하는 동안 부드럽게 그리고 꾸준히 뇌졸중 위아래로 10-15 시간 1 분, 대 한 유 봉에 hippocampal 조직의 작은 조각을 사라질 때까지.</li>
	<li>1 mL 피 펫을 사용 하 여 1.7 mL microcentrifuge 튜브에는 homogenate를 전송 하 고 불용 성 조직 및 핵 (P1 분수)를 포함 하는 펠 릿에서 homogenate postnuclear 상쾌한 (S1 분수)를 구분을 4 ° C에서 10 분 동안 800 x g에서 원심. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 두 개의 별도, 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 50 µ L 및 S1 분수의 950 µ L를 전송 및 얼음이 튜브를 저장. 얼음에 P1 분수 펠 릿을 저장 합니다.</li>
	<li>S1 분수 (950 µ L) 13, 800 x g와 상쾌한 (S2 분수), 수용 성 cytosolic 단백질 농축 분리 하 4 ° C에서 10 분 원심 하 고 펠 릿 (P2 분수), 막 바인딩 단백질, synaptosomal 단백질을 포함 한 농축. S2 분수 1 mL 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge에 전송 하 고 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 물 1 mL 피 펫을 사용 하 여 정화의 498 µ L에서 펠 릿 (P2 분수)를 resuspend. 추가 1 M HEPES (pH 7.4)의 2 µ L 4 mM HEPES (pH 7.4)의 최종 농도 달성 하기 위해 20 µ L 피 펫을 사용 하 여. Resuspended P2 분수 얼음에 30 분이 게에 대 한 동요와 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>BCA 분석 결과 사용 하 여 S1, S2, P2 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 1 mg/mL 농도 달성-80 ° C까지 사용, 저장을 각 분수를 50 mM HEPES (pH 7.4)를 추가 하거나 PSD를 분리 하는 P2 분수를 처리 합니다.</li>
</ol>6. 원유 막 단백질 (P2) 분수에서 PSD의 격리
<ol><li>Lysed 상쾌한 (LS2 분수)와 lysed 펠 릿 (LP1 분수)를 분리 하는 P2 분수 (500 µ L) 25000 x g와 4 ° C에서 20 분을 원심. LS2 분수 1 mL 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>250 µ L 1 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS 버퍼 x 1에 1% 세제의 혼합 50 mM HEPES (pH 7.4)의 250 µ L에서 LP1 펠 릿을 resuspend. 15 분에 대 한 부드러운 교 반으로 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>25000 x g와 펠 릿 (PSD 분수)에서 상쾌한 (비 PSD 분수)를 분리 하 4 ° C에서 3 h resuspended LP1 펠 렛 원심 상쾌한 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 제거 하 고 50 mm HEPES (pH 7.4) 100 µ L에서 PSD 펠 릿 resuspend 200 µ L 피 펫을 사용 하 여.</li>
	<li>LS2, 비-PSD를, 그리고 BCA 분석 결과 사용 하 여 PSD 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 1 mg/mL 농도 달성-80 ° C에서 사용까지 저장을 각 분수를 50 mM HEPES (pH 7.4)를 추가 합니다. 참고: 모든 솔루션 (즉, 해결책, HEPES 버퍼, 그리고 PBS 버퍼) 5-6 단계에서 사용 되는 정화 물 이온 및 유기 오염 물질과 입자의 무료 여야 한다.</li>
</ol>7. 서 부 럽
<ol><li>각 단백질 분수 얼음에 녹여 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브 (S2, P2, 그리고 1 mg/mL의 PSD) 각 분수의 12 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>5 x SDS 샘플 버퍼의 3 µ L을 추가 하 고 물 욕조에 30 분 동안 75 ° C에 품 어. 차가운 실내 온도 (RT) 아래로 샘플.</li>
	<li>4-20% 그라데이션 15 잘 빗 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 젤 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 각 우물에 단백질 샘플의 10 µ L를 로드 합니다. SDS 페이지 장치에 버퍼를 실행에 80-100 V에서 젤을 실행 (25mm Tris, 190 m m 글리신, 및 0.1 %SDS; pH 8.3). 참고: 각 젤 NS 쥐와 급성 또는 만성 ECS 다음 다른 시간 지점에서 ECS 쥐에서 단백질 견본을 포함 해야 합니다.</li>
	<li>전송 SDS 페이지에서 단백질 젤 25-30 V에서 전송 장치에 비닐 difluoride (PVDF) 막 (60 mA) 전송 버퍼에 9-12 h (25mm Tris, 190 m m 글리신, 및 20% 메탄올; pH 8.3).</li>
	<li>전송 장치에서 PVDF 멤브레인을 제거 하 고 Tris 버퍼 염 분 (TBS)에서 실시간 다중 목적 회전에 5 분에서 그것을 씻어합니다</li>
	<li>5% 우유에 막 차단 및 0.1% 트윈-20 1 헤에 대 한 TBS에서 품 어 그것 세척 버퍼에 1 차 항 체 (표 1)에서 (1% 우유와 0.1 %TBS 트윈-20) 4 ° C에서 다중 목적 회전에 하룻밤 (희석에 대 한 재료의 표 참조).</li>
	<li>워시 버퍼에서 4 시간 10 분 대 한 멤브레인을 세척 하 고 다음 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 그것을 품 어-실시간에 다중 목적 회전에 1 시간에 대 한 버퍼를 세척에 2 차 항 체를 활용</li>
	<li>5 분 4 시간 10 분 대 한 막 워시 버퍼 그리고 TBS로 세척.</li>
	<li>1 분에 대 한 향상 된 chemifluorescence 기판으로 막 품 어 하 고 x 선 필름에 노출. 필름 프로세서와 함께 노출된 영화를 개발할 수 있습니다.</li>
</ol>8입니다. 서 부도 말의 정량화
<ol><li>검색 양과 TIFF 파일로 오 컴퓨터에이 파일을 저장 합니다.</li>
	<li>"파일," "이미지 열기," 오른쪽 화살표 "그레이 스케일" 회색조 이미지로 ImageJ 프로그램에서 서쪽 오 점 파일을 엽니다</li>
	<li>ImageJ 도구 모음에서 사각형 선택 도구를 선택 하 고 관심사의 단백질의 하나의 서양 오 점 밴드를 포함 하는 사각형을 그립니다.</li>
	<li>"분석" 아래 "측정을" 지역 및 선택한 밴드의 평균 밀도를 했다.</li>
	<li>그것의 크기와 모양을 변경 하지 않고 배경 영역에 사각형을 이동 합니다. 및 배경의 밀도 8.4 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>관심사의 단백질의 배경 빼고 밴드 밀도 주는 서쪽 오 점 밴드의 배경 밴드의 밀도 값을 뺍니다.</li>
	<li>관심의 모든 서쪽 오 점 밴드 8.2 8.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>Α-Tubulin;와 같은 내부 관리 유전자 제품의 배경 빼고 밴드 밀도 의해 관심사의 단백질의 배경 빼고 밴드 밀도를 나눕니다 이 단계는 관심사의 단백질의 정규화 된 값을 생성합니다.</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기, ECS 유도 하는 방법을 쥐에 그들의 된 신경 활동의 글로벌 자극 elicits 설명 합니다. ECS는 electroconvulsive 치료, 임상 인간1,2,3약물 내 화 우울증 질환을 치료 하는 데 사용 되는 동물 모델입니다. 심한 우울증 치료 electroconvulsive 치료의 사용에도 불구 하 고 정확한 기본 메커니즘 불분명 남아 있습니다. ECS 경우 새로운 조사를 광범위 하 게 사용 되었습니다 때문에 ECS 설치류에 안티 depressant 같은 행동을 유도 하 고 자극 hippocampal 성체4,32, 성인 선천적인 신경이 뇌의 해 마에 안티-depressant 동작5,32에 기여 한다.
ECS stereotaxically 이식된 전극, 막 전극, 또는 귀 클립 전극33,34현재 배달 시 설치류에 심한에 약한 일반된 토 닉 clonic 발작을 유도합니다. 환자에서 뇌 파 기록 보다 일방적인 자극35,36을 양자 전기 자극 하면 더 유명 하 고 더 이상 일반화 된 발작 계시 했다. 우리의 ECS 유도 방법에 토 닉 clonic 발작 양측 자극36에의해 갖는 인간에서 발작을 흉내 낸 두 귀에 연결 된 비 침범 성 귀 클립 전극을 통해 현재 배달에 의해 유발 됩니다. 우리가 진정 또는 무감각 적용 되는 쥐에서 ECS의 효능을 확인 하지 않은, 그것은 가능한 쥐를 마 취 약을 주는 될 수 있는 전기 자극에 의해 유도 된 발작의 정도 줄일 수는 때문에 사실 마 취 상태가 순수 두뇌 네트워크에 향상 된 금지 및 약화 흥분 성의 톤 연관입니다. 또한, ECS 유도 방법에 중요 한 단계 4-5 단계를 유도 전류 강도를 실험적으로 토 닉-clonic 발작 나이, 무게, 및 설치류의 종에 따라 일반화입니다.  우리의 ECS 유도 방법 4-5 단계 발작을 유도 하는 깨어 있는 남성 Sprague-Dawley 쥐 200-250 g를 무게에서 몇 초 이내에 대 한 최적화 되었습니다. ECS 유도 마 취 상태에서 쥐 사용 하는 경우 강도, 기간, 및 현재 제공의 주파수 단계 4 ~ 5에서에서 배열 하는 발작의 성공적인 유도 대 한 수정 해야 합니다.
