우리 감사 딘 리 대동맥 SMC 격리에 대 한 그의 실험실의 프로토콜을 공유. 미국 심장 협회는 건강의 국가 학회 (R21NS088854, R01HL125815, 및 D.M.G R01HL133016)에 의해 제공 된 지원 자금 (D.M.G.에 특정 14GRNT19990019), 예일 대학 (브라운-기술혁신 화목 오전 및 시작 D.M.G.에 기금)입니다.

모든 마우스 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 예일 대학에 의해 승인 됩니다.
 1. Vivo에서 배아 운명 매핑 및 클론 분석 참고: 우리는 이러한 접근 널리 평가 하 사용 셀과 그들의 클론 아키텍처 개발 및 질병 모델에서의 유래 7 , 8 , 9 , 10. <ol><li>는 크리스챤와 쥐와 쥐 Cre 기자와 사이 짝짓기 설정. 
	참고:는 있다 SMC 표시; 사용 됩니다. Myh11-CreERT2 또는 Acta2 CreERT2 마우스 11 , 12 주로이 목적을 위해 사용 됩니다. 우리는 광범위 하 게 배아 조직 표시 ROSA26R CreERT2 마우스 13를 이용 했다.
	<ol><li>클론 분석에 대 한 멀티 컬러 Cre 기자 (예를 들어, 색종이 또는 무지개 [Rb] 쥐) 8 , , 14 15를 사용 하 여 운명 매핑의 사용 하는 단색 Cre 기자 (예를 들어, ROSA26R-YFP 마우스 16) 또는 두 배 색깔 Cre 기자 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17. 
		참고:이 번 식 체계를 사용 하 여 성인 쥐를 2-6 개월 (일반적으로 30 ~ g)는 크리스챤과 Cre 기자 배아를 생성 합니다.</li>
	</ol></li> <li>금속을 사용 하 여 아침에 질 플러그 프로브 및 배아 일 (E) 0.5로 플러그 감지 당일 정오 고려 검사.</li>
	<li>플러그 감지 되 면 남성에서 여성을 분리.</li>
	<li>준비 4-오-tamoxifen 고 tamoxifen 작업 솔루션.
	<ol><li>4-오-타 목 시 펜에 대 한 100% 에탄올, 소용돌이 2 분의 50 µ L에 5 mg을 녹이 고 옥수수 기름의 450 µ L를 추가 합니다. 얼음, 샘플 냉각 될 때까지 주기 사이 휴식 10 s 사이클에 대 한 출력 레벨 2에서 sonicate. 샘플은 완전히 용 해 후 (보통 ~ 쥡니다의 4-5 주기), sonicated 솔루션의 200 µ L 고 1800 µ L의 최종 작업 솔루션 (4-오-tamoxifen, 1 mg/mL) 옥수수 기름에 용 해.</li>
		<li>그것 해산 때까지 tamoxifen에 대 한 100% 에탄올과 소용돌이에 50 mg/mL로 희석. 최종 작업 솔루션 (tamoxifen, 10 mg/mL)을 그것 완전히 용 해 되도록 45 ° C에서 저를 옥수수 기름에 희석.</li>
	</ol></li> <li>초기 배아 유도 주입 4-오-tamoxifen intraperitoneally 임신 댐.
	<ol><li>4-오-tamoxifen 주사 (임신 마우스, 또는 대략 5 mg/kg 체중 당 최대 ~ 150 µ g)를 사용 하 여 E5.5 및 이후 그들은 항복 가능한 댐, 배아, 그리고 새끼.</li>
		<li>0.5-1.5 m g (또는 17-50 mg/kg) 댐에서 태아와 임신에 대 한 복용량에서 사용 tamoxifen ~ E9 이후. 30g 바늘을 사용 하 여 모든 주사. 
		참고: 0.22 μ m 필터를 통해 여과 주입 전에 모든 혼합물을 소독을 일반적으로 사용 된다. </li></ol></li> <li>클론 분석을 위한 사용 4-오-tamoxifen (예를 들어, 5 mg/kg) 또는 (예를 들어, 50 mg/kg) 여러 셀을 표시 하려면 tamoxifen의 고용량의 복 주사.
