이 작업은 GM055279, CA116034 및 CA163489에 의해 투자 되었다.

1. 버퍼 및 장비 준비 <ol><li>4 45 셀 중단 폭탄, 15 mL 튜브, 및 ultracentrifugation 튜브를 진정 ° c.</li>
	<li>준비 25 mL 당 4 ° C. 추가 한 protease 억제제 태블릿 사용 직전에 2 x 10 7 셀 균질 버퍼의 진정 하 고. 
	참고: 더 나은 NaCl 반영 세포내 소금 성분 보다는 오히려 균질 버퍼는 일반적으로 KCl를 포함. PH 7.4, 10mm KCl와 1.5 m m MgCl 2 (이 하 소형 균질 버퍼 라고도 함)에서 10 mM HEPES이이 프로토콜에 사용 되는 균질 버퍼에 의하여 이루어져 있다. 대부분 버퍼 질소 현상에 대 한 적용할 수 있습니다 (내용 참조).</li>
	<li>준비 6 mL 당 4 ° C. 추가 protease 억제제 정제 사용 하기 전에 신선한에 샘플 Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 버퍼 x 1의 진정 하 고. 
	참고:이 프로토콜에 사용 되는 PBS 버퍼 pH 7.4, 1.8 m m KH 2 포 4, 137 mM NaCl, KCl 2.7 mM에서 10 mM 나 2 HPO 4 이루어져 있다.</li>
	<li>준비 4 ° C. 추가 한 protease 억제제 태블릿 사용 직전에 샘플 당 가용 화 버퍼의 4 mL를 진정 하 고. 
	참고:이 프로토콜에 사용 되는 가용 화 버퍼는 1 x Radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1 %SDS, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 및 1%에서 25 mM Tris 이루어져 있는 NP-40. 4.6를 참조 하십시오.</li>
</ol> 2. 수확을 셀 셀 형식에 대 한 <ol>10 9 조직 문화 셀 권장된 x <li>성장 2 x 10 7-10 문화 미디어. 일반적으로, 한 15 cm 접시 수익률 2 x 10 7 HEK 293 세포 90 %confluency ( 그림 1)에서 DMEM에 교양.</li>
	<li>진공에 의해 성장 매체를 제거.</li>
	<li>부착 셀 문화 요리에 얼음, 냉장된 균질 버퍼 두 번 (15 cm 접시 세척 당 당 10 mL 버퍼)으로 부드럽게 문화 요리에 직접 세포를 씻어 놓고 셀의 적절 한 볼륨에 큰 셀 스 크레이 퍼와 수확 균질 버퍼; 현 탁 액 셀에 대 한 수집 및 냉장된 균질 버퍼에 두 번 (10 mL 버퍼 세척 당 50 mL 문화 당) 5 분, 4 ° C에서 500 x g 스핀과 셀 펠 릿을 세척 하 고 얼음에 균질 버퍼의 적절 한 볼륨에 씻어 셀 펠 릿 resuspend. 참고: 볼륨 셀 중단 폭탄에 허용 최소/최대 볼륨으로 의도 된 실험에서 단백질 농도 대 한 요구 사항에 기반 해야 합니다. 일반적인 지침 2-10 배 10 7 셀/mL, 또는 세포의 약 10 볼륨 작은. 이 프로토콜은 균질 버퍼의 2 ml에서 HEK 293 세포의 3-15cm 요리에 대 한 최적화.</li>
</ol> 3. 질소 공동 현상은 <ol><li>전송 셀 서 스 펜 션 파문에 얼음 목욕에서 깨끗 하 고 냉장 폭탄 접시. 
	주의: 폭탄은 높은 압력, 낮은 온도, 질소 가스 &#8211; 착용 적절 한 개인 보호 .</li>
	<li>마이크로 자기 볶음 바 폭탄 안에 놓고 정지 동질성을 유지 하기 위해 저 어 접시에 설정.</li>
	<li>하나 protease 억제제 태블릿 정지를 추가 하 고 제조 업체 당 폭탄을 닫습니다 &#39; s 지시.</li>
	<li>점차 압력 제조 업체 당 질소 가스 탱크와 폭탄 &#39; 폭탄 압력 게이지까지 s 명령 300 ~ 600 psi를 읽습니다. 모든 밸브를 닫고 질소 탱크 분리. 
	참고: 필요한 압력 셀 유형으로 달라질 수 있습니다. 여기 우리는 HEK 293, NIH-3T3과 Jurkat 세포에 대 한 350 ~ 400 psi에서 현상 수행.</li>
	<li>질소 분해 하 여 셀 내에서 평형에 도달 수 있도록 20 분 기다립니다.</li>
	<li>피복 수건을 사용 하 여 배출 밸브 주위 초과 물을 제거 합니다. Homogenate의 dropwise 릴리스를 달성 하 고 미리 냉장된 15 mL 튜브에 수집을 부드럽게 배출 밸브를 엽니다. 
	참고: 컬렉션의 끝에 근처 거기 homogenate의 분출 되며 가스 쉿 소리와 함께 나타날 것입니다. 가스 하지 않습니다 있는지 확인 이전 수집 원인은 튜브 촬영 cavitate (따라서 15 mL를 사용 하 여 튜브 1.5 mL 튜브 대신). 일단은 기 시작, 배출 밸브 닫고 갑자기 하 폭탄 depressurize 폭탄에 나머지 셀의 현상 질소 유입 밸브를 엽니다. 오픈에 대 한 폭탄 cavitate 복구 및 철저 한 청소. 
	참고: 마지막 cavitate 거품과 밀키 모양 위에 있어야 한다. 원심 분리 전에 가시고 거품 수 있도록 피 펫 팁으로 부드럽게 저 어. 
	참고: 단계 대조 현미경 검사 법 균질 효율을 결정 하 여는 cavitate를 검사 합니다. 15 µ L 드롭 추가 cavitate 현미경 슬라이드와 커버는 coverslip의 표면에. 반복 단계 3.4-3.6 너무 많은 경우에 손상 되지 않은 세포는 20 X 목표 발견. 
	참고: 균질 버퍼는 EDTA 또는 EGTA를 포함 하지 않으면, 그것에 추가 수집 된 후 5 분 이내 1 m m의 최종 농도에 cavitate.</li>
</ol> 4. Cytosolic와 막 분수 분리 손상 되지 않은 세포와 핵 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 <ol><li>분리기 500 x cavitate g. 
	참고: 없음 보이는 펠 릿 생산 원심 분리 단계를 반복 하 고 위에 떠 있는 거품을 피하 면 서 포스트 핵 표면에 뜨는 (PNS)를 수집 합니다. 필요한 경우 추가 수집 PNS, 결합 하는 거품을 다시 원심 ( 그림 1).</li>
	<li>관심의 분수를 원하는 대로 PNS를 처리 합니다. Cytosolic 분리 하 고 막 분수, 목적 ultracentrifuge 튜브에 PNS를 전송 하 고 원하는 대로 ultracentrifugation를 수행 합니다. 이 프로토콜에 대 한 최적화는 &#60; 3.5 mL 샘플 폴 리카 보 네이트 ultracentrifuge 튜브에서 및 ultracentrifugation 350000 x g 1 h 4에 대 한에 대 한 ° C.</li>
	<li>상쾌한 (S 분수) 1 mL 피 펫을 사용 하 여 수집.</li>
	<li>신중 하 게 그것을 방해 하지 않고 차가운 PBS의 3 mL와 펠 릿을 씻어. 진공으로 PBS를 제거. 
