우리는 그림 3의 사용 Yutian Gan 주셔서 감사합니다. 스미스 대학 Blakeslee, Wilens 및 홈즈 자금,,이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 0,420,971에 의해 지원되었으며 하워드 휴즈 의학 연구소.

1. 샘플 준비 <ol><li> 자료를 시작으로 생쥐에서 신선한, 플래시 냉동 또는 RNAlater - 처리 조직을 사용합니다. 계속하기 전에 Kimwipe있는 모든 여분의 방부제 멀리 얼룩. </li><li> 근육 주위 힘줄과 근막을 제거하고 조직이 잘 다진 혹은 가루 때까지 감기에 방 (4 ° C)에서 냉장 유리 접시에 2 분 하나의 에지 면도날로 조직을 말하다. 미리 무게 microfuge 튜브의 샘플을 수집하고 조직의 무게를 결정합니다. 를 시작 물질로 조직의 10 개 이상 MG를 사용합니다. </li><li> 상온에서 1 MG 다진 조직 당 45 μL 추출 버퍼를 (8 M 요소, 50 MM DTT, 4 % 챕스, 0.2 % 캐리어 ampholytes 8분의 5, 0.0002 % bromophenol 블루) 추가합니다. 볼륨이 350 μL보다 큰 경우, 처음에 350 μL를 추가하고 (단계 1.4) homogenize 다음 splashing을 최소화하기 위해 버퍼의 나머지 부분을 추가합니다. </li><li> 15초에 대한 조직에게 전동 유봉 (Kontes 사)로 일곱 번 Homogenize4 ° C, 2 분 각 균질 사이에 얼음 냉각과 함께. </li><li> 4 30 분 15,600 XG에서 샘플을 원심 ° C. 뜨는을 저장하고 해당 볼륨을 측정합니다. 세포 파편 펠렛은 삭제됩니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 시약 - 등급 아세톤 (V 비율 3 회 V)와 함께 뜨는의 단백질을 침전. 15 초간 소용돌이 튜브. 알약을 형성하고, Kontes 모터와 폴리 프로필렌 교반 막대 (BioSpec는 생산성)을 추출 버퍼에 resuspend 10 초 동안 15600 XG를위한 원심 분리기 </li><li> 단계 1.6 반복합니다. </li><li> 어느 시료의 단백질 농도 추정을 진행하거나 -20 ° C.에 그들을 저장 </li></ol> 2. 단백질 농도 추정 4.5 MG ML -1을 목표로, 로리 분석 7 BCA 분석 8 (피어스)를 사용합니다. 3. 초점 Isoelectric <ol><li> ReadyStrip IPG 스트립 (11cm, 산도 5-8, 바이오 RAD)를 제거-20 ° C에서하고 10-15 분 RT에서 평형 수 있습니다. </li><li> 소용돌이 샘플 rehydration 트레이에 채널의 뒤쪽 가장자리에서 직선으로 단백질 샘플의 샘플 및 피펫 600-800 μg (총 볼륨 200 μL), 각 끝 부분에 대한 1cm를 떠나. </li><li> 집게를 사용하여 IPG 스트립의 플라스틱 커버 벗기다 - 스트립만을 종료를 처리하고 젤과의 접촉을 피하기 위해 있는지 확인하십시오. 스트립의 기본 끝을 참고 트레이의 왼쪽에서 위치를. 아래 샘플 위에 IPG 스트립 젤 - 측면을 놓고 트래핑 거품을 아래 마십시오. 그 한 시간 rehydrate 수 있습니다. </li><li> 2.5 ML의 미네랄 오일 (BioRad)와 중첩. 뚜껑있는 트레이를 커버하고, 실온에서 하룻밤 rehydrate에 둡니다. </li><li> 초점 트레이 채널의 양쪽 끝에 종이 심지를 장소와 10 μL Millipore의 물을 각각 젖었어. </li><li> 스트립을 IPG 꺼내와 약 10 초 유출 기름 수직 만요. 플라스틱 B를 얼룩Kimwipe로 acking. </li><li> 초점 트레이에 아래와 왼쪽에있는 기본 엔드와 IPG 스트립 겔 쪽 놓습니다. 2.5 ML의 광유와 스트립을 커버. </li><li> 프로 테우스 IEF 셀 (바이오 - RAD) 및 프로그램 20 기본 셀 온도에서 3 단계 프로토콜 (표 1)에 트레이를 놓고 ° C, 50 μA / 스트립없이 rehydration 시간의 최대 전류. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 전압 </td><td> 시간 </td><td> 볼트 - 시간 </td><td> 램프 </td></tr><tr><td> 1 단계 </td><td> 250 </td><td> 20 분 </td><td></td><td> 선형 </td></tr><tr><td> 2 단계 </td><td> 8000 </td><td> 2.5 시간 </td><td></td><td> 선형 </td></tr><tr><td> 3 단계 </td><td> 8000 </td><td></td><td> 40,000 </td><td> 빠른 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td></td><td> 6.5 시간 </td><td> 40,000 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 스트립을 IPG 11cm를위한 프로 테우스 IEF 세포의 3 단계는 프로토콜입니다. </li><li> 집게를 사용하여 IEF 세포 밖으로 IPG 스트립을 가져가라. Kimwipe로 플라스틱 지원을 얼룩하고 깨끗한 rehydration 트레이에있는 IPG 스트립 겔 측면을 넣으십시오. 