	<ol><li>개별 셀, 같은 (즉, 대동맥)의 조직에서 거의 모든 배아 (아래와 같이이 섹션의 끝에) 분석 없음 표시 하는 셀 또는 셀만 4 오 타 목 시 펜 이나 tamoxifen 복용 아래로 적정 하 단일 색상; 이것은 임계값 복용량.</li>
	</ol></li> <li>중앙 늦게 임신 기간에 셀을 표시 하 고 추적 그들의 운명 또는 출생 후 마우스에서 clonality를 주입 호르몬 임신 댐의 복 강에 수반 1:2 (황 체 호르몬: tamoxifen) tamoxifen을 복용량 비율. 
	참고: 타 목 시 펜 복용은 17-50 mg/kg 및 황 체 호르몬 투여는 8.5-25 mg/kg (즉, tamoxifen 복용량의 절반). 황 체 호르몬 주사는 1 ~ 2 일에 의해 노동 지연 될 수 있습니다.</li>
	<li>Euthanize 댐 댐 솜 또는 거 즈를 포함 하는 소켓에 배치 됩니다 오픈 놓기 방법을 사용 하 여 원하는 나이의 태아와 임신 undiluted isoflurane와 젖 었. 흉 강 매를 유도 하 여, 중요 한 장기를 제거 하 여 또는 자 궁 경부 전위를 수행 하 여 죽음을 확인 하십시오.</li>
	<li>정화 70% 에탄올과 복 부. 가 위를 사용 하 여 자르면 복 부와 자 궁 밖으로 해 부. 자 궁에서 태아를 제거 하 고 신중 하 게 태 반 및 노른자위 sac 집게를 사용 하 여에서 배아를 분리.</li>
	<li>E15 이상 배아를 자 궁 경관 탈 구 또는 잘린 수술가 위 또는 날카로운 칼 날을 수행 하 여 안락사. 
	참고: 배아 E15 보다 빠르게 죽는 어머니의 안락사 또는 어머니에서 배아의 제거 다음.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 PBS에 배아를 놓고 있다 고 Cre 기자에 대 한 유전자 형을가 위를 사용 하 여 꼬리의 작은 조각을 잘라.</li>
	<li>PBS에 세 번 배아 2 h. 워시 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 배아를 수정 하 고 15 mL 튜브에, 그들은 싱크대까지 기다리고 이틀까지 걸릴 수 있습니다는 PBS에서 30% 자당에 태아를 품 어.</li>
	<li>채우기 플라스틱 동결 최적의 절삭 온도 (10 월) 복합 최대 레벨의 2/3를 주조한 다. 형, 상 온 (RT) 거품을 최소화 하기 위해 10 분 동안 10 월 품에 완전히 빠져들에 각 배아를 세로로 배치.</li>
	<li>조직 블록을 드라이 아이스, 70% 에탄올 목욕 동결에 똑바로 고정 하는 장소. -80에서 블록 저장 ° c.</li>
	<li>는 Cryostat 온도-22 ° C를 설정 하 고 전체 대동맥, 10-20 µ m 두께 통해 가로 섹션을 생성 하는 블록을 잘라. -80에서 그들을 저장 하기 전에 30 분 동안 RT에서 슬라이드 건조 ° c.</li>
	<li>녹여 fluorophores의 표백 피하기 위해 빛에서 보호 하는 RT에 슬라이드. 워시와 PBS Tween20 슬라이드 0.1%.
	<ol><li>클론 분석, 핵 (DAPI, 5 mg/mL)에 대 한 슬라이드를 얼룩 및 직접 레인 보우 Cre 기자에 다른 fluorophores 이미지 (하늘색: 433-nm 여기 최대, 475 nm 방출 최대; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
		<ol><li>Fluorophores 직 립 형광 현미경으로 감지에 대 한 다음 필터 사용: DAPI (여기 맥스/대역폭 350/50 nm, 방출 최대/대역폭 460/50 nm), 리안 (여기 436/20 nm, 방출 480/40 nm), 텍사스 레드 (여기 560 / 40 nm, 방출 630/75 nm) 및 mOrange (여기 577/10 nm, 방출 630/50 nm)에서 mCherry를 별도의 사용자 지정 필터.</li>