ECS 신경 과다 자극 하 고 매우 낮은 사망률33, chemoconvulsants, 등 pilocarpine kainite, 상태 epilepticus 유도 고 있는 달리 일시적 급성 발작의 원인이의 이점을 제공 합니다. 자발적인 재발 성 발작 및 심각한 조직학 변경37,38의 만성 표현. ECS은 화면 항 간 질 약33,34을 정기적으로 이용 되어, 비록 급성 ECS 만성 ECS 만성 간 질 발생을 초래 하지 않습니다 및 따라서 epileptogenesis를 공부 하는 동물 모델에서 사용할 수 없습니다. 대신, ECS는 널리 고용 되어 있는 두뇌 활동의 광범위 한 상승 식 또는 시 냅 스에 지속적인 변화에 공헌 하는 시 냅 스 단백질에 vivo에서,의 posttranslational 수정 변경 범위를 검사 하 강도 및 구조 (그림 3 및 그림 4)10,40. 이 연구에서 우리만 익숙해 남성 쥐 ECS 후 PSD 단백질의 양에 여성 쥐의 사이클 단계는 발 정기의 예기치 않은 효과 제외. 그러나, 그것은 정면 피 질과 해 마39, 발 정기 주기를 제어 하는 호르몬 변화는 기저 미치지 수 있습니다 암시의 PSD 지역에서 PSD-95와 SAP102를 포함 하 여 비 계 단백질에 성별 차이가 있다 관찰 되었다 PSD 단백질의 양입니다.
여러 메서드는 ECS 성체, synaptogenesis, 및 시 냅 스가 소성5,6,7,,89, 에 변화를 유도 하는 정도 검사 하 고용 되었습니다. 11 , 40. electrophysiological 녹음의 흥분 성의 postsynaptic 전류 (EPSC)는 널리 흥분 성의 glutamatergic의 시 냅 스 강도 변화 synapses21감지 하는 데 사용 됩니다. 예를 들어 소형 EPSC 녹음 마우스 급성 ECS41다음의 레이어 II-III의 피라미드 대뇌 피 질의 뉴런에서 흥분 성의 시 냅 스 강도 homeostatic 상세화 밝혀졌다. 그러나, ECS 유도 시 냅 스가 소성에 공헌 하는 시 냅 스 단백질의 식별은 도전 electrophysiological 녹음 유전자 녹아웃와 결합 해야 하기 때문에 또는 특정 후보 시 냅 스 단백질의 때 려 눕. 글루타민 산 염 수용 체 postsynaptic 멤브레인 및 PSD에서 풍성 하 게 하는 시 냅 스 단백질의 수준에 변화 조절 강도와 흥분 성의 시 냅 스 전송17,,1825의 효능. Immunohistochemistry 검사 시 냅 스 단백질의 표현에 ECS 유도 된 변화를 사용할 수 있습니다, 하지만이 기술은 한 번에만 1-2 후보 시 냅 스 단백질을 확인할 수 있습니다 하며 구체적으로 그들을 인식 하는 잘 검증 된 항 체 일반적인 발생 하지 않고 얼룩.
서쪽에 게 더 럽 히기와 함께에서 뇌 조직의 subcellular 분별 전기 생리학 이상과 ECS에 의해 변경 되는 시 냅 스 단백질 식별 immunohistochemistry 장점이 있습니다. 뇌 조직의 subcellular 분류 방법은 신속 하 고 원유 생화학 녹는 cytosolic 단백질 (S2 분수)에서 원유 막 (P2 분수), ER 및 Golgi 막, 막 바인딩된 세포, 원형질 막를 포함 하 여 분리 하 고 시 냅 스 터미널 막 형태 synaptosomes42,,4344봉인. PSD 분수 더 일 수 있다 시 냅 스 단백질42,,4344풍부 하 P2 분수에서 격리. PSD 분수의 편견된 proteomic 분석 ECS에 의해 변경 되는 해당 수준의 모든 PSD 단백질을 식별할 수 있는. 서 부 럽 PSD 단백질, 일반적인 밴드에서 쉽게 확인 될 수 있는의 식을 변화 검사 신속 하 게 수행할 수 있습니다.
뇌 분별의 이전 방법 설치류 뇌 조직42,43,44만드는이 기술을 사용 하기 위해 도전 검사 때 용 해 또는 개인에서 막 단백질의 큰 금액을 필요 설치류 두뇌 또는 단일 뇌에서 특정 한 두뇌 지역입니다. 양적 비교는 프로테옴 한 뇌 영역에서 다른 및 제어 동물에서 유전자 변형 동물 또는 동물을 특정 치료를 겪고 있다 증가 수요가 있다. 따라서, 우리 개정 하 고 분리 한 쥐의 두 된에서 원유 가용성과 막 분수 전통적인 뇌 분류 방법 최적화. 우리의 소규모 원유 분별 프로토콜 성공적으로 고립 된 원유 P2 막 분수 cytosolic S2 녹는 분수에서 막 도약 PSD95에서 검색 되었습니다 반면 세포질 단백질 α-tubulin P2 분수에의 부족에 의해 표시 된 대로 P2만 하지 S2 분수 (그림 3A 와A 그림 4). 여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 우리는 양적 표시 급성 ECS 크게 증가 단계61 식 및 그것의 기판, GluN2B와는 extracellular 신호 통제 키 1/2에서 원유의 티로신 인 산화를 감소 48 h 급성 ECS10다음에 쥐 된의 막 P2 분수.
예기치 않게, S2 분수 포함 된 synaptophysin; 단계61; 그리고, 훨씬 낮은 정도로, GluA2 (A 그림 3및 그림 4A). 단계61 는 당화 완전 한 막 단백질26 바인딩과 그물 (ER) 및 PSD45와 관련 된입니다. 원유 막 펠 릿 (P2 분수)를 분리 하는 원심 않았을 수도 작은 공의 synaptosomes, endosomes 포함 된 모든 시 냅 스 소포에 충분 한을 포함 하는 GluA2 및 단계61리소좀이 가능 하다. 그럼에도 불구 하 고, GluN2B, GluA2, 및 PSD95의 농축을 취소 및 α-tubulin P2 분수에서의 부족 우리의 분별 프로토콜 막-바인딩 단백질 및 시 냅 스 소포와 연결 되지 않은 막 횡단 단백질 풍부 수와 조 막 P2 분수에서 endosomes입니다.
조 막 P2 분수 포함 synaptosomes, P2 분수에서 시 냅 스 단백질의 시험 활동 종속 변경의 한 가지 한계는 그들의 변경의 정확한 위치를 확인할 수 없습니다. PSD에서 풍성 하 게 하는 시 냅 스 단백질 결정 될 경우, PSD을 더 생 화 확 적인 분류를 사용할 수 있습니다. PSD 분별의 이전 방법을 사용 하려면 많은 양의 설치류 뇌 조직 (즉, 10-20 설치류 두뇌) 및 자당 기온 변화도42,,4344. 이 전통적인 방법에서 단일 쥐의 두 된 PSD 분수의 충분 한 금액을 분리 하다, 때문에 우리가 적응 자당 그라데이션20,21 없이 PSD 분수를 직접 분리 하는 간단한 방법 . 이 방법에 대 한 수익률 부 럽을 포함 한 생 화 확 적인 분석 실험에 대 한 충분 한 PSD 단백질의 30-50 µ g. 우리의 방법은 풍요롭게 하는 PSD95, GluN2B, 및 GluA2, PSD 분수에 집중으로 알려져 있습니다, 그리고 PSD 분수 만성 ECS 유도 (그림 3 및 그림 4)를 다음에 GluN2B 식의 변화를 감지.
여기, 우리의 양적 서쪽 오 점 분석 3 h와 급성 ECS (그림 3C) 다음 24 시간에서 P2 및 PSD 분수에 GluA2 식에 중요 한 변화가 나타났다. GluN2B 식 P2 분수에 변형 되었다 하지만 급성 ECS (그림 3B), extrasynaptic 대 시 냅 스의 가능한 차등 규제 제안 후 3 h 24 h에서 PSD 분수에서 증가 추세를 표시 GluN2B 포함 된 NMDA 수용 체입니다. 우리는 또한 GluN2B 식 후 만성 ECS P2 분수에서 감소 추세를 표시 하 고 24 및 96 h 만성 ECS (그림 4B) 다음에 PSD 분수에 크게 감소 했다 관찰 했다. 비록 높은 투기 같은 제거 다음 ECS의 반복적인 유도 PSD에서 GluN2B의 extrasynaptic 사이트에 PSD 막 또는 측면 확산에서 직접 국제화를 포함 하 여 여러 메커니즘을 통해 중재 수 있습니다. 우리의 이전 보고서 신경 활동의 장기 기능 향상을 뚜렷이 고려 단계61 식 증가 하 고 우리의 결과 교양된 hippocampal 신경46, P2 분수에 티 르-GluN2B의 인 산화를 감소 그는 P2와 PSD 분수 만성 ECS로 인해 가능성이 있을 수 있습니다 후에 GluN2B 식에서 감소 향상 단계61 식 및 extrasynaptic 막에서 GluN2B의 후속 제거.
요약 하자면, 우리는 우리의 소규모 PSD 분류 방법, ECS 유도 프로토콜 함께에서 해준다 vivo에서 차별화 하는 글루타민 산 염 수용 체의 활동-종속 규칙 postsynaptic 막에 증명 하고있다 총 플라즈마 막 대 extrasynaptic 막을 포함 하 여. 이 프로토콜 흥분 성의 시 냅 스에서 시 냅 스 단백질 어떤에 쉽게 적용할 수 있습니다 그리고 다른 설치류 된 또는 다른 뇌 영역에 대 한 조직 무게에 따라 각 솔루션의 볼륨을 조정 하 여 수정할 수 있습니다. 따라서, 우리의 소규모 PSD 분류는 다양 한 메서드와 검사, 약리, 유전 또는 기계적 처리에 각 동물에 postsynaptic 단백질의 비보에 변화 하는 미래의 어플리케이션을 위해 채택 될 수 있다.