	참고: cytosolic 단백질에 의해 막 분수의 오염 샘플의 손실 보다 더 큰 관심사 인 경우에, 3 ml PBS 춥고 단계 4.2에서 다시 ultracentrifuge의 펠 릿을 resuspend. 진공으로 PBS를 제거.</li>
	<li>선택의 가용 화 버퍼 세제를 포함 하는 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 완벽 하 게 resuspend. 셀 등가 달성 하기 위해 사용 하 여 가용 화 버퍼의 동일한 볼륨 cytosolic 분수. 
	참고: 효율적인 막 단백질 추출에 대 한 가용 화 버퍼 1 x RIPA 버퍼를 사용 하 여 것이 좋습니다. 없음 다운스트림 분석 결과 막 일부분에 대 한 필요한 경우, 1 x laemmli 샘플 버퍼를 사용 하 여 최대한 막 단백질 추출에 대 한. 
	참고: 좋습니다 dislodging 하 고 최대한 막 단백질 추출에 대 한 4 ° C에서 튜브 회전자에 깨끗 한 튜브를 가용 화 버퍼에 펠 릿을 전송. 
	참고: 펠 릿은 너무 끈 적 (너무 많은 지질) 일에서 효율적으로 제거 하는 경우가용 화 버퍼에서 e ultracentrifuge 튜브, 좋습니다 스냅 액체 질소에는 펠 릿을 동결 하 고 펠 릿 녹아서 전에 미니 금속 주걱으로 신속 하 게 ultracentrifuge 튜브에서 펠 릿을 dislodging. 
	참고: 또는, 막 펠 릿 그냥 resuspended 고 막 소포 서 스 펜 션, 어떤 경우는 원심 4.6 단계 필요 하지 않습니다 P 일부 생산 세제 포함 된 버퍼에 solubilized 하지. 이러한 P 분수는 막 협회에 의존 하는 효소 활동 등의 기능을 조사 하는 경우에 유용.</li>
	<li>4 시 10 분에 대 한 탁상 원심 분리기에 20000 x g에서 4.5 단계에서 완전히 solubilized 펠 릿 정지 원심 ° C. 상쾌한 1 mL 피 펫 (P 분수)를 사용 하 여 수집 하 고 펠 릿 (불용 성 지질) 삭제.</li>
	<li>Cytosolic 또는 막 분수와 서 부 럽 등 원하는 분석을 수행 하거나 나중에 사용-80 ° C에 저장.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+on+the+move:+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies.">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li><li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling.">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li><li>Simpson, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+liver+and+muscle+polyribosomes+in+high+yield+after+cell+disruption+by+nitrogen+cavitation.">Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation.</a> FEBS Letters. 2 (1), (1968).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+prenylcysteine+carboxyl+methyltransferase+is+in+the+endoplasmic+reticulum.">Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).</li><li>Wynne, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1-interacting+adapter+molecule+(RIAM)+associates+with+the+plasma+membrane+via+a+proximity+detector.">Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector.</a> J Cell Biol. , (2012).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS35+binds+farnesylated+N-Ras+in+the+cytosol+to+regulate+N-Ras+trafficking.">VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking.</a> J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).</li><li>Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+possess+and+require+an+active+protein+palmitoylation+pathway+for+agonist-mediated+activation+and+in+vivo+thrombus+formation.">Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).</li><li>Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxidized+peroxiredoxin+2+interacts+with+the+protein+disulfide-+isomerase+ERp46.">Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46.</a> Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).</li><li>Annis, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+localized+Bcl-2+prevents+apoptosis+when+redistribution+of+cytochrome+c+is+a+late+event.">Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event.</a> Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).</li><li>Berkowitz, S. A., Wolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+calcium+sensitivity+of+tubulin+polymerization.+The+contributions+of+temperature,+tubulin+concentration,+and+associated+proteins.">Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins.</a> J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