		</ol></li> <li>MTmG Cre 기자와 운명 매핑, GFP를 감지 (484 nm, 510 nm), 직접 이미징 하거나 immunostaining를 사용 하 여. (여기 470/40 nm, 방출 525/50 nm) GFP 필터를 사용 하는 직 립 형광 현미경으로 이미징.</li>
		<li>Immunostaining에 대 한 섹션 4 ° C에서 하룻밤 1 차 항 체를 품 어 0.1% 트라이 톤 X-100 PBS에 세척 하 고 다음 1 h. 안티 CD31 사용에 대 한 2 차 항 체로 품 어 (최종 농도 0.0016 mg/mL), 안티-GFP (0.006 mg/mL)와 Cy3-직접 활용된 안티-SMA (최종 희석 1: 500) 주 항 체 및 사용 보조 antibodie직접 fluorophores (최종 희석 1: 500) (테이블의 자료를 참조)를 활용 하는 s.</li>
	</ol></li> <li>직 립 형광 현미경으로 슬라이드 이미지 (확대: X-20 X 4) 또는 confocal 현미경 (10 X-63 X). 높은 확대에 대 한 사용 하 여 오일 목표 x confocal 영상 63 1.4-0.6의 숫자 조리개와 1024 x 1024 픽셀의 프레임 크기.</li>
</ol> 2. 배아 대동맥 문화 explant 참고:이 접근은 이전 integrin beta3 explanted는의 협에서의 역할을 평가 하는 데 사용 됩니다 Eln (-/-) 배아 대동맥 9 , 18. <ol><li>위의 단계 1.8에 의하여 초과 isoflurane 흡입에 의해 E15.5에 초과 임신 댐 안락사.</li>
	<li>수확 및 위에 1.9-1.10, 단계에 따라 배아를 안락사.</li>
	<li>태아 supinely 놓고 해 부 보드 확장된 사지를 고정 합니다. 해 부 stereoscope와 시각화 및 위 가슴에 흉 골을 통해 복 부 로부터 수직 절 개를 잘라가 위를 사용 하 여 있습니다. Thymus, 멀리 해 부 기관지, 폐, 식도, 간, 그리고 대 장.</li>
	<li>부드럽게 ventrally 집게를 사용 하 여 심장 내과 흉부 및 복 부 구멍의 지 측면에서 대동맥 해 부를 위를 사용 하 여. 대동맥을 출시, 근 위 루트와 원심 복 부 위치에서 잘라.</li>
	<li>셀 문화 후드에 얼음 처럼 차가운 살 균 PBS에 대동맥을 놓습니다. 24-잘 접시에 대동맥을 전송 하 고 0.5 %DMEM 문화 FBS 37에서 최대 24 h에 대 한 ° C. 
	참고: 문화 매체는 차단 항 체 (0.02 mg/mL 9 예를 들어, 안티 integrin αvβ3 항 체, 참조 테이블의 재료) 또는 약리 에이전트와 함께 보완 될 수 있습니다.</li>
	<li>대동맥 PBS로 두번 세척 하 고 20 분에 대 한 4 %paraformaldehyde 수정</li>
	<li>세척 3 회 PBS 및 대동맥 30 %1.5 mL 튜브에 PBS에 자당. 대동맥 싱크 후 만들고 냉동된 조직 블록, 컷된 섹션, immunostain, 위에 1.13-1.15, 단계에서 설명한 대로.</li>
</ol> 3. Perinatal 대동맥에서 SMC 격리 참고:이 방법은 현재 사용 되 고 Eln (-/-)와 wildtype perinatal 쥐에서 분리 대동맥 SMCs의 생물학 비교.
<ol><li>는 murine pup 출생 후 하루 (P)에 0.5, 자 궁 경관 탈 구 또는 수술가 위로 잘린 또는 1.10, 단계에서 설명한 대로 날카로운 칼 날 위에 Euthanize.</li>
	<li>는 2.3 단계를 수행 하 고, 흉부와 복 부를 연 후 23 G 바늘 왼쪽된 심 실 펑크. PBS는 중력에 의해 좌 심 실으로 흐르고 그렇게 PBS 포함 된 무 균 주사기 바늘 연결을 사용 하 여 플라스틱 튜브 높은 위치에서 수직으로 개최. 간 blanches 때까지 좌 심 실에 살 균 PBS의 주입을 허용 합니다.