Electroconvulsive 치료 심한 약물 내성 우울증, 양극성 우울증, 파 킨 슨 병의 질병, 그리고 정신 분열 증1,2를 포함 하 여 주요 우울증 장애 환자 치료에 사용 되었습니다. 이 치료에서 발작 epicranial 전극1,2,3를 통해 마 취 환자의 머리에 전달 하는 전기 자극에 의해 생성 됩니다. ECS의 반복적인 관리 임상 약물 내성 우울증 장애1,2,3에 도움이 되었습니다. 그러나, 인 간에 있는 항우울제 효과의 장기 효 험 기본 정확한 메커니즘은 애매 남아 있다. ECS는 electroconvulsive 치료의 동물 모델 이며 치료 메커니즘을 조사에 널리 사용 됩니다. 설치류, 급성 ECS와 ECS 치료 만성는 된 성체를 촉진 하 고 신경 네트워크4,5, 재구성 인지 유연성에서 향상에 기여할 것입니다. 또한, ECS에 의해 두뇌 활동의 글로벌 상승 같은 두뇌 파생 neurotropic 요소6, 그리고 여러 단백질, N-메 틸-D-aspartate metabotropic 글루타민 산 염 수용 체 17 등 성적 증명서의 풍부 변경 (NMDA) 형식 글루타민 산 염 수용 체 소 단위7. 이러한 변화는 시 냅 스 번호, 구조, 및 해 마7,,89에서 힘의 장기 수정 중재에서 포함 된다.
ECS 모델에 전기 자극 일반화 된 토 닉 clonic 발작10,11연상 stereotaxically 이식된 전극, 막 전극, 또는 귀 전극을 통해 설치류에 전달 됩니다. 전극의 stereotaxic 주입 뇌 수술을 포함 하 고 상해를 최소화 하기 위해 실험의 수술 능력을 개선 하기 위해 상당한 시간이 필요 합니다. 적은 침략 적인 각 막 전극 각 막 찰과상과 건조를 일으킬 수 있고 마 취 필요. 귀 클립 전극의 사용 때문에 수술이 나 마 취 없이 설치류에 사용 될 수 있는 최소한의 부상의 입을 이러한 제한을 무시 합니다. 사실, 우리 귀 클립 전극을 통해 현재 깨어 배달된 쥐 안정적으로 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 유도 및 변경 된10그들의 시 냅 스 단백질 발견.
ECS 유도 풍요의 설치류의 특정 두뇌 지구에서 시 냅 스 단백질을 검사, 그것은 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 가장 적합 한 실험 방법을 선택 하는 것이 중요. 두뇌의 subcellular 분별 녹는 cytosolic 단백질;의 원유 격리에 대 한 허용 막 단백질; 세포 기관이 경계 단백질; 그리고 PSD12,,1314같은 특별 한 subcellular 구조에 단백질. PSD는 신경에 시 냅 스 단백질은 매우 집중에서 그리고 postsynaptic 막12,,1315근처에 있는 조밀 하 고 잘 조직 된 subcellular 도메인. PSD의 풍요로 움과 postsynaptic 글루타민 산 염 수용 체, 비 계 단백질, 및 PSD12 신호 변환 단백질의 기능에 동적 변경 이후는 PSD에 농축 하는 시 냅 스 단백질의 연구에 대 한 유용 , 15 , 16 , 17 시 냅 스가 소성 및 여러 가지 신경 장애17,18에서 관찰 하는 synaptopathy와 상관 있다. PSD를 정화 하는 데 사용 하는 이전 subcellular 분류 방법 자당 기온 변화도14, 의 차등 원심 분리에 의해 두뇌의 원유 막 분수에서 세제 불용 성 분수의 참여 19. 많은 양의 설치류 두뇌14,19요구 한다이 전통적인 방법으로 주요 도전 이다. 격리 치료 당 PSD 분수를 10-20 설치류의 준비 광범위 한 비용 및 시간 투자를 요구 하 고 많은 치료 하는 경우에 실제적으로 가능 하지 않습니다.
이 문제를 극복 하기 위해 우리가 직접 PSD 분수 없이 자당 기온 변화도 원심 분리20,21, 격리 하 고 단일 쥐의 된에서 PSD 격리를 적용할 수 있도록 개정 하는 간단한 방법 적응 두뇌입니다. 우리의 소규모 PSD 분류 방법에 대 한 수익률 2 된, immunoprecipitation 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 포함 하 여 생 화 확 적인 분석 실험에서 사용 하기 위해 충분 한에서 PSD 단백질의 30-50 µ g. 부 럽 (PSD-95) postsynaptic 밀도 단백질 95의 농축 및 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin 배제를 공개 하 여 PSD를 고립 시키기를 위한 우리의 방법의 성공을 보여 줍니다. 우리의 ECS 유도 및 소규모 PSD 분류 방법 다른 설치류 뇌 영역에 쉽게 적응할 수 있으며 PSD 단백질의 표현에 ECS의 효과 평가 하는 비교적 간단 하 고 안정적인 방법을 제공.