기계 장애의 다른 방법을 통해 질소 현상의 장점은 매니폴드입니다. 아마도 가장 중요 한 장점은 부드럽게 아직 효율적으로 균질 표본 하는 기능입니다. 생성 지역 난방 손상 대신 압축 냉각 샘플의 원리는 초음파 좋아하고 기술을 기반으로 마찰/전단. 공동 현상 또한 원형질 막 방해에 매우 효과적입니다. 질소 거품 감압, 현상 프로세스에 따라 각 개별 셀 내에서 생성 되는 제한 때문에 셀 크기에...

세포질 단백질 2 개의 종류로 분할 될 수 있다: 막과 하지 않은 그와 관련 된 그. 비 막 관련된 단백질 cytosol, nucleoplasm 및 바인딩과 그물 (ER) 같은 세포의 루미나에서 발견 된다. 두 가지 수준의 막 관련 단백질, 정수 및 주변을 확인 하 고 있습니다. Polypeptide 체인의 하나 이상의 세그먼트 걸쳐 멤브레인, 소수 성 아미노산의 구성 하는 α-나선으로 일반적으로 있기 때문에 완전 한 막 단백질은 막 횡단 단백질 라고도. 막 횡단 단백질 co-translationally 그들의 생 합성 과정에서 세포 막에 삽입 되 고 그래서 구성 된 catabolized는 그들이 때까지 남아. 주변 막 단백질 이차 세포 막 지질 같은 소수 성 분자와 포스트 번역 상 수정 때문에 일반적으로 구동 됩니다. 달리 완전 한 막 단백질, 세포 막의 주변 막 단백질 연관 가역 이며 통제 될 수 있다. 신호 경로, 그리고 멤브레인과 규제 협회에 많은 주변 막 단백질 기능 활성화 하거나 억제 하는 통로 대 한 메커니즘 중 하나입니다. 주변 막 단백질은 신호 분자의 한 예로 작은 GTPase RAS입니다. 포스트 번역 상 수정 수정 farnesyl 지질을 포함 하는 시리즈, 후 성숙한 RAS 단백질의 수정된 C-말단 세포 막의 세포질 전단지에 삽입 합니다. 특히, 플라즈마 멤브레인 RAS의 다운스트림 이펙터 RAF1를 종사 하는 곳입니다. 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK) 통로의 구성 적인 활성화를 방지 하기 위해 여러 수준의 RAS의 제어 장소에 있습니다. GDP를 GTP를 hydrolyzing에 의해 RAS 비활성 렌더링, 게다가 활성 RAS 또한 수 나올 원형질 막에서 수정 또는 solubilizing 신호를 억제 하는 요소와의 상호 작용. 막 협회의 평가 하는 중요 한 필요 남아 있지만 형광 라이브 영상 극 세포 생물학 형광 단백질 태그 주변 막 단백질1의 subcellular 지 방화를 관찰할 수 있는 기회, 간단한 생 화 확 적인 접근으로 세미 양적 생 단백질입니다.
단백질 막과 수용 성 분수 사이 분할의 적절 한 생 화 학적 평가 비판적으로 두 가지 요소에 따라: 세포 균질 및 효율적인 분리 막과 수용 성 분수. 가장 널리 상용화 키트를 포함 하 여 일부 프로토콜 세제 기반 셀 균질에 있지만, 이러한 메서드는 분석 난독 하 처리할 용 해 단계2로 막 단백질을 추출 하 여 수 있습니다. 따라서, 세포 파쇄의 세제 비 기반으로, 기계적 방법 청소기 결과 제공합니다. 셀 문화에서 성장 또는 혈액 이나 장기에서 수확의 기계적 장애의 여러 가지 방법이 있다. Dounce 균질, 정밀한 바늘, 볼 베어링 균질, 쥡니다 있으며 질소 현상 포함 됩니다. 여기 우리가 질소 현상 평가 하 고 다른 방법에 그것을 비교. 질소 공동 현상은 높은 압력 하에서 세포의 세포질에 녹아 있는 질소에 의존 합니다. 평형, 후 세포 현 탁 액 질소 거품 때문에 그들의 비등 셀 열고 눈물 세포질에 형성 되는 등 갑자기 대기압에 노출 됩니다. 압력이 충분히 높은 경우 질소 비등 수 핵3 고 막 바인딩된 세포 리소좀4처럼 됩니다. 그러나, 압력은 충분히 낮게 유지 되는 경우 감압 원형질 막 및 응급실만 하지 다른 organelles, 그로 인하여 cavitate5지정 된 homogenate에 cytosol와 그대로 세포질 세포를 흘리 고 중단 됩니다. 이러한 이유로, 질소 현상 리소좀과 미토 콘 드리 아와 같은 세포를 고립 시키기를 위한 선택의 방법입니다.
그러나, 막과 수용 성 부분으로 쉽게 분리 될 수 있다 homogenate를 준비 하는 훌륭한 방법 이기도 합니다. 탱크 그리고 가변 배출 밸브와 출구 포트에서 질소 가스의 배달에 대 한 입구와 높은 압력을 견딜 수 있는 두꺼운 스테인리스 케이싱 압력 용기 (이제부터 "폭탄"에 게 불리는) 공동 현상 동안에 사용에 의하여 이루어져 있다.
질소 공동 현상은 1960 년대6이후 셀 균질에 대 한 사용 되었습니다. 1961 년, 사냥꾼 및 Commerfold7 포유류 조직 장애에 대 한 실행 가능한 옵션으로 질소 공동 현상은 설립. 그 이후, 연구원은 다양 한 세포와 성공, 조직에 기술을 적응 및 질소 현상 막 준비8,9, 핵과 세포 기관이 포함 하 여 여러 응용 프로그램에서 고정 되고있다 준비10,11, 그리고 불안정 생화학 추출. 현재, 세포 생물학 더 자주 다른 방법을 채택 셀 균질 질소 균질의 장점을 널리 광고 되지 있다, 질소 폭탄 비싼 이며 셀의 비교적 큰 숫자는 오해 때문에 필수. 그대로 핵과 세포-무료 homogenates를 달성 하기 위해 질소 현상에 대 한 프로토콜 게시 되지 않은, 그리고 가장 게시 된 평가에서 볼륨 세포 현 탁 액의 20 mL의 사용 되었다. 이 고전적인 기법 소규모 샘플 작업의 현재 요구 사항에 맞게 적응 하 선물이 질소 공동 현상은 특별히 배양된 세포의 수정 된 프로토콜. 질소 공동 현상은, 후는 homogenate로 분리 된다 성 (S)와 막 (P) 분수 차등 원심 분리에 의해 먼저 핵 및 손상 되지 않은 세포를 제거 하는 저속 회전 급강하 그리고 고속 스핀 (&#62; 100000 x g) 분리 녹는 분수에서 막입니다. 우리 immunoblots는 분리의 효율을 분석 하 고 다른 기계적 장애 기술로 질소 현상 비교. 우리는 또한 질소 현상 중 균질 버퍼의 삼 투 효과 조사.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Cell Disruption Vessel (45 mL)</td>
			<td style="width:181px;">Parr Instrument</td>
			<td style="width:145px;">4639</td>
			<td style="width:296px;">Nitrogen cavitation Bomb</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Dounce homogenizer (2 mL)</td>
			<td style="width:181px;">Kontes</td>
			<td style="width:145px;">885300-0002</td>
			<td style="width:296px;">Dounce pestle and tube</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">U-100 Insulin Syringe 28G&#189;</td>
			<td style="width:181px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:145px;">329461</td>
			<td style="width:296px;">Needle</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Atg12 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">271688</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">&#946;-actin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">47778</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">&#946;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:181px;">DSHB</td>