	<ol><li>집게를 사용 하 여 대동맥의 외부에 adventitial 조직을 제거 하 여 2.4 단계에서 설명한 대로 대동맥 해 부.</li>
	</ol></li> <li>DMEM의 단일 솔루션에 대동맥을 소화 (500 µ L) 보충 225 U/mL 콜라, 2.25 U/mL elastase, 및 1 x 37 ° C. 수동으로 쉐이크에서 45 분에 대 한 항생제 antimycotic 튜브 5-10 분 마다</li>
	<li>멸 균 셀 문화 후드, titurate 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 200 µ L 피 펫으로 아래로 pipetting으로 소화 조직. 단일 세포 현 탁 액 15 mL 튜브에 전송 DMEM의 2 개 mL를 추가 하 고 25에서 5 분 동안 920 x g에서 원심 ° c.</li>
	<li>폐기는 상쾌한. SMC 문화 매체 (DMEM 10% FBS 1 µ g/mL rhFGF, 10 µ g/mL rhEGF, 100 U/mL 페니실린/스와 2.5 µ g/mL 암포 B 보완 포함) 3 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 35 m m 문화 접시에 전송. 
	참고: 초기 격리 시 ~ 400000 셀에서에서 얻을 수 있습니다 단일 P0.5 wildtype 대동맥; ~ 이러한 세포의 300000은 SMCs.</li>
	<li>37 ° C에서 세포를 배양 하 고 신선한 SMC 문화 매체 3 일 마다 변경 합니다. 트립 신으로 표준 기술을 사용 하 여, 셀 때 confluent 통로. 실험, 구절 3-7에서에서 셀 사용.</li>
</ol> 4. 피하 임신 (또는 비 임신)에 삼 투 미니 펌프 배치 마우스 참고:이 접근은 이전 약리 에이전트 (예: integrin β3 및 β5 억제제를 지속적으로 제공 하는 데 사용 됩니다 cilengitide) 배아 utero에서 9. 펌프 E13.5에서 임신 댐에 삽입 하 고 출산 때까지 유지 되었다.
<ol><li>Anesthetize 유도 및 유지 보수에 대 한 1-3% 산소 (1 L/min의 유량)에 2-5 %isoflurane 쥐. 발가락-핀치 반사를 사용 하 여 마 취의 수준을 모니터링 하 고 필요에 따라 마 취 에이전트를 조정 합니다. 무 통을 위한 피하 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg) 관리.</li>
	<li>는 클리퍼 스와 함께 허리를 면도. 무 균 커튼, 장갑, 그리고 악기를 사용 하 고 수술 하는 동안 난방 외과 접시에 쥐 유지.</li>
	<li>경향이 위치에 각 마우스를 배치 하 고 뒷면 betadine 이소프로필 알콜 다음 스크럽. Rostral 허리에서 꼬리의 기초에 대략 3-5 cm 가로 피부 절 개를 0.5-1.0 c m 기본 근육 부상 없이 길이 메스를 사용 하 여.</li>
	<li>Hemostat 턱을 개폐 하 여 펌프 주입에 대 한 rostrally 피하 주머니 만들고 절 개 한 hemostat 삽입.</li>
	<li>채우기 선택, 제조자에 의하여의 에이전트와 함께 삼 투 미니 펌프 &#39; s 지침 (재료의 표 참조). 주머니에 가득된 펌프를 삽입 하 고 클립 또는 6-0 비 흡수 봉합 절 개를 닫습니다. 총 수술 시간은 10 분 미만 인지 확인</li>
	<li>는 post-operatively, 그들 sternal recumbency에서 복구 될 때까지 15 분 마다 마우스를 모니터링 합니다. 48 h에 대 한 모든 6-12 h 피하 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg)를 관리 합니다. 쥐 완전히 전신 마 취에서 회복 때 그들을 매일 모니터링 합니다. 클립을 제거 하거나 봉합 수술 후 7-10 일.</li>
</ol>