당신은 rehydration 트레이를 커버하고에서 플라스틱 포장 및 저장 그것을 포장을 할 수 - 80 ° C 또는 진행합니다. </li></ol> 4. SDS의 polyacrylamide 겔 전기 영동 <ol><li> 11cm의 평균 트레이에 스트립 (겔 사이드까지)를 전송합니다. </li><li> 채널 축소 버퍼 (6 M 요소, 2% SDS, 0.05 M 트리스 / HCL 산도 8.8, 20 % 글리세롤, 2퍼센트 DTT) 4 ML을 추가하고 가벼운 흔들림과 함께 10 분에 대한 스트립을 평형. </li><li> 감소 버퍼를 제거 알킬화 버퍼 (6 M 요소, 2% SDS, 0.05 M 트리스 / HCL 산도 8.8, 20 % 글리세롤, 2.5 % iodoacetamide) 4 ML을 추가하고 가벼운 흔들림과 함께 10 분 동안 스트립을 평형. </li><li> 취소선을 찍기하여 IPG 스트립을 씻어1 X SDS 실행 버퍼에 P를 잠시 (25 MM 트리스, 192 MM 글리신, 0.1 % SDS, pH를 8.2). </li><li> 11cm의 뒤에 접시에 스트립 겔 측면을 배치 기준을 사전에 캐스트 10.5 % -14 트리스 - HCL SDS의 polyacrylamide 젤 % (생물 RAD)와 그것이 SDS 겔과 완전한 접촉을 만드는 정도 부드럽게 밀어; 방울이 두 겔 표면 사이에서 고민하지 있는지 확인하십시오. </li><li> 용융 아가로 오스 솔루션 1 ML (0.5 % 아가로 오스, 25 MM 트리스, 192 MM 글리신, 0.1 % SDS, bromophenol 파란색)와 IPG 스트립을 중첩하고 아가로 오스 5 분 동안 응고하자. </li><li> 분자량 표준으로 하나의 우물에 : 단백질 마커의 5 μL 10-225 kDa를 (76,740 USB, P / N)로드합니다. </li><li> 상온에서 200 V 또는 전기를 모니터링하는 bromophenol 청색 색소 전면 마이 그 레이션을 사용하여 차가운 방 (4 ° C)에서 SDS 버퍼 (25 MM 트리스, 192 MM 글리신, 0.1 % SDS, pH를 8.2)에서 젤을 실행합니다. </li><li> 플라스틱 캐스트에서 젤을 제거하고 Coomassie 브릴리언트 블루에 부드럽게 흔들어에서 하룻밤 얼룩R - 250 (45.5 % 메탄올, 45.5 % dH2O, 9.0 % 초산, 0.25 % Coomassie 브릴리언트 블루 R - 250) 얼룩. </li><li> 삼시간 하룻밤 각각 Destain 2 (5 % 메탄올 90 % DH 2 O 5 % 초산)에 두 번 Destain 한 솔루션 (45.5 %의 메탄올, 45.5 % DH 2 O, 9.0 % 초산)에서 젤 흔들어. 분석을 위해 7% 초산에서 젤 저장합니다. </li></ol> 5. 젤 이미징 및 분석 <ol><li> VersaDoc 이미징 시스템 (BioRad)을 운영하고 수량 하나의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 젤의 이미지를 캡처합니다. 실험의 모든 젤에 대해 균일하게 이미지 영역을 자르기. </li><li> 실험 세트를 만들 수있는 PDQuest 8.0 소프트웨어 프로그램에 자른 이미지를로드합니다. 현장 감지 및 젤류 전체와 일치하는 지점에 대한 매개 변수를 정의하는 실험 설정 마법사를 따르십시오. 필요한 경우 수동으로 결과를 일치하는 지점을 검사하고 수정하십시오. </li><li> TW와 일치하는 단백질의 명소를 검색하는 데 젤류의​​ 양적 및 통계 분석을 수행두 겔 그룹 간의 표현 O 배 이상 통계적으로 의미있는 차이. 관심이 명소 설정된 분석을 만들고 트립신의 소화와 LC - MS - 기반 단백질 식별을위한 EXQuest 명소 커터 (BioRad)를 사용하여 잘라. </li></ol> 6. 인 겔 tryptic 소화 이 단계 수정된 피어스 인 겔 Tryptic 다이제스트 키트 (# 89871X, 피어스)에 대한 프로토콜이 사용됩니다. <ol><li> 겔 플러그에 destaining 용액 200 μL (25 MM의 탄산수 소 암모늄, 50 % acetonitrile)을 추가합니다. 와동 37에서 샘플을 품어 ° 잡고 30 분 C. 조심스럽게 솔루션을 제거하고 폐기. </li><li> 6.1 단계를 반복합니다. </li><li> 신선한 감소 버퍼 (50 MM 트리스 [2 - carboxyethyl] phosphine, 22.5 MM의 탄산수 소 암모늄) 10 분 60 ° C에서 겔 플러그와 부화를 포함하는 튜브합니다. 30 μL를 추가 </li><li> 샘플 냉각 허용, 다음 제거하고 줄이고 버퍼를 폐기하십시오.