			<td style="width:145px;">E7-s</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Calnexin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">23954</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Calregulin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">373863</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Catalase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">271803</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">CIMPR antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:145px;">124767</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">EEA1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">137130</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">EGFR antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">373746</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">F0-ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">514419</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">F1-ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">55597</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Fibrillarin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">374022</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Golgin 97 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">59820</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">HDAC1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">81598</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Hexokinase 1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:145px;">2024S</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Lamin A/C antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">376248</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">LAMP1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">DSHB</td>
			<td style="width:145px;">H4A3-c</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Na+/K+ ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">48345</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Rab7 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:145px;">137029</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Rab9 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Thermo</td>
			<td style="width:145px;">MA3-067</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">RCAS1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">398052</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">RhoGDI antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">360</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Ribosomal protein S6 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">74459</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Sec61a antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">12322</td>
			<td style="width:296px;">Goat antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">349622</td>
			<td style="width:296px;">Sample tube for ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">TLK-100.3 rotor</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">349481</td>
			<td style="width:296px;">rotor for ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">364300</td>
			<td style="width:296px;">ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">cOmplete protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td>protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353089</td>
			<td>large cell scraper</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Magnetic Stir Bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-57SIX</td>
			<td>micro stir bar</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Ceramic-Top Magnetic Stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S504501AS</td>
			<td>magnetic stirrer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitrogen cavitation and differential centrifugation allows for monitoring the distribution of peripheral membrane proteins in cultured cells