<ol>
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R., Johnson, M., Urban, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+treatment+of+cardiovascular+disease+in+Williams-Beuren+syndrome.">Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome.</a> J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).</li><li>Holtwick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle-selective+deletion+of+guanylyl+cyclase-A+prevents+the+acute+but+not+chronic+effects+of+ANP+on+blood+pressure.">Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).</li><li>Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRP:+role+in+vascular+wall+integrity+and+protection+from+atherosclerosis.">LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis.</a> Science. 300, 329-332 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+adult+smooth+muscle+cell-targeted+Cre+recombinase+mouse+model.">Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).</li><li>Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacterial+artificial+chromosome+transgenic+mice+expressing+mCherry+fluorescent+protein+substituted+for+the+murine+smooth+muscle+alpha-actin+gene.">Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene.</a> Genesis. 48, 457-463 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+lacks+a+transplantable+progenitor+for+smooth+muscle+type+alpha-actin-expressing+cells.">Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells.</a> Stem Cells. 24, 13-22 (2006).</li></ol>

저자는 공개 없다.

Murine 대동맥과 동맥 경화 증의 모델 등의 성인 병 적인 조건에 그것의 주요 분 지의 광범위 한 조사와 달리 덜는 morphogenesis와 배아와 perinatal 대동맥의 병 인에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리 배아 perinatal 대동맥, 특히 SMCs에 집중 하 고 제공 하는 프로토콜을 vivo에서, 조직 explant 통해 대동맥 공부와 SMC 격리 접근. 이러한 무료 방법 제공 배아 perinatal 대동맥 공부를 다양 한 방법으로 조사 합니...