</li><li> 알킬화 버퍼 (호일 싼 튜브에 사용하기 전에 바로 준비 100 MM의 iodoacetamide, 20 MM의 탄산수 소 암모늄, 30 μL를 추가합니다. 1 시간 동안 실온에서 어둠의 샘플을 품어. </li><li> 제거하고 알킬화 버퍼를 폐기하십시오. 각 튜브 솔루션을 destaining 200 μL를 추가하여 겔 플러그를 씻으십시오. 37 샘플을 품어 ° C를 15 분 동안. </li><li> 제거하고 폐기 destaining 솔루션을하고 세차를 반복합니다. </li><li> 겔 플러그에 acetonitrile 50 μL을 추가하고 그들이 건조 수축 수 있도록 실온에서 10 분 동안 그들을 품어 후 신중하게 acetonitrile를 제거합니다. </li><li> 한번 더 단계 6.8를 반복합니다. 젤 조각은 흰색과 작은 보일 것입니다. </li><li> 겔 조각이 10 분 Centrivap ​​농축기 (Labconco, 모델 EX1245)에 건조하도록 허용합니다. </li><li> 활성화된 트립신 용액 (10 NG / μL 트립신, 25 MM의 탄산수 소 암모늄) 10 μL를 추가하여 겔 조각 그랬군요. 15m에 대한 상온에서 부화inutes. </li><li> 튜브 25 μL 소화 버퍼 (25 MM의 탄산수 소 암모늄)을 추가합니다. 잡고 하룻밤 실온에서 샘플을 품어. </li><li> 10 분 동안 샘플을 Sonicate (브랜슨, 목욕 sonicator 모델 2510)과 새로운 튜브에 뜨는를 제거하기 전에 그들을 아래로 스핀. 뜨는을 저장합니다. </li><li> 추가 펩티드를 추출하려면, 잡고 상온에서 5 분 0.1 % 개미의 산 및 부화 10 μL를 추가합니다. 10 분 동안 샘플을 Sonicate 뜨는를 수집 단계에서 저장한 6.13 뜨는와 결합. </li></ol> 7. 펩타이드 추출물 Microscale 탈염 <ol><li> 제조 업체 지침에 따라 PepClean C - 18 스핀 열 (ThermoFisher)의 도움으로 펩타이드 추출물에 탄산수 소 암모늄 및 기타 소금을 제거합니다. </li><li> Elute 펩티드 두 번 20 μL 70 % acetonitrile과 함께 1 시간 resuspend에 대한 Centrivap ​​농축기에서 원심 분리하여 건조 샘플을 증발MS 분석 10 μL 0.1 %의 개미 산에있는 펩티드. </li></ol> 8. HPLC - 결합 질량 분석법에 의한 단백질 식별 <ol><li> Pepswift 단일 PS - DVB 칼럼 (Dionex)에 0.2 % 개미의 산성과 함께 선형 20-50%의 acetonitrile 기울기를 사용하여 사십분 이상의 고성능 액체 크로마토 그래프 (HPLC)의 펩타이드 혼합물의 분리 5 μL는 Nanospray에 결합 I 끝에 400 NL / 분의 유량에서 이온 트랩 질량 분석기 (LCQ Deca XP 맥스, 써모 피셔 과학)에 소스. </li><li> 1천4백미터 / Z과 역동적인 배제와 CID에 의해 MS2 시퀀싱을 위해 격리하는 3 가장 강렬한 이온 봉우리에 대한 허용 - 400 사이의 펩티드 MS1 신호를 감지합니다. </li><li> 단백질 식별을 위해, 정적 alkylated 시스테인 변경 및 인산화에 대한 동적 수정 (세린, 트레오닌, 티로신), methyla와 Sequest 마우스 참조 데이터베이스 검색 (BioWorks 소프트웨어, 열 피셔 과학)를 통해 펩타이드 결과를 분석기 (히스티딘), 산화 (메티오닌), ADP - ribosylation (아르기닌) 및 N - 터미널 아세틸화. 보수와 일치하는 기준 (예 : 단백질이 Xcorr 대 충전 상태 필터를 통과 최소한 2 펩티드를 포함하는 2 AMU와 1.00 조각을 허용, 설정 펩타이드 공차를 적용합니다 [Z = 1 / X = 1.5, Z = 2 / X = 2.00, Z = 3 / X = 2.50, Z = 4 / X = 3.00]와 P의 확률 &lt;0.05) 5 수동으로 자신감이 단백질 식별을위한 MS 스펙트럼을 검사합니다. </li></ol> 9. 대표 결과 : 남성과 여성 unexercised, murine 골격근은 (팔뚝의 brachii) 추출 및 2 차원지도 5, 근육 비교 프로테옴 (그림 2)의 첫 번째 수준으로 분리되었다. 일단 고해상도 디지털 이미징을 사용하여 시각, 약 800 단백질의 명소가 각 감지되었습니다. 남성 프로테옴지도를 사용하면 기준으로, 그것은 여성의 프로테옴에 풍부하게 변경하는 것이 많은 장소가있다는 것을 분명하다. 현지 농도입니다<html> 단백질 금액의 변경 조치 (그림 3). 이상 (위 또는 아래) 두 배 이상의 변화와있는 단백질 명소의 신원은 통계적으로 의미 (P &lt;0.05) N = 5 마우스와 액체 크로마 토그래피 - 결합 질량 분광법을 사용하여 아미노산 서열 분석에 의해 결정됩니다. 이러한 결과는 여성이 설탕의 에너지 대사 효소와 크레아틴 키나제 효소 (CK) isoforms, 근육에서 다른 에너지 공급 시스템에 풍부한 감소를 보여주는 것을 보여줍니다. 