<table><tbody><tr><td>Spargue-Dawley rat</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>ECS supplies</td></tr><tr><td>A pulse generator</td><td>Ugo Bsile, Comerio, Italy</td><td>57800</td><td>ECS supplies</td></tr><tr><td>MilliQ water purifying system</td><td>EMD Millipore</td><td>Z00Q0VWW</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Em science</td><td>SX 1075-3</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>221368</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E9884</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H0527</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Okadaic acid</td><td>TOCRIS</td><td>1136</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>NaVO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72060</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS05RE</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>WPI (World Precision Instruments)</td><td>500216-G</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>30 mm tissue culture dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Glass homogenizer and a Teflon pestle</td><td>VWR</td><td>89026-384</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&amp;nbsp;</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT/XF Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004521</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#23228</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#1859078</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)</td><td>BIO-RAD</td><td>#4561086S</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Running Buffer</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>Western blot supplies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane&amp;nbsp;</td><td>Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Transfer Buffer</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>Western blot supplies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>436143</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Methanol&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergent for PSD isolation</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Module&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703935</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Nonfat instant dry milk</td><td>Great value</td><td></td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Multi-purposee rotator&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model-2314</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Hyblot CL Autoradiography Film</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&amp;nbsp;</td><td>E3018 (1001365)</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Enhanced chemifluorescence substrate&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>a Konica SRX-101A film processor</td><td>KONICA MINOLTA</td><td>SRX-101A</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Antibody&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Cell Signaling</td><td>#2507</td><td>Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Rabbit</td></tr><tr><td>Synaptophysin</td><td>Cell Signaling</td><td>#4329</td><td>Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Rabbit</td></tr><tr><td>alpha-Tubulin</td><td>Santacruz</td><td>SC-5286</td><td>Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Mouse</td></tr><tr><td>GluN2B</td><td>Neuromab</td><td>75-097</td><td>Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Mouse</td></tr><tr><td>GluA2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Sab 4501295</td><td>Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Rabbit</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Santacruz</td><td>SC-23892</td><td>Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Mouse</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>715-035-150</td><td>Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>711-035-152</td><td>Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey</td></tr></tbody></table>