세포에 영양분과 산소를 제공 하는 다세포 생물 기능의 순환 시스템에 있으며 하지 외부 환경 접촉이 세포에서 폐기물 및 이산화탄소 제거 하. 척추 동물, 심장, 혈관의 시리즈를 통해 혈액을 펌프 기본 순환 시스템에 의하여 이루어져 있다. 동맥과 정 맥, 같은 큰 혈관의 벽 3 계층 구성: 나) intima, 또는 내부 층의 내 피 세포; 2) 미디어, 또는 원주 교류의 중간 층 길쭉한 SMCs 부드러운 근육 세포 및 탄성 lamellae; 그리고 iii) adventitia, 또는 결합 조직과 섬유 아 세포의 바깥 레이어. 혈관 생물학에서 연구의 대부분 신생 통해 새로운 내 피 세포 늘어선 관의 형성을 조사 하 고, 내 피 세포에 초점. 비교에서는, SMCs 상대적으로 작은 관심을 받을. 그러나, SMCs는 정상적인 동맥 벽의 건축에서 및 혈관 병 리에 중요 한 세포 유형입니다.
대동맥에서 심장의 좌 심 실 심장 출력을 받는 본문에 큰 구경 동맥입니다. 그것은 아 테 롬, 동맥, 및 해 부를 포함 하 여 다양 한 인간 질병에 의해 시달리 다. 성인 유기 체, 대동맥 및 그 주요 분 지는 심각 하 게 공부 하지 혈관 질환의 모델. 예를 들어, 인코딩 apolipoprotein E, 또는 저밀도 지 단백질 수용 체 유전자에 대 한 null이 쥐를 먹이 하는 고 지방 규정식 아 테 롬, 개발 하 고 최근 운명 매핑 연구 나타냅니다 기존의 SMCs에 여러 세포 유형을 일으키는 동맥 경 화성 플 라크1. 대동맥 동맥 류, 병 적인 변경 SMC apoptosis와 세포 외 매트릭스2,3개조를 포함.
실질적으로 더 적은 배아 및 perinatal 기간 동안 SMC morphogenesis 및 병 인에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리는 배아 및 perinatal 대동맥 SMCs에 vivo에서, 고립 된 세포와 조직 explants에서 공부에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 예를 들어, 프로토콜의 첫 번째 섹션 구분 운명 매핑 및 미 발달 쥐에 클론 분석. 특정 셀의 표시 및 그들의 자손4,,56; Cre recombinase 셀 전용 모터의 제어 아래 표현 용이 그러나, 휴대 전용 라벨의 일시적인 제어에 쥐에 배아 개발 하는 동안 전하실 수 있습니다. 이러한 맥락에서 SMCs (e.g.,Myh11 또는 Acta2)와 Cre 기자 활성 발기인에서 조건부 있다 표현 하는 배아 우리 tamoxifen 또는 그 활성 대사 산물 4-오-tamoxifen 임신 댐에서 주입 방법 제공 태아 나 산 후 자손에 레이블이 지정 된 셀을 분석을 위한. 또한, 운명 매핑 연구, 어느 주로 단일 기자 fluorophore1,7Cre 기자 활용, 달리 클론 분석은 실질적으로 향상 된 멀티 컬러 Cre 기자.
프로토콜의 두 번째 및 세 번째 섹션 분리 하 고 배양 배아 대동맥 explants 및 신생아에서 대동맥 SMCs 각각에 대 한 방법을 설명 합니다. 이러한 접근 허용 신호 경로, 특히 대동맥 explants 또는, SMCs의 조작에 대 한 분석을 위한 약리학 대리인의 직접 효과. 따라서, 관심의 조직에 있는 특정 한 유전자의 역할 쥐에서 전통적인 유전자 조작을 통해 보다 훨씬 더 빠른 방식에서 상영 될 수 있습니다. 또한, 고립 된 SMC 연구 세포 이동의 분석을 촉진 하 고 기술적으로 접착 제한 에 비보.
마지막으로, 네 번째 프로토콜 섹션 구분 (또는 비 임신) 임신한 쥐에 약리 에이전트와 함께 로드 피하 삼 투 미니 펌프의 배치. 이 방법은 빠른 대사 때문에 지속적인 주입을 요구 하는 에이전트에 의해 발생 하는 배아 발달에 미치는 영향의 분석을 촉진 한다. 잦은 주사의 대안 많은 에이전트에 대 한 실용적 이며 피해 야 한다, 그것은 임신 댐에서 상당한 불편을 발생할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Corn oil</td><td>Sigma</td><td>C-8267</td><td>Vehicle for tamoxifen</td></tr><tr><td>4-OH-tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Active metabolite of tamoxifen</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783-5G</td><td>Use at half the concentration of tamoxifen</td></tr><tr><td>OCT compound</td><td>Sakura tissue tek</td><td>4583</td><td>For making cryoblocks</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Polysciences inc</td><td>18986</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>IHC staining of SMA, final dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD31 antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11121</td><td>IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL</td></tr><tr><td>Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647</td><td>Life Technologies</td><td>a21244</td><td>IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL</td></tr><tr><td>Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488</td><td>Life Technologies</td><td>a11008</td><td>IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Anti-integrin beta3 blocking antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553343</td><td>Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>44H14977A</td><td>For digesting aorta</td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>34K15139</td><td>For digesting aorta</td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human FGF</td><td>Promega</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture plates</td><td>Corning</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>Alzet osmotic mini-pump</td><td>Durect Corporation</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;TCS&amp;nbsp;SP5</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier 450</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myh11-CreERT2 mice</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>19079</td><td></td></tr><tr><td>Acta2-CreERT2 mice</td><td></td><td></td><td>Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger</td></tr><tr><td>ROSA26R-CreERT2 mice</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>8463</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(mTmG/mTmG) mice</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;026862</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(EYFP/EYFP) mice</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;006148&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(Confetti/Confetti) mice</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>13731</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(Rb/Rb) mice</td><td>Lab of Dr. Irv Weissman</td><td></td><td>Obtained from lab of Dr. Irv Weissman</td></tr></tbody></table>