인간과 동물 모두 휴식과 다음 운동 9,10 높은 남성 혈청 CK 수준을 표시하지만, 혈청 CK 수치는 반드시 myofibrillar 장애 11,12의 크기는 서로 관련이 없어요. murine 팔뚝의 brachii 근육에서 CK의 세포 풍부하게이 성별 동종 이형는 소설 finding5이며 생리학 다른 혈청 CK 수준을 응답 수 있습니다. 인물 : g1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. 비교 proteomics에 대한 프로토콜의 전체 개략도. , 샘플 분석 및, 단백질 식별 샘플 준비 : 프로토콜은 세 그룹으로 세분화됩니다. 전체 프로토콜 중단하지 않고 수행하는 경우 가장 좋은 결과를 얻고 있지만 프로토콜이 세 그룹의 각 엔드도 합리적인 정지 장소입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" /> 그림 2. 여성 murine 팔뚝의 brachii 단백질의 비교는 남성 팔뚝의 brachii에서 동일한 반점 (녹색 원 O)에 상대적인 명소. 보다 크거나 여성의 두 배 증가와 같은 명소은 빨간색 (O)를 돌고 있으며보다 두 배 같다 감소 이들은 파란색 (O)를 돌고있다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" /> 그림 3 젤 명소 강도 분석 :. X - 축, 암사전 운동 (제어, n은 = 5), Y 축, 0 인사 시점 그룹 한판 승부 여성 하나 (n은 = 5). 회귀 라인 : 상관 계수 = 0.919; 기울기 = 0.976; 가로채 = -0.0293. 두 배 - 붉은 선 위에있는 파란색 라인 아래의 명소는 + / 이상을 변경합니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 LC / MS proteomics 방법은 골격 근육 프로테옴의 첫 번째 수준의 빠른 분석을 위해 가장 신뢰할 수 있고 재현성 프로토콜입니다. 그것은 성별 특이성의 합리적인 편법 비교 있습니다. 낮은 풍부 단백질은 근육 샘플 분획화가이를 낮은 풍부한 단백질을 증가, 가능한 한 수축성 단백질의 많은를 제거해야합니다. 원하는 경우 프로테옴 프로파일을 조정하는 것은 다양한 산도 범위 IPG의 스트립 및 대체 비율 기울기 젤과 함께 수행할 수 있습니다. 더 민감한 형광 얼룩이 존재하지만, 우리는 각 연구소가 시스템에서 이러한 얼룩의 선형을 결정하는 것이 좋습니다. 단백질 표현의보다 엄격한 분석을위한 DIGE 시스템 (2 차원 전기 시스템 - 젤에서 GE 헬스케어 생명 과학)를 사용할 수 있습니다 그러나 이것은 방법론에 복잡한 수준을 추가 않는다. 또한, 여기에서 설명하는 프로토콜은 대부분의 애니와 함께 사용할 수 있습니다중복 효소 조각이 이외에 고순도 효소를 사용하여 생성할 수 있습니다 년부터 게놈이뿐만 아니라 어떤 소스에서 단백질의 드 노보 시퀀싱으로 합성되어있는 말 조직은만큼 그것은 2 차원 겔에 해결할 수 있습니다 트립신 수 있습니다. 막과 소수성 단백질을 찾고, 그러나, 우리는 심장, 간, 신장 및 뇌 조직이 프로토콜을 사용하여 좋은 결과가 있었 특히 다른 조직 소스에서 샘플은 추출 방법의 일부 변경을 요구할 수 있습니다. 다른 포스트 translational 수정은 질량 스펙트럼 데이터베이스 검색 기준을 수정하여 감지 수 있습니다. 요컨대, 우리는 프로테옴 프로 파일링 분석을위한 합리적인 세부 초기 프로토콜을 제시했습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 유형 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> PepClean C - 18 스핀 열 </td><td> 소모품 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td> PI - 89870 </td><td></td></tr><tr><td> 모놀리식 Pepswift 열 (100um X 5cm) </td><td> 소모품 </td><td> Dionex </td><td> 162,348 </td><td></td></tr><tr><td> 기준 사전 캐스팅 10.5 % -14 % 트리스 - HCL SDS polyacrylamide의 젤 </td><td> 소모품 </td><td> BioRad </td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> IPG 스트립을 Readystrip </td><td> 소모품 </td><td> BioRad </td><td> 산도 변화 범위 </td><td></td></tr><tr><td> 초산 </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A465 - 1 </td><td></td></tr><tr><td> 아세톤 </td><td> 시약 </td><td> Pharmco </td><td> 329,000 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td>garose </td><td> 시약 </td><td> BioRad </td><td> 163-2111 </td><td> 오버레이 용액 </td></tr><tr><td> 탄산수 소 암모늄 </td><td> 시약 </td><td> Fluka </td><td> 40,867 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol 블루 </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td> 바이오 Lyte의 Ampholytes </td><td> 시약 </td><td> BioRad </td><td></td><td> 산도 변화 범위 </td></tr><tr><td> 챕스 </td><td> 시약 </td><td> USB </td><td> 13,361 </td><td></td></tr><tr><td> Commassie 블루 R - 250 </td><td> 시약 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td> 20,278 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> 시약 </td><td> USB </td><td> 15,395 </td><td></td></tr><tr><td> 개미의 산 </td><td> 시약 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td> 28,905 </td><td></td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> 시약 </td><td> USB </td><td> 16,407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Iodoacetamide </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> 시약 </td><td> BioRad </td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 dodecyl 황산 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 93,349 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스 [2 - carboexyethyl] phosphine </td><td> 시약 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td> 77,720 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 Endoproteinase, TPCK이 대접, MS 등급 </td><td> 시약 </td><td> 찌르다 </td><td> 90,055 </td><td> 수정 </td></tr><tr><td> 요소 </td><td> 시약 </td><td> USB </td><td> 75,826 </td><td></td></tr><tr><td> 물 </td><td> 시약 </td><td> 장님 &amp; 잭슨 </td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> Centrivap ​​농축기 </td><td> 티ool </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquest 장소 커터 </td><td> 도구 </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LCQ Deca XP 최대 이온 트랩 질량 분석기 </td><td> 도구 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 전동 유봉 </td><td> 도구 </td><td> Kontes 법인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 감동 폴리 프로필렌 </td><td> 도구 </td><td> BioSpec은 생산성 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 막대 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 프로 테우스 IEF 셀 </td><td> 도구 </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> 도구 </td><td> 브랜 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 서베이 플러스 HPLC 체계 </td><td> 도구 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDoc 이미징 체계 </td><td> 도구 </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skeletal muscle gender dimorphism from proteomics