electroconvulsive seizures in rats and fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in postsynaptic density proteins

Electroconvulsive 발작 (ECS)는 electroconvulsive 치료, 심한 우울증에 대 한 가장 효과적인 치료의 실험 동물 모델. ECS 낮은 사망률과 신경 죽음으로 일반화 된 토 닉 clonic 발작을 유도 하 고 화면 항 간 질 약에 널리 사용 되는 모델 이다. 여기, 우리는 ECS 유도 방법을 설명 간단한 55-mA 전류 0.5에 대 한 전달 되는에서 남성 s 쥐 귀 클립 전극을 통해 무게에 200-250 g. 이러한 양자 자극 생산 단계 4-5 clonic 발작 지속 약 10 s. 급성 또는 만성 ECS의 정지 후 대부분 쥐 행동 구별 되도록 복구 "발작" 쥐 사기. ECS는 세계적으로 두뇌 활동을 끌어올리고, 때문에 그것 또한 활동 종속 변경 시 냅 스 단백질 및 여러 방법을 사용 하 여 시 냅 스 강도에 미치는 영향의 검토에 사용 되었습니다. 특히, 서 부 럽 함께에서 postsynaptic 밀도 (PSD)의 subcellular 분류 전문된이 시 냅 스 구조에서 시 냅 스 단백질의 풍부의 양적 결정 수 있습니다. 설치류 두뇌의 큰 금액을 필요로 하는 이전 분류 방법, 달리 여기 자당 기온 변화도 원심 분리 하지 않고 하나의 쥐의 된에서 PSD를 분리 하는 소규모 분류 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 고립 된 PSD 분수 postsynaptic 막 단백질, PSD95, GluA2, GluN2B, 등을 포함 보여줍니다. 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin는 성공적인 PSD 격리를 보여주는 PSD 분수에서 제외 했다. 또한, 만성 ECS GluN2B 식 우리의 소규모 PSD 분류 방법, 약리, 유전 또는 기계적 치료 후 단일 쥐에서 hippocampal PSD 단백질에 변화를 감지에 적용할 수 있습니다 나타내는 PSD에 감소 .