using in vivo and tissue and cell explant approaches to study the morphogenesis and pathogenesis of the embryonic and perinatal aorta

대동맥은 신체에서 가장 큰 동맥 이다. 대동맥 벽 내 피 세포의 내부 계층, 탄성 lamellae 그리고 부드러운 근육 세포 (SMCs)의 중간 층 및 외부 층의 섬유 아 세포와 세포 외 매트릭스의 구성 됩니다. 성인 대동맥에 병 적인 모델 (예: 동맥 경화 증)의 광범위 한 연구와 달리 훨씬 덜 배아 및 perinatal 대동맥에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리가 초점을 SMCs는 morphogenesis의 분석 및 배아와 perinatal 대동맥 SMCs 정상적인 개발 및 질병의 병 인에 대 한 프로토콜을 제공. 특히, 포함 하는 4 개의 프로토콜은: 나) 배아 운명 매핑 vivo에서 및 클론 분석; ii) explant 배아 대동맥 문화; iii) SMC 별개로 perinatal 대동맥; 그리고 iv) 임신 (비 임신) 쥐에 피하 삼 투 미니 펌프 배치. 따라서, 이러한 접근 origin(s), 운명, 그리고 대동맥 vivo에서 SMCs의 클론 아키텍처의 조사를 촉진 한다. 약리학 대리인에 지속적인 노출에 의해 배아 대동맥 morphogenesis에서 utero에서 변조에 대 한 수 있습니다. 또한, 고립 된 대동맥 조직 explants 또는 대동맥 SMCs muscularization, 확산, 마이그레이션 등 기본적인 프로세스 동안 특정 유전자 목표의 역할에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 될 수 있습니다. 격리 된 SMCs explanted 대동맥에 이러한 가설 생성 실험 다음 약리 및 유전 접근을 통해 생체 내에 컨텍스트에서 평가 수 있습니다.

대표 클론 분석에서 SMCs의 Eln (세포 외 기질 단백질 엘라 스 틴을 인코딩 하는 유전자)에 돌연변이 체 배아에에서, Eln(+), Acta2-크리스챤T2 쥐 Eln(+) 쥐도 들고 성관계 했다는 멀티 컬러 ROSA26R(Rb/Rb) 기자. 1 단계에서 설명한 대로 플러그 했다 확인 하 고 임신 댐 했다 E12.5에 단일 tamoxifen 주입 (1.5 mg)으로 유도 한 그들은 E18.5?...

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Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

8.4K 조회수.  Yale University School of Medicine. 배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

연구

발생학

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

신경과학

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

소형 동물 모델에서의 동정맥 (AV) 루프는 혈관 신생과 혈관을 조성한 조직 공학을 공부하기

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

생체공학

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

분리 및 설치류 대동맥 절제; 심혈관 질환의 연구에 다목적 기술

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

의학

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

hiPSC 유래 내피 세포의 분화 및 기계적 자극

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

저자 스포트라이트: 유체 매개 기계적 자극 하에서 배양된 hiPSC 유래 내피 세포 연구 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

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