골격 근육의 수축은 주로 총 수축성 단백질의 상대적으로 적은 수의에 의해 결정됩니다, 그러나이 조직은 또한 쓰지 않음으로 저항 운동과 위축에 의한 비대와 같은 환경 요인 1 현저하게 적응이다. 그것은 따라서 스트레스 (열, 국소 빈혈, 중금속 등.) 2,3로 리모델링하고 adaptations을 전시하고있다. , 소위 편심 수축 4 길어 동안 손상이 근육 exerting 강제로 근육에 발생할 수 있습니다. 수축성 단백질은 같은 exertions에 손상 타락한 및 / 또는 resynthesized, 수리해야 할 수 있으며 이러한 기능은 수축성 단백질의 일부​​가 아니지만, 세포의 다른 훨씬 더 풍부한 단백질. 차등을 결정하는 단백질의 하위 집합이 손상이 유형의 개량에 관련된 어떤 확인하려면, 글로벌 프로테옴은 5 운동하기 전에 설정해야 다음 운동 이후 다음단백질 표현함으로써 피해 및 복구 adaptations에 후보 단백질을 선택합니다. 또한, 골격근 대부분의 연구는 종족의 남성에서 실시되고 있으며 따라서 여성 근육의 대표되지 않을 수 있습니다. 이 문서에서 우리는 남성과 여성의 근육에서 단백질을 추출 reproducibly하고, 고해상도 디지털 이미징 6 다음 2 차원 겔 전기 영동하여 분리하는 방법을 제시. 이것은 표시 명소 (그리고 이후에 확인된 단백질)에 대한 프로토콜을 통계적으로 의미 (P &lt;0.05) 두 배 증가 또는 감소가 나타나거나 제어 상태에서 사라집니다.을 제공합니다 이들은 다음 excised 트립신과 함께 소화와 단백질 식별 (LC / MS / MS) 5 질량 분석기 (LC / MS)로 결합 고압 액체 크로마 토그래피로 구분됩니다. 이 방법론 (그림 1) (간, 뇌, 소리없이 변경 거의 많은 조직에서 사용할 수 있습니다t 등.).