상세한 절차를 사용 하 여 여기에 제시 된, 전기 충격 (55 mA, 0.5에 대 한 100 펄스/s s) 쥐 (그림 1A-B)에서 4-5 토 닉 clonic 발작 귀 클립 전극 유도 반복 되지 않는 단계를 통해 전달. 쥐의 총 8 급성 ECS 유도 받은 고 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 표시. 발작 지속 약 10 s, 그리고 모든 쥐 발작 정지의 1-2 분 이내 복구. 가짜 "아니 발작" 쥐 전기 충격을 받지 않았다 고 따라서 발작을 표시 하지 않았다. 4 가짜 쥐의 총 사용 되었다. 만성 ECS 유도, 쥐 7 일 연속 하루 전기 충격을 받은 고 각 전기 충격 (그림 1A-B)를 따라 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 표시. 쥐의 총 8 받은 만성 ECS 유도 그리고 4 가짜 쥐의 총 "발작" 쥐로 사용 되었다. 만성 ECS를 받은 대부분의 쥐는 행동 구별할 수 없었다에서 가짜 "발작" 쥐, 몇 가지 발전된 몸 떨림 및 7일 전기 충격에 의해 탐구 활동을 감소.
ECS 유도 글로벌 상승 활동 변경 단백질 표정에는 된 경우 검사, 쥐 했다 희생 3 h 24 h에서 급성 ECS 후와 24 h와 96 h에 만성 ECS 치료 (그림 1B)에서 최종 ECS 후. 각 쥐에서 두 된 해 부 급속 하 게 되었고 우리의 최적화 된 소규모 분별 프로토콜 (그림 2)에 복종. 두 된 불용 성 조직 및 핵 (S1 분수)의 초기 homogenate는 다시 10 분 조 막 펠 릿 포함에서 녹는 세포질 단백질 (S2 분수)를 포함 하는 상쾌한 분리 13,800 x g에서 centrifuged synaptosomes (P2 분수) (그림 2). 우리의 서쪽 오 점 세포질 단백질 α-tubulin 감지 된 쥐 (그림 3 및 그림 4), 급성 및 만성 ECS와 치료에서 S2 분수, 하지만 하지 P2 분수에서의 성공적인 분류를 보여주는 조 막 펠 릿에서 cytosolic 수용 성 단백질입니다.
PSD95 막 관련 guanylate 키 니 아 제 (MAGUK) 가족의 일원이 고 PSD12,,1825의 핵심 구성 요소입니다. PSD95와 NMDA 수용 체 소 단위 GluN2B P2 분수, 하지만 하지 S2 분수 (그림 3 및 그림 4)에 독점적으로 발견 했다. 다른 glutamatergic α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 산 (AMPA) 수용 체 소 단위 GluA2의 강한 표현 된 (그림 3 및 그림 4)에서 S2 분수에 비해 P2 분수에서 검색 되었습니다. postsynaptic 멤브레인 단백질 풍성 하 게 원유 막 P2 분수 펠 릿에 나타내는. 흥미롭게도, 시 냅 스 소포 단백질 synaptophysin 및 완전 한 막 단백질 Striatal 농축 티로신 인산 가수분해 효소 61 (단계61)26 S2 및 P2 분수 (그림 3 및 그림 4)에 동일 하 게 발견 했다. 시 냅 스 소포의 작은 크기를 고려-39 nm27 endosomes의 평균 직경, 원유 막 펠 릿 (P2 분수)를 분리 하는 원심 않았을 수도 모든 시 냅 스 소포 및 endosomes 작은 충분. 이러한 결과 함께 막-바인딩 단백질 및 막 횡단 단백질 시 냅 스 소포와 가능성이 endosomes 원유 막 P2 분수에 연결 되지 않은 우리의 원유 분별 프로토콜 풍요롭게 수 있습니다 나타냅니다.
검사 활동의 글로벌 상승 ECS 유도 된에 postsynaptic 단백질의 표현을 변경 하는 경우, 원유 막 P2 분수 얼음 처럼 차가운 물에 lysed, HEPES 버퍼에서 resuspended 이었고 25000 x g을 20 분 동안에 centrifuged는 lysed 펠 릿 (LP1) (그림 2). LP1 펠 릿 resuspended HEPES 버퍼 1% 트라이 톤 X-100 세제를 포함 하 고 25000 x g PSD 펠 릿 (그림 2)를 3 h 이상에서 centrifuged. PSD 분수의 후속 서쪽 오 점 발견 PSD95, GluN2B, 및 GluA2 (그림 3 및 그림 4), postsynaptic 단백질17,,2528알려져 있습니다. 그러나, PSD 분수 α-tubulin 부족 하 고, 중요 한 것은, 연 접 마커 synaptophysin (그림 3 및 그림 4). 단계61, GluN2B 및 GluA2 dephosphorylates는 그들의 부정적인 레 귤 레이 터29,,3031역할 PSD 분수 (그림 3 및 그림 4)에서 찾을 수 없습니다. 최근 보고서와 일치 PSD26에서 풍성 하 게 하는 PSD95에 의해 중재 시연 단계61의 시 냅 스 제외. 이러한 결과 우리의 소규모 분류 방법을 성공적으로 원유 막 P2 분수에서 PSD 단백질 분리를 나타냅니다.
서쪽에 게 더 럽 히기의 정량화는 밝혀 GluN2B 식 P2 분수에 변형 되었다 하지만 급성 ECS 후 3 h 24 h에서 PSD 분수에서 증가 추세를 표시 (n = 4) (그림 3B). GluA2 식 3 h와 급성 ECS (그림 3C) 다음 24 시간에서 P2 및 PSD 분수에서 변경 되지 않았습니다. 24 h와 만성 ECS 후 96 h, GluN2B 식 P2 분수에 감소 추세를 표시 하 고 PSD 분수에 크게 감소 했다 (24 h: p < 0.05, n = 4; 48 h: p < 0.01, n = 4) (그림 4B). 대조적으로, 만성 ECS GluA2 식 P2 및 PSD 분수에 미치지 않았다 (n = 4) (그림 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56016/56016fig1.jpg"> 그림 1 : ECS 급성 및 만성 ECS의 유도 대 한 스키마. (A) A 쥐 귀 클립 전극과 전기 충격을 통해 펄스 발생기에 연결 되었다 (55 mA, 0.5에 대 한 100 펄스/s s) 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 유도에 적용 했다. (B) 급성 ECS는 전기 충격에 의해 유도 했다. 만성 ECS는 7 일 연속 하루 전기 충격에 의해 elicited. 표시 시간 포인트 ECS 급성 또는 만성 ECS 유도 된의 해 부 전에 대 한 마지막 ECS의 유도 따라 기간을 나타냅니다. "발작" 가짜 (NS) 제어 쥐 동일 하 게 처리 했다 하지만 전기 충격을 받지 않았다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56016/56016fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56016/56016fig2.jpg"> 그림 2 : S2, P2, 및 단일 쥐의 된에서 PSD 분수 분리 Subcellular 분별의 워크플로. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56016/56016fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56016/56016fig3.jpg"> 그림 3: 시 냅 스 단백질 시험 Hippocampal S2, P2, 그리고 그 받은 NS 또는 급성 ECS 쥐에서 PSD 분수에. 가짜 "아니 발작" (NS) 쥐와 쥐의 된에서 PSD 분수 받은 급성 ECS와 (A) 대표적인 서양 오 점 S2, P2, NMDA 수용 체 소 단위 GluN2B, AMPA 수용 체 GluA2, 및 단계61 의 단백질 표정 표시. 세포질 수용 성 단백질의 α-tubulin S2 분수에 농축입니다. Synaptophysin 연 접 소포 단백질 이며 PSD 분수에 P2 분수, 조 막만을 농축입니다. PSD-95는 P2 및 PSD 분수에 농축입니다. (B-C) GluN2B의 정량화 (B) 및 GluA2 (C) 3와 24 후 급성 ECS h p 2와 PSD 분수에서 (n = 시간 포인트 당 4 쥐). P2 분수에서 GluN2B과 GluA2 식 S2 분수에서 α-Tubulin로 정규화 되었다. PSD 분수에서 GluN2B과 GluA2 식 PSD 분수에 PSD-95 정규화 되었다. 데이터는 % ± SEM.로 표시 됩니다 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56016/56016fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56016/56016fig4.jpg"> 그림 4: 시 냅 스 단백질 시험 Hippocampal S2, P2, 그리고 그 받은 NS 또는 만성 ECS 쥐에서 PSD 분수에. Α-tubulin;의 대표 서 지우고 synaptophysin; 단계61; 그리고 postsynaptic 단백질, PSD95, GluN2B, 및 GluA2를 포함 하 여 가짜 "아니 발작" (NS) 쥐와 쥐의 된에서 S2, P2, 그리고 PSD 분수에서 만성 ECS를 받았다. 세포질 수용 성 단백질의 α-tubulin S2 분수에 농축입니다. Synaptophysin 연 접 소포 단백질 이며 PSD 분수에 P2 분수, 조 막만을 농축입니다. PSD-95는 P2 및 PSD 분수에 농축입니다. (B-C) GluN2B의 정량화 (B) 및 GluA2 (C) 24 및 96 후 만성 ECS h p 2와 PSD 분수에서 (n = 시간 포인트 당 4 쥐). P2 분수에서 GluN2B과 GluA2 식 S2 분수에서 α-Tubulin에 정규화 되었습니다. PSD 분수에서 GluN2B과 GluA2 식 PSD 분수에 PSD-95 정규화 되었다. 데이터는 % ± SEM;로 표시 됩니다. * p < 0.05, * * p < 0.01 제어 (ANOVA와 Tukey의 게시물-특별 시험)와 비교. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56016/56016fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>분수</td>
			<td>단백질 분수</td>
			<td>단백질 마커</td>
		</tr>
<tr>
<td>P1</td>
			<td>핵</td>
			<td>Histon H1</td>
		</tr>
<tr>
<td>S1</td>
			<td>Cytosol/membrances</td>
			<td>tubulin (골격) 및 GAPDH (cytosol)</td>
		</tr>
<tr>
<td>P2</td>
			<td>조 synaptosomes</td>
			<td>AMPA와 NMDA 수용 체 소 단위</td>
		</tr>
<tr>
<td>S2</td>
			<td>Cytosol/라이트 membrances</td>
			<td>GAPDH (cytosol) 및 LAMP1 (리소좀)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Synaptosomal 막</td>
			<td>Synaptosome/미토 콘 드리 아</td>
			<td>AMPA와 NMDAR 수용 체 소 단위, Synaptophysin (연 접 마커)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PSD</td>
			<td>PSD</td>
			<td>AMPA와 NMDA 수용 체 소 단위, PSD95, PICK1, CaMKII</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 목록 단백질 마커 및 항 체 Subcellular 분수를 구별 하는 것입니다.

