SEC 프로파일은 단백질의 품질을 분석하는 강력한 방법입니다. 목표는 시료 품질에 대한 정보를 제공할 수 있는 형광을 사용하여 막 단백질에 대한 SEC 프로파일을 수집하는 것입니다. FSEC는 소량의 시료를 사용하며 정제를 위해 수행할 수 있고, 비교적 간단하며, 많은 실험실에서 사용할 수 있는 장비에서 수행할 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 Peak Proteins의 선임 단백질 과학자 인 Jack Wright가 될 것입니다. 실온에서 섭씨 영하 80도에서 15분 동안 보관된 세포 팔레트를 해동하거나 샘플이 더 이상 얼지 않을 때까지 해동하여 세포 팔레트를 준비하는 것으로 시작합니다. 샘플을 즉시 얼음으로 옮깁니다.
샘플을 다시 현탁하고 가용화하려면 2밀리리터의 가용화 완충액을 세포 팔레트에 추가합니다. 섭씨 4도에서 15-30분 동안 종단 간 반전으로 배양합니다. 그런 다음 미리 혼합된 세제 스톡을 추가하여 최종 농도를 1% 도데실 말토사이드(DDM)와 0.1% 콜레스테롤 헤미숙시네이트(CHS)로 만듭니다.
섭씨 4도에서 끝에서 끝이 없는 반전으로 30분 동안 가용화합니다. 저속 원심분리 단계를 수행하기 위해, 시료를 벤치탑 원심분리기에서 스윙 아웃 버킷을 이용하여 2000g에서 15분 동안 원심분리한다. 그런 다음 5 밀리리터 주사기에 부착 된 무딘 끝 바늘을 사용하여 저속 원심 분리에서 초 원심 분리 튜브로 상층액을 옮겨 고속 원심 분리를 수행합니다.
팔레트를 방해하지 않도록 하십시오. 튜브 쌍의 균형을 맞춘 후 250, 000g에서 30 분 동안 섭씨 4도에서 고정 각도 초 원심 분리 로터와 원심 분리기에 넣습니다. 시스템에 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC 버퍼를 채우고 펌프의 공기를 제거하여 고속 단백질 액체 크로마토그래피 또는 FPLC 시스템을 준비합니다.
SEC 컬럼을 FPLC에 연결하여 컬럼에 공기가 들어가지 않도록 합니다. SEC 컬럼을 실험실 등급 증류수 및 여과수의 1.5배에 달하는 컬럼 부피로 세척한 후 컬럼의 권장 유량 및 압력으로 컬럼 부피의 1.5배에 달하는 SEC 버퍼로 세척하여 사전 평형을 이룹니다. SEC 실험을 실행하려면 주사기에 부착된 끝이 뭉툭한 바늘을 사용하여 고속 원심분리 단계에서 상청액을 1밀리리터 주사기로 옮깁니다.
샘플 루프를 로드하도록 설정합니다. 주사기에서 600-700마이크로리터의 샘플을 로딩 포트로 주입하여 500마이크로리터 샘플 루프를 과도하게 채웁니다. 다음으로, 루프의 샘플을 권장 유량 및 압력에서 4밀리리터의 SEC 버퍼로 비우고 컬럼에 주입합니다.
완충액 부피의 1.5배가 통과할 때까지 동일한 유속으로 컬럼을 실행하고, 컬럼 부피의 0.25배를 통과시킨 후 0.2밀리리터의 90개 분획을 수집하기 시작합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 90마이크로리터의 실험실 등급 증류수를 저장소에서 불투명하고 평평한 바닥의 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 그런 다음 10마이크로리터의 샘플을 96웰 플레이트에서 불투명하고 평평한 바닥의 96웰 플레이트로 옮기고 웰 플레이트를 플레이트 판독기에 넣습니다.
형광 표지된 GFP의 경우, 신호를 측정하기 전에 여기를 가능한 한 488 나노미터에 가깝게 하고 형광 방출을 가능한 한 507 나노미터에 가깝게 검출한다. 플레이트 리더에 대한 향상된 녹색 형광 단백질 또는 EGFP 검출의 동적 범위 및 하한을 조사한 결과, 플레이트 리더는 신호 포화 전에 웰당 30 나노그램의 낮은 검출 한계와 최대 500 나노그램의 EGFP 표지 단백질의 동적 범위를 가짐을 나타냈습니다. 용리 부피를 Kav로 변환하고 로그 분자량에 대해 플로팅하면 표준 곡선의 보간에 의해 G-단백질 결합 수용체의 분자량을 추정할 수 있습니다.
최적의 막 추출 조건은 스티렌 말레산 공중합체를 사용한 세제 없는 추출에 대해 DDM 및 라우릴 말토스 네오펜틸 글리콜을 테스트하여 탐색되었습니다. 형광 크기-배제 크로마토그래피 프로파일에 대한 리간드 첨가의 영향은 가용화 동안 샘플에 스핑고신-1-포스페이트 또는 S1P를 첨가하여 조사하였다. S1P의 존재 하에서 가용화된 샘플은 감소된 응집과 함께 우수한 미량을 나타내었다.
다른 조건에서 세로토닌 수용체 5HT2AR의 장기 안정성에 대한 조사는 스티렌 말레 산 지질 입자의 단백질이 불리한 온도에서도 더 오랫동안 안정적으로 유지되었음을 나타냅니다. 가용화 지점과 SEC 컬럼을 통과하는 샘플 사이의 시간은 시간이 중요합니다. 일시 중지가 없어야 하며 샘플을 차갑게 유지해야 합니다.
FSEC에 따라 최상의 구조, 세제 또는 완충액에 대한 이해를 얻을 수 있습니다. 이를 통해 단백질 정제를 최적화하고 다운스트림 생물물리학 및 구조적 특성 분석을 지원할 수 있습니다.