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Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

분리 및 골격 근육 표현이 가장 풍부한 단백질의 신원을 확인하는 방법을 똑바로 앞으로 설정할 수 있습니다. 약 800 곳 10 MG 근육에서 2 차원 겔에 분별되며 이것은 성별 특정 단백질 표현의 결정을 허용합니다. 이러한 방법은 대부분의 조직에 상응하는 결과를 제공합니다.

Proteomics에서 골격근 성별 동종 이형

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K 조회수.  Smith College. 분리 및 골격 근육 표현이 가장 풍부한 단백질의 신원을 확인하는 방법을 똑바로 앞으로 설정할 수 있습니다. 약 800 곳 10 MG 근육에서 2 차원 겔에 분별되며 이것은 성별 특정 단백질 표현의 결정을 허용합니다. 이러한 방법은 대부분의 조직에 상응하는 결과를 제공합니다.

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

절연 골격근의 묘 - 기계 분석

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

연구

의학

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. Although originally developed and used extensively in the rat due to its larger size, the tibial nerve in mice is big enough that it can be easily manipulated with either crush or transection, leaving the peroneal and sural nerve branches of the sciatic nerve intact and thereby preserving their target muscles. Thus, this model offers the advantages of inducing less morbidity and impediment of ambulation than the sciatic nerve transection model and also allows investigators to study the physiologic, cellular and molecular biologic mechanisms regulating the process of muscle atrophy in genetically engineered mice. The tibial nerve supplies the gastrocnemius, soleus and plantaris muscles, so its transection permits the study of denervated skeletal muscle composed of fast twitch type II fibers and/or slow twitch type I fibers. Here we demonstrate the tibial nerve transection model in the C57Black6 mouse. We assess the atrophy of the gastrocnemius muscle, as a representative muscle, at 1, 2, and 4 weeks post-denervation by measuring muscle weights and fiber type specific cross-sectional area on paraffin-embedded histologic sections immunostained for fast twitch myosin.

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of skeletal muscle atrophy. The model surgical protocol is described and demonstrated in C57Black6 mice. &#160;

경골 신경 절개 - 마우스의 탈 신경에 의한 골격근의 위축에 대한 표준 모델

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

수정 된 버그 스트롬 기술을 이용하여 인간의 골격 근육 생검 절차

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

경피적 바늘 생검에 의해 획득 골격근 조직에서 고립 된 미토콘드리아의 준비 및 호흡계 평가

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

골격근 질환의 정량적 자기 공명 영상

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is estimated to contribute to 19- 25% of all clinical cases of acute kidney injury (AKI) in critically ill patients. AKI detection has historically relied on metrics such as serum creatinine (sCr) or blood urea nitrogen (BUN) which are demonstrably inadequate in full assessment of nephrotoxicity in the early phase of renal dysfunction. Currently, there is no robust diagnostic method to accurately detect hemodynamic alteration in the early phase of AKI while such alterations might actually precede the rise in serum biomarker levels. Such early detection can help clinicians make an accurate diagnosis and help in in decision making for therapeutic strategy. Rats were treated with Cisplatin to induce AKI. Nephrotoxicity was assessed for six days using high-frequency sonography, sCr measurement and upon histopathology of kidney. Hemodynamic evaluation using 2D and Color-Doppler images were used to serially study nephrotoxicity in rats, using the sonography. Our data showed successful drug-induced kidney injury in adult rats by histological examination. Color-Doppler based sonographic assessment of AKI indicated that resistive-index (RI) and pulsatile-index (PI) were increased in the treatment group; and peak-systolic velocity (mm/s), end-diastolic velocity (mm/s) and velocity-time integral (VTI, mm) were decreased in renal arteries in the same group. Importantly, these hemodynamic changes evaluated by sonography preceded the rise of sCr levels. Sonography-based indices such as RI or PI can thus be useful predictive markers of declining renal function in rodents. From our sonography-based observations in the kidneys of rats that underwent AKI, we showed that these noninvasive hemodynamic measurements may consider as an accurate, sensitive and robust method in detecting early stage kidney dysfunction. This study also underscores the importance of ethical issues associated with animal use in research.

Early stage hemodynamic dysfunction is critical to the development of kidney disease. Yet, detection methodologies are limited. Recent advances in sonography provide a noninvasive, accurate option for early detection of kidney injury. This study outlines a step-by-step, sonographic methodology for detecting kidney dysfunction using a drug-induced nephrotoxicity rat model.

쥐에서 초음파 기술을 사용하여 약물 유발 신장 혈역학 적 부전의 조기 발견

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

마우스의 압력 과부하 모델을 사용하여 관상 동맥 흐름 및 관상 동맥 흐름 준비 제도 이사회의 초음파를 바탕으로 평가

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

사람의<em&gt; 광근의 Lateralis</em&gt; 웨일 - Blakesley Conchotome를 사용하여 골격 근육 생검

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

유도와 인간의 운동시 골격근 손상의 평가

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...