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Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Electroconvulsive 발작 (ECS)는 심한 우울증을 위한 electroconvulsive 치료의 실험 동물 모델. 세계적으로 ECS synaptogenesis 및 시 냅 스가 소성 하는 해 마에서 활동을 자극 한다. 여기, 우리가 쥐에 ECS 유도 및 시 냅 스 단백질에 변화 발작 유발 검사 된 그들의 subcellular 분류 방법을 설명 합니다.

쥐와 분류 된 그들의 Postsynaptic 밀도 단백질에 변화 발작 유발 검사 Electroconvulsive 발작

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

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Nanyang Technological University

Research

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Neuroscience

12.0K 조회수.  University of Illinois at Urbana-Champaign. Electroconvulsive 발작 (ECS)는 심한 우울증을 위한 electroconvulsive 치료의 실험 동물 모델. 세계적으로 ECS synaptogenesis 및 시 냅 스가 소성 하는 해 마에서 활동을 자극 한다. 여기, 우리가 쥐에 ECS 유도 및 시 냅 스 단백질에 변화 발작 유발 검사 된 그들의 subcellular 분류 방법을 설명 합니다.

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Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

연구

신경과학

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular mechanisms of synaptic plasticity. Long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) induced in acute hippocampal slices are widely accepted as cellular models of learning and memory. There are numerous studies that use live cell imaging or immunohistochemistry approaches to visualize activity dependent protein dynamics. However these methods rely on the suitability of antibodies for immunocytochemistry or overexpression of fluorescence-tagged proteins in single neurons. Immunoblotting of proteins is an alternative method providing independent confirmation of the findings.&#160;The first limiting factor in preparation of subcellular fractions from individual tetanized hippocampal slices is the low amount of material. Second, the handling procedure is crucial because even very short and minor manipulations of living slices might induce activation of certain signaling cascades. Here we describe an optimized workflow in order to obtain sufficient quantity of nuclear enriched fraction of sufficient purity from the CA1 region of acute hippocampal slices from rat brain. As a representative example we show that the ERK1/2 phosphorylated form of the synapto-nuclear protein messenger Jacob actively translocates to the nucleus upon induction of LTP and can be detected in a nuclear enriched fraction from CA1 neurons.

We provide a detailed protocol for induction of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampus and the subsequent isolation of nuclear enriched fractions from the tetanized area of the slice. This approach can be used to determine activity dependent nuclear protein import in cellular models of learning and memory.