배양된 세포는 주변 막 단백질을 포함 한 단백질의 subcellular 분포를 공부 하는 데 유용. 유전자 붙일 인코딩 태그 단백질 subcellular 단백질 분포의 연구를 혁명 있다. 그러나, 특히 단백질 부분적으로 cytosolic 때 형광 현미경 검사 법, 함께 분포를 계량 하기가 어렵습니다. 또한, 그것은 종종 내 생 단백질을 공부 하는 것이 중요입니다. 생화학 분석기 immunoblots 단백질 subcellular 분류 후 배포의 정량화에 대 한 황금 표준 남아 같은 분석 실험. Cytosolic 또는 특정 막 분수를 분리 하는 것을 목표로 상업 키트는,이 키트의 대부분 주변 막 단백질 세포 막에서 쉽게 추출 되는 공부에 적합 수 있는 세제와 추출 기반. 여기 우리 ultracentrifugation에 의해 질소 현상과 cytosolic와 막-바인딩 단백질의 후속 분리에 의해 세포 균질에 대 한 세제 무료 프로토콜 제시. 우리 다른 세포 유형, 전체에 녹는 subcellular 세포의 분리 및 펠 릿 분수를 확인 하 고 몇 가지 일반적인 세제 기반이 아닌 기계적 균질 방법 중에서 단백질 추출 비교. 질소의 여러 장점 가운데 현상 섬세 한 세포에 최소한의 물리적, 화학적 손상 세포 장애의 뛰어난 효율성입니다. Ultracentrifugation와 결합, 질소 현상입니다 cytosolic 사이 주변 막 단백질의 변화를 검사 하는 훌륭한 방법 막 분수.

