이 모델은 인간 대동맥의 평활근 세포가 경험하는 생체 역학적 자극을 자극합니다. 환자 유래 세포와 결합하여이 시스템은 대동맥 질환의 약물 스크리닝 및 개인화 된 의학에 사용할 수 있습니다. 이 모델은 인간 대동맥에서 평활근 세포의 기계적 매개 변수를 모방하고 정밀하게 제어 할 수 있으며, 이는 대동맥 질환의 연구 및 병인을위한 새로운 시험관 내 플랫폼을 제공합니다.
절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 포스터 의사 인 Mieradilijiang Abudubat입니다. 상행 대동맥의 오른쪽 측면 영역을 멸균 pbs로 한두 번 씻어서 시작하십시오. 두 개의 안과 겸자로 조직의 내막과 외막층을 제거하고 배지 층을 유지하여 세포를 수확합니다.
미디어 레이어를 10cm 접시에 놓고 2-3mm 조각으로 자릅니다. 그런 다음 10 % fbs 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신을 함유 한 SMCM 5 밀리리터를 조직 샘플에 첨가하십시오. 멸균 점 적기로 작은 조직을 배양 병에 넣고 조직을 고르게 펴십시오.
배양 배지는 가능한 한 폐기하십시오. 그런 다음 병을 거꾸로 뒤집습니다. 거꾸로 된 배양 병에 2 밀리리터의 SMCM을 넣고 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소와 함께 인큐베이터에 1-2 시간 동안 넣습니다.
그런 다음 천천히 오른쪽을 위로 돌리고 SMCM 2 밀리리터를 더 추가하십시오. 5-7 일의 배양 후 SMCM을 4 밀리리터의 신선한 SMCM으로 교환하십시오. 미디어를 변경할 때 SMCM을 천천히 버리고 추가하십시오.
일반적으로 산발성 평활근 세포는 약 2 주 후에 사라집니다. 현미경 스테이션으로 이동할 때 배양 병을 부드럽게 운반하십시오. 그렇지 않으면 조직이 떠 다니고 세포가 천천히 자랍니다.
세포가 자라면 4 밀리리터의 신선한 SMCM이 들어있는 두 개의 새로운 배양 병으로 나눕니다. 평활근 세포에 대한 4개의 특이적 마커의 면역형광 분석을 통해 세포를 확인합니다. PDMS를 중합하려면 경화제 또는 B 성분을 염기 또는 A 성분에 첨가하고 복합체를 5분 동안 혼합합니다.
볼륨은 연구의 필요성에 따라 다릅니다. 준비된 PDMS 겔을 진공 추출 탱크에 30 내지 60 분 동안 넣고 압력을 음의 0.8 밀리 파스칼 이하로 유지한다. 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용하여 금형을 설계하십시오.
맞춤형은 고정밀 컴퓨터 수치 제어 조각 기계를 사용하여 3 층의 금형을 만듭니다. PMMA 플레이트를 사용하여 금형 프레임과 마이크로 채널을 조각 한 후 다른 플레이트에 붙입니다. 준비된 PDMS 젤을 설계된 몰드에 붓습니다.
그런 다음 섭씨 70도에서 1-2 시간 동안 가교 연결합니다. 금형에서 가교 PDMS 슬래브를 떼어내고 상용화된 PDMS 멤브레인을 100mm x 40mm 섹션으로 자릅니다. 1mm 구멍 펀처를 사용하여 3개의 PDM 슬래브에 구멍을 뚫어 PDMS 칩의 공기 및 중간 마이크로 채널의 입구와 출구를 만듭니다.
3개의 준비된 PDMS 슬래브 및 2개의 PDMS 멤브레인을 PDM 표면 활성화를 위해 5분 동안 산소 플라즈마로 처리한다. 실내 공기를 가스를 처리하고, 압력을 음의 100킬로파스칼로, 전류를 180-200밀리암페어 교각으로, 전압을 200볼트로, 처리 시간을 5분으로 설정합니다. 3 개의 PDMS 슬래브와 2 개의 PDMS 멤브레인을 실체 현미경으로 함께 접착하여 최상층이 공기 채널 PDMS 슬래브, PDMS 멤브레인으로 구성되도록합니다.
중간 채널은 PDMS 슬래브, PDM 멤브레인으로 구성되며 하단 레이어는 공기 채널 PDMS 슬래브로 구성됩니다. 조립된 PDMS 칩을 섭씨 70도 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 여러 개의 1 밀리미터 내경과 3 센티미터 길이의 라텍스 호스를 준비하십시오.
준비된 호스의 한쪽 끝에 1mm 외경과 1cm 길이의 스테인리스 스틸 바늘을 삽입합니다. 그런 다음 호스의 다른 쪽 끝에 루어를 삽입하여 PDMS 칩의 공기 및 중간 마이크로 채널에 연결된 튜브를 만듭니다. 준비된 튜브를 PDMS 칩의 공기 및 중간 마이크로 채널의 배출구와 입구에 삽입합니다.
마우스 콜라겐 밀리리터당 80밀리그램의 2밀리리터를 2밀리리터 주사기를 사용하여 PDMs 칩의 배지 마이크로채널에 주입하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 2 밀리리터 주사기로 채널에서 콜라겐을 제거하십시오. 콜라겐 코딩 PDMS 칩을 섭씨 60도 인큐베이터에 밤새 넣습니다.
