면역 형광및 전체 마운트 신경 근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부. 이 비디오는 반복 가능한 접근 방식으로 EDL 및 솔레우스 근육을 효과적이고 안전하게 해부하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 비디오는 또한 정확한 형태 측정 분석을 허용하기 위해 3D 무결성시 냅 스 구성 요소를 인식하는 것을 목표로 전체 마운트 신경 근육 접합을 얻는 방법을 가르칩니다.
근육을 해부하려면 이러한 수술 기구가 필요합니다. 절차를 시작하려면 복부가 위쪽으로 향하는 동물을 배치합니다. 발가락 사이의 수술 용 칼날을 사용하여 뒷다리쪽으로 초기 절개를합니다.
오른쪽 무릎이 노출될 때까지 위로 당겨 피부를 벗겨냅니다. EDL을 찾으려면 발 힘줄을 따라 발 성 인대에 가십시오. 이 인대는 두 개의 힘줄을 동그라미.
두 힘줄 사이에 유니밴드 가위로 인대를 잘라냅니다. 두 가지 를 모두 들어 올리고 발가락이 위쪽으로 이동하게 하는 것을 확인하여 EDL 힘줄을 식별합니다. 가위로 힘줄을 자른다.
생물학적 핀셋으로 힘줄을 들고있는 동안, 천천히 다른 뒷다리 근육에서 EDL 근육을 분리하기 시작합니다. 손상을 일으키지 않고 근육의 분리는 EDL 힘줄의 분할 섹션에서 근육을 잡고 들어 올리는 동안 측면 근육의 나머지 부분에 다양한 상처를 만들어 그들 사이의 경로를 열어 서 수행 할 수 있습니다. 근육을 완전히 분리하려면 유니밴드 가위를 사용하여 쥐 무릎에 부착된 힘줄을 잘라냅니다.
해부된 근육을 고정 용액에 담그고 섭씨 4도에서 24시간 동안 둡니다. 일반적으로, 길쭉한 근육을 가지고 하는 것이 유용하다. 이렇게하려면 골판지와 스테이플을 사용하여 고정을 위해 근육을 부착하십시오.
솔레루스 근육을 분리하려면 동물을 뒤집습니다. 피부를 통해 수술용 블레이드를 사용하여 칼수선 힘줄을 자른다. 생물학적 핀셋과 유니밴드 가위의 도움으로 위트네미근 근육을 뼈와 분리하여 근육 뚜껑을 만듭니다.
솔레루스는 근육 뚜껑의 내부 측면에있을 것입니다. 빨간색과 평면이기 때문에 식별할 수 있습니다. 한 쌍의 생물학적 핀셋으로 위편상에 있는 솔레우스 힘줄을 도달하고 들어 올립니다.
유니밴드 가위로 힘줄을 잘라냅니다. 약한 부착 점 중 일부를 자르면서 전체 근육을 들어 올립니다. 마지막으로, 완전히 솔레루스 근육을 해제하려면, 칼수개 힘줄을 형성하는 솔레소포를 잘라.
EDL 근육과 마찬가지로 고정 단계를 반복합니다. 이 방법을 사용 하려면, 힘줄에 스테이플을 고정 하 고 근육에 게 하는 것이 중요 하다. 고정의 24 시간 기간이 지나면, 근육 섬유를 분리하기 전에 DPBS 용액의 근육을 헹구는 다.
섬유를 분리하기 위해 힘줄 중 하나를 생물학적 핀셋 한 켤레로 부드럽게 잡습니다. 그런 다음 다른 쌍의 생물학적 핀셋과 함께 힘줄을 천천히 꼬집어 근육 섬유를 분리하기 시작합니다. 섬유를 분리하려면 반대 근육 힘줄쪽으로 천천히 위쪽으로 당깁니다.
여러 개의 작고 격리된 번들을 얻을 때까지 이 작업을 여러 번 반복해야 합니다. 작은 격리 된 번들로 분리되면 미리 처리 된 격리 된 슬라이드에 조심스럽게 배치하십시오. 모든 섬유가 겹치지 않도록 질서 정연하게 유지해야 합니다.
이 시점에서 섬유는 24 시간 동안 공기 건조상태로 남을 수 있습니다. 24 시간 후에 면역 염색을 시작합니다. 방수 장벽을 만들려면 PAP 펜을 사용하여 전처리된 슬라이드에서 격리된 근육 섬유를 둘러싸십시오.
여기에 설명된 프로토콜에 따라 얻을 수 있는 고해상도 공초점 이미지의 예입니다. 왼쪽 상단에 시냅스 후 요소가 표시되고, 오른쪽 위, 사전 시냅스 요소, 하단 이미지는 형태 분석에 사용될 매개변수를 설명하기 위해 시냅스 성분을 표시한다. 두 번째 슬라이드는 API의 핵 얼룩과 사전 및 시냅스 후 신호의 병합을 나타낸다.
형질 전환 동물과 비 형질전환 동물의 신경 근육 접합 사이의 차이는 명확하게 볼 수 있습니다. 신경 근육 접합의 형태 분석은 형질 전환 동물에서 시냅스 후 신호의 증거를 보여주고 주로 감소 된 신경 근육 접합 총 영역으로 인해 더 컴팩트한 것으로 보입니다. 여기에 나타난 바와 같이, 형질전환 동물의 신경근육 접합 전 시냅스 영역이 감소된다.
검출된 가장 작은 것은 이미지 B와 같이 항인포성 신경필라멘트 신호로 발견된 신호입니다, 예를 들면. 마지막 이미지는 전체 마운트 신경 근육 접합의 상태에 관련된 결과를 보여줍니다. 커버리지 인덱스를 사용하여, 형질전환 신경 근육 접합이 부분적으로 변형된 것으로 밝혀졌다.
또한, 인포화된 신경필라멘트의 커버리지와 넥서스가 비인성 신경필라멘트가 검출될 때 얻은 것보다 낮다는 것을 확인할 수 있었다. 제안 된 프로토콜은 느리고 빠른 근육 섬유에서 고품질의 신경 근육 접합 준비를 얻을 수 있습니다. 시냅스 전후 신경근육 접합 성분은 특정 프로브 또는 항체에 의해 확인된 다음 공초점 또는 초해상도 공초점 현미경으로 이미지화되어 미세 측정 척도에서 형태 측정 분석을 가능하게 했습니다.