그림 2 는 녹는 cytosolic 분수 (S) 또는 막 펠 릿 분수 (P) PNS에서 세포질 단백질의 분할을 보여 줍니다. 우리는 다른 종류에서 3 개의 대표적인 셀 라인 검사: HEK 293 (상피), NIH-3T3 (fibroblast) 및 Jurkat (림프 구). 로 구 아닌 분리 억제 물 (RhoGDI) 및 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CIMPR)에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용 되었다 cytosolic 막 분수, 각각. ?...

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Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

여기 선물이 세제 무료 균질 ultracentrifugation에 의해 질소 현상과 cytosolic와 막-바인딩 단백질의 후속 분리에 따라 경작된 한 포유류 세포에 대 한 프로토콜. 이 방법은 주변 막 단백질 수용 성 사이 분할 모니터링을 위한 이상적인 막 분수.

질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

nitrogen-cavitation-differential-centrifugation-allows-for-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15.9K 조회수.  New York University. 여기 선물이 세제 무료 균질 ultracentrifugation에 의해 질소 현상과 cytosolic와 막-바인딩 단백질의 후속 분리에 따라 경작된 한 포유류 세포에 대 한 프로토콜. 이 방법은 주변 막 단백질 수용 성 사이 분할 모니터링을 위한 이상적인 막 분수.