PDMS 칩을 UV 멸균기에 1시간 이상 두십시오. 세포 실험을 준비하기 위해 멸균된 PDMS 칩을 매우 깨끗한 벤치에 놓습니다. 2% FBS와 1% 페니실린 스트렙토마이신을 함유하는 SMCM을 사용하는 환자로부터 5개의 1차 인간 대동맥 평활근 세포를 섭씨 37도로 설정된 4회 배양합니다.
평활근 세포 밀도가 80 %에 도달하면 SMCM을 버리고 2 밀리리터의 PPS로 세포를 씻으십시오. 1 밀리리터의 0.25 % 트립 신을 사용하여 세포를 2 분 동안 분해하고 100 RCF에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 1 밀리리터의 신선한 SMCM에 재현 탁시킵니다.
8 밀리리터의 SMCM을 사용하여 10cm 배양 접시에서 세포를 배양하십시오. 세포분석기를 이용하여 세포수를 계산하고 밀리리터당 5개의 세포에 10배한 2배의 최종 농도로 진행한다. 콜라겐 코딩 및 멸균된 PDMS 칩 배지 마이크로채널에 2밀리리터의 PBS를 천천히 붓고 나중에 2밀리리터 주사기를 사용하여 버립니다.
평활근 세포 현탁액 밀리리터당 5개의 세포 현탁액을 PDMS 칩의 배지 마이크로채널 내로 2회 10의 2 밀리리터를 천천히 붓는다. 그런 다음 PDMS 칩의 입구와 출구에서 루어를 닫습니다. PDMS 칩을 하루 동안 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 넣습니다.
배양 후 세포가 PDMS 칩의 PDMS 멤브레인에 부착되면 PDMS 칩의 공기 마이크로 채널 출구를 진공 컨트롤러 시스템에 연결합니다. 세포가 부착 될 때 길쭉한 정상 세포 형태가 현미경으로 보입니다. 매달린 둥근 세포와 대조됩니다.
솔레노이드 밸브와 진공 펌프를 켭니다. 진공 조절기를 열고 변형률에 따라 압력 수준을 조정하십시오. 그런 다음 PDMS 칩과 5% 이산화탄소가 있는 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터를 24시간 동안 놓습니다.
여러 솔레노이드 밸브, 진공 필터, 진공 조절기, 진공 펌프, 연동 펌프 및 솔레노이드 밸브를 제어하는 PLC를 준비하십시오. PLC 컨트롤러를 프로그래밍하고 켜짐 꺼짐 시간 간격을 1헤르츠로 설정합니다. 솔레노이드 밸브를 프로그래밍된 컨트롤러에 연결합니다.
진공 펌프의 입구를 진공 필터에 연결 한 다음 진공 필터의 출구를 진공 조절기에 연결합니다. 진공 조절기의 출구를 솔레노이드 밸브에 연결하십시오. 마지막으로 솔레노이드 밸브의 출구를 PDMS 칩의 공기 미세 채널 출구에 연결하십시오.
배양 배지 교체 및 약물 취급을 위해 연동 펌프의 출구를 PDMS 칩의 배지 마이크로 채널 입구에 연결하고 연동 펌프의 입구를 배지 마이크로 채널 PDMS 칩의 출구에 연결합니다. 레귤레이터에 의한 변형률의 진폭과 마이크로 컨트롤러에 의한 변형률 주파수를 조정합니다. PDMS 칩에서 인간 대동맥 평활근 세포주인 CRL 1990의 생존율은 세포 배양의 3일 및 5일째에 살아있는 및 죽은 분석을 사용하여 추정하였다.
세포 생존율은 3일째와 5일째에 90%보다 높게 나타났다. 세포골격 F-액틴 염색 결과, PDMS 칩에서 CRL 1990은 24시간 동안 연신한 후 균주에 수직으로 정렬된 세포와 정상 세포 형태를 보였다. 수축성 마커 SM22 및 CNN1의 면역형광은, 정적 조건에 비해 변형 조건 하에서 더 높았다.
또한, SM22 및 CNN1 유전자는 평활근 세포의 변형 조건에서 상향 조절되었다. 환자 유래 1차 인간 대동맥 평활근 세포의 BAV 및 TAV, 흉부 대동맥류 및 해부의 F-actin 염색은 정상적인 세포 형태와 24시간 연신 후 균주 방향에 수직으로 정렬된 세포를 보였다. BAVTAAD 및 TAV 흉부 대동맥류 및 박리에서 SM22 및 CNN1 형광은 정적 조건에서보다 변형 조건에서 더 높았습니다.
SM22 및 CNN1의 유전자 발현 수준과 유사하며, 이는 또한 정적 조건에 비해 균주 조건에서 상향 조절되었습니다. 1 차 HASMC를 분리 할 때 무균 원칙에주의를 기울여야합니다. PDMS 실험실과 멤브레인을 플라즈마로 처리 한 후에는 표면이 더러워지지 않아야합니다.
이 프로토콜을 기반으로 내피 세포를 평활근 세포와 공동 배양 할 수 있으며 주기적 변형으로 세포에 순전한 스트레스를 주어 더 많은 기계적 힘을 추가로 시뮬레이션 할 수 있습니다.