해마 조각에서 CA1 핵 농축 분획의 분리는 Synapto 핵 메신저 단백질의 활동에 의존하는 핵 가져 오기를 공부합니다

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings

Electroencephalogram (EEG) has been traditionally used to determine which brain regions are the most likely candidates for resection in patients with focal epilepsy. This methodology relies on the assumption that seizures originate from the same regions of the brain from which interictal epileptiform discharges (IEDs) emerge. Preclinical models are very useful to find correlates between IED locations and the actual regions underlying seizure initiation in focal epilepsy. Rats have been commonly used in preclinical studies of epilepsy1; hence, there exist a large variety of models for focal epilepsy in this particular species. However, it is challenging to record multichannel EEG and to perform brain source imaging in such a small animal. To overcome this issue, we combine a patented-technology to obtain 32-channel EEG recordings from rodents2 and an MRI probabilistic atlas for brain anatomical structures in Wistar rats to perform brain source imaging. In this video, we introduce the procedures to acquire multichannel EEG from Wistar rats with focal cortical dysplasia, and describe the steps both to define the volume conductor model from the MRI atlas and to uniquely determine the IEDs. Finally, we validate the whole methodology by obtaining brain source images of IEDs and compare them with those obtained at different time frames during the seizure onset.

This video introduces the preparation, recording, and source analysis procedures of high-resolution EEG on sedated rats with a particular preclinical model of focal epilepsy under noninvasive conditions.

고해상도 뇌파 기록을 사용하여 초점 간질의 전임상 쥐 모델에서 뇌 원본 영상

Electroencephalogram (EEG) has been traditionally used to determine which brain regions are the most likely candidates for resection in patients with ...

의학

Non-restraining EEG Radiotelemetry: Epidural and Deep Intracerebral Stereotaxic EEG Electrode Placement

Implantable EEG radiotelemetry is of central relevance in the neurological characterization of transgenic mouse models of neuropsychiatric and neurodegenerative diseases as well as epilepsies. This powerful technique does not only provide valuable insights into the underlying pathophysiological mechanisms, i.e., the etiopathogenesis of CNS related diseases, it also facilitates the development of new translational, i.e., therapeutic approaches. Whereas competing techniques that make use of recorder systems used in jackets or tethered systems suffer from their unphysiological restraining to semi-restraining character, radiotelemetric EEG recordings overcome these disadvantages. Technically, implantable EEG radiotelemetry allows for precise and highly sensitive measurement of epidural and deep, intracerebral EEGs under various physiological and pathophysiological conditions. First, we present a detailed protocol of a straight forward, successful, quick and efficient technique for epidural (surface) EEG recordings resulting in high-quality electrocorticograms. Second, we demonstrate how to implant deep, intracerebral EEG electrodes, e.g., in the hippocampus (electrohippocampogram). For both approaches, a computerized 3D stereotaxic electrode implantation system is used. The radiofrequency transmitter itself is implanted into a subcutaneous pouch in both mice and rats. Special attention also has to be paid to pre-, peri- and postoperative treatment of the experimental animals. Preoperative preparation of mice and rats, suitable anesthesia as well as postoperative treatment and pain management are described in detail.

Non-restraining EEG radiotelemetry is a valuable methodological approach to record in vivo long-term electroencephalograms from freely moving rodents. This detailed protocol describes stereotaxic epidural and deep intracerebral electrode placement in different brain regions in order to obtain reliable recordings of CNS rhythmicity and CNS related behavioral stages.

비 금지 EEG Radiotelemetry : 경막 외 및 깊은 뇌내 정위 EEG 전극 위치

Implantable EEG radiotelemetry is of central relevance in the neurological characterization of transgenic mouse models of neuropsychiatric and ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

만성 Transcranial 전기 자극 및 쥐 Intracortical 녹음

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain interstitial space with the behavior and/or with the specific outcome of a pathology (e.g., seizures for epilepsy). When studying epilepsy, the microdialysis technique is often combined with short-term or even long-term video-electroencephalography (EEG) monitoring to assess spontaneous seizure frequency, severity, progression and clustering. The combined microdialysis-EEG is based on the use of several methods and instruments. Here, we performed in vivo microdialysis and continuous video-EEG recording to monitor glutamate and aspartate outflow over time, in different phases of the natural history of epilepsy in a rat model. This combined approach allows the pairing of changes in the neurotransmitter release with specific stages of the disease development and progression. The amino acid concentration in the dialysate was determined by liquid chromatography. Here, we describe the methods and outline the principal precautionary measures one should take during in vivo microdialysis-EEG, with particular attention to the stereotaxic surgery, basal and high potassium stimulation during microdialysis, depth electrode EEG recording and high-performance liquid chromatography analysis of aspartate and glutamate in the dialysate. This approach may be adapted to test a variety of drug or disease induced changes of the physiological concentrations of aspartate and glutamate in the brain. Depending on the availability of an appropriate analytical assay, it may be further used to test different soluble molecules when employing EEG recording at the same time.

Here, we describe a method for in vivo microdialysis to analyze aspartate and glutamate release in the ventral hippocampus of epileptic and non-epileptic rats, in combination with EEG recordings. Extracellular concentrations of aspartate and glutamate may be correlated with the different phases of the disease.

자유롭게 이동 하는 쥐에서 뇌 파 기록 하는 동안 흥분 성의 아미노산의 Microdialysis

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Assessment of Excitatory Neurotransmitter Levels in Chronic Epilepsy-Induced Rats

<a href='https://app.jove.com/v/58455/microdialysis-excitatory-amino-acids-during-eeg-recordings-freely'>Source: Soukupov&#225;, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (2018)</a>This video demonstrates the assessment of extracellular excitatory neurotransmitter levels in rats with chronic epilepsy induction. After implanting a microdialysis probe into the brain and confirming the absence of seizures using electroencephalography (EEG), extracellular fluid is collected to evaluate elevated neurotransmitter levels in epileptic rats. A high-potassium solution is then infused to sustain neuronal excitability and trigger an increased release of neurotransmitters, with samples collected to assess the potassium-induced peak in excitatory neurotransmitters.

Source: Soukupov&#225;, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (2018)This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Electroencephalographic Recording of Epileptic Seizures in Epilepsy-Induced Rats

Source: Soukupov&#225;, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58455">Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates electroencephalographic (EEG) recording of epileptic seizures in epilepsy-induced rats. A rat with electrodes implanted in the ventral hippocampus is connected to the EEG recording system and placed in a plexiglass chamber. The rat is allowed to move freely while the brain activity is recorded to monitor the occurrence of seizures.

간질에 의한 쥐의 간질 발작에 대한 뇌파 기록

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
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