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of several pathogens. Efforts have been dedicated to the cattle tick control to diminish its deleterious effects, with focus on the discovery of vaccine candidates, such as BM86, located on the surface of the tick gut epithelial cells. Current research focuses upon the utilization of cDNA and genomic libraries, to screen for other vaccine candidates. The isolation of tick gut cells constitutes an important advantage in investigating the composition of surface proteins upon the tick gut cells membrane. This paper constitutes a novel and feasible method for the isolation of epithelial cells, from the tick gut contents of semi-engorged R. microplus. This protocol utilizes TCEP and EDTA to release the epithelial cells from the subepithelial support tissues and a discontinuous density centrifugation gradient to separate epithelial cells from other cell types. Cell surface proteins were biotinylated and isolated from the tick gut epithelial cells, using streptavidin-linked magnetic beads allowing for downstream applications in FACS or LC-MS/MS-analysis.

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

A modified density centrifugation gradient-based methodology was utilized to isolate epithelial cells from Rhipicephalus microplus gut tissue. Surface-bound proteins were biotinylated and purified through streptavidin magnetic beads for utilization in downstream applications.

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; 상피 직감 세포

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ability to accurately measure the influx and efflux of Ca2+ from mitochondria is important for determining the role of mitochondrial Ca2+ handling in these processes. In this report, we present two methods for the measurement of mitochondrial Ca2+ handling in both isolated mitochondria and cultured cells. We first detail a plate reader-based platform for measuring mitochondrial Ca2+ uptake using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. The plate reader-based format circumvents the need for specialized equipment, and the calcium green-5N dye is ideally suited for measuring Ca2+ from isolated tissue mitochondria. For our application, we describe the measurement of mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from mouse heart tissue; however, this procedure can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from other tissues such as liver, skeletal muscle, and brain. Secondly, we describe a confocal microscopy-based assay for measurement of mitochondrial Ca2+ in permeabilized cells using the Ca2+ sensitive dye Rhod-2/AM and imaging using 2-dimensional laser-scanning microscopy. This permeabilization protocol eliminates cytosolic dye contamination, allowing for specific recording of changes in mitochondrial Ca2+. Moreover, laser-scanning microscopy allows for high frame rates to capture rapid changes in mitochondrial Ca2+ in response to various drugs or reagents applied in the external solution. This protocol can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in many cell types including primary cells such as cardiac myocytes and neurons, and immortalized cell lines.

Here, we present two protocols for the measurement of mitochondrial Ca2+ influx in isolated mitochondria and cultured cells. For isolated mitochondria, we detail a plate reader-based Ca2+ import assay using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. For cultured cells, we describe a confocal microscopy method using the Ca2+ dye Rhod-2/AM.

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm phenotyping can be used to classify genotypes based on SG morphotype using scanning electron microscopic (SEM) analysis. SGs can be visualized using SEM by slicing through the kernel (pericarp, aleurone layers, and endosperm) and exposing the organellar contents. Current methods require the rice kernel to be embedded in plastic resin and sectioned using a microtome or embedded in a truncated pipette tip and sectioned by hand using a razor blade. The former method requires specialized equipment and is time-consuming, while the latter introduces a new host of problems depending on rice genotype. Chalky rice varieties, particularly, pose a problem for this type of sectioning due to the friable nature of their endosperm tissue. Presented here is a technique for preparing translucent and chalky rice kernel sections for microscopy, requiring only pipette tips and a scalpel blade. Preparing the sections within the confines of a pipette tip prevents rice kernel endosperm from shattering (for translucent or &#8216;vitreous&#8217; phenotypes) and crumbling (for chalky phenotypes). Using this technique, endosperm cell patterning and the structure of intact SGs can be observed.

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

This protocol allows for the preparation of transverse sections of cereal seeds (e.g., rice) for the analysis of endosperm and starch granule morphology using scanning electron microscopy.