우리는 Quinnipiac University의 Keller와 Magie 연구소의 모든 구성원에게 도움이되는 제안을 해주신 것에 대해 감사드립니다. 특히 Keller Lab에서이 부상 분석법을 개발 한 Barron L. Lincoln II에 감사드립니다. 우리는 또한 LC Keller에게 수여 된 Quinnipiac University of Arts and Science Grant-In-Aid에 감사드립니다.

1. 시약 및 장비 준비 <ol><li> 1x 절개 버퍼 (70 MM NaCl, 5 MM KCl, 0.02 MM CaCl 2 , 20 MM MgCl 2 , 10 MM NaHCO 3 , 115 MM 자당, 5 MM 트레 할 로스, 5 MM HEPES, pH 7.2)를 준비합니다. </li><li> 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)을 준비하십시오. </li><li> 0.01 % Triton X-100 1x PBS를 사용하여 1x PBT를 준비하십시오. </li><li> 과일 주스 한천 접시를 준비하십시오. 14, 간단히, H 2 O 압력솥 700 mL에 30g의 아가를 섞는다. 메틸 파라벤 0.5 g을 에탄올 10 mL에 녹이고 과즙 (포도 또는 사과) 300 mL에 넣는다. 농축 물을 고압 가압 멸균 한천 용액에 섞고 10mm x 35mm 페트리 접시의 뚜껑에 부으십시오. 참고 : 포도 한천 전원 premix는 여러 회사에서 구입할 수도 있습니다 ( 재료 표 참조). </li><li> 유충을 기계적으로 손상시키는 크기 5 포셉을 얻습니다. </li><li> 표준 Drosophila CO 2를 사용하십시오. </sub&gt; 기반 마취 장치. </li></ol> 2. Drosophila Larvae의 선택 <ol><li> 25 ° C에서 배양 한 방랑하는 제 3 기성 유충이 들어있는 약병 또는 병에 넣은 Drosophila 를 가져갑니다. </li><li> 외관에 따라 10 개의 개별 2 번째 또는 3 번째 체아 유충을 선택하십시오. 제 3 기 애벌레는 앞쪽에 분지 된 기둥 모양으로 나타나며, 제 2 기 애벌레는 작아지고 클럽 모양의 앞쪽에있는 기둥이 더 많습니다. 참고 : 애벌레 단계도 타이밍에 따라 식별 할 수 있습니다. 25 ℃에서 부화 후 약 2 시간 후 두 번째 유충이 나타나고, 약 24 시간 후에 3 번째 유충이 탈피한다. NMJ에서 신경 퇴행을 검사하는 데 관심이 있다면, 두 번째 instar 애벌레가 부상 당할 필요가있다. </li></ol> 3. 기계 상해를위한 Drosophila Larvae 준비 <ol><li> 조심스럽게 집게 또는 페인트 붓으로 개별 유충을 선택하십시오.어쨌든 압축하지 마라. </li><li> 차가운 1X PBS 또는 해부 완충액이 들어있는 유리 접시에 10 개의 애벌레를 직접 놓아 음식 잔해물을 제거하고 애벌레의 운동성을 감속시킵니다. </li></ol> 4. Drosophila Larvae의 기계적 상해 및 치료 <ol><li> 공동 2 마취 장치에 각각의 유충을 놓는다. </li><li> 절개 현미경 아래에서 큐티클을 통해 분절 신경을 시각화하기 위해 각 유충을 등쪽에 조심스럽게 굴립니다. </li><li> 위치 크기 5 포셉은 입 갈고리에서 시작 유충의 길이를 약 1 / 2 ~ 2 / 3 방법. 일단 위치, 크기 5 포 셉를 가진 segmental 신경을 포함하는 복부 표피의 약 1/3을 집어. <ol><li> 유충의 분절 신경이 손상되었는지 확인하려면 분열 신경을 분쇄하는 데 충분한 힘을 가하고 큐티클은 그대로 두십시오. 정확한 양의 힘을 결정하려면 10 개의 유충을 분쇄하고5 시간 후의 사망률은 50 % 미만이다. </li></ol></li><li> 부상 후 약 0.5 g의 효모 페이스트가 들어있는 과일 주스 한천 플레이트에 애벌레를 조심스럽게 옮깁니다. 각 유충을 앞쪽 끝이 효모 페이스트에 놓 이도록하여, 방해받은 운동성에도 불구하고 계속 먹이십시오. 참고 : 애벌레 분절 신경이 손상되었는지 확인하기 위해 한천 플레이트로 옮긴 후 분열 된 애벌레 운동성을 관찰 할 수 있습니다. 부상당한 유충은 부상 부위 뒤쪽에서 효과적으로 마비되지만 구강 후크와 사료를 움직일 수 있습니다. 부상 후 동물의 사망률이 높기 때문에 실험에 필요한 것보다 20-50 % 이상의 동물을 다치는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 빈 100x15mm 페트리 접시 바닥에 효모 붙여 넣기와 부상당한 유충 10 개가 들어있는 한천 플레이트를 놓습니다. 종이 타월이 애벌레 나 한천 플레이트에 닿지 않도록 젖은 종이 타월로 한천 플레이트에 부상당한 유충이 들어있는이 페트리 플레이트를 덮습니다. 이것을 배치하십시오RT에서 더 큰 기밀 용기에 페트리 접시. </li><li> 부상당한 후 일정 기간 (6, 12 또는 24 시간) 후에 해부학 검사를하십시오. 참고 : axonal cytoskeleton에 손상의 즉각적인 영향을 검사하기 위해, 애벌레는 부상 직후 해부 수 있습니다. axonal 수송 결함을 검사하기 위해, 애벌레는 부상 후 약 6 시간 후에 해부 될 수 있습니다. 손상 후 약 12 ​​시간 후에 유비퀴틴 화 된 단백질의 축적이 관찰 될 수 있으며 손상 후 24 시간 후에 NMJ에서 운동 뉴런의 퇴행이 관찰 될 수있다. </li></ol> 5. NMJ에서의 신경 퇴행 분석 <ol><li> 앞서 설명한대로 Drosophila larval NMJ를 해독하십시오. 해부 버퍼의 드롭에 핀 (15, 16) 등쪽면을 따라 절단 한 짧게하는 실 가드 판 위에 핀 유충 및 필렛 체벽 근육을 노출시킨다. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 또는 Bouin &#39;s Solution 중 유충을 항생제에 따라 고정뉴런과 근육을 시각화하는 데 사용되는 신체. 참고 : 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 단백질 태그가 Bouin의 고정액이 너무 거칠 수 있으므로 시각화해야하는 경우 PFA 고정을 사용해야합니다. </li><li> 이전에 11 , 13 , 16 , preynaptic 모터 뉴런과 인접 postsynaptic (SSR) 근육 주름을 표시하기 위해 설명한 immunofluorescence을 수행합니다. 형광 결합 conjugated 양 고추 냉이 퍼 옥시다아제 (HRP) (1시 300 분) 17 presynaptic 막 및 axons을 시각화하고 활성 영역은 anti-Bruchpilot (Brp) 항체 (nc82; 1 : 100, Developmental Studies Hybridoma Bank)를 사용하여 염색 될 수 있습니다. anti-Dics Large (Dlg) 항체 (1 : 10,000)로 시냅스 후 근육을 동시에 라벨링합니다. 18 </li><li> 이전에 설명한대로 NMJ에서 신경 퇴화를 정량화하기위한 확립 된 분석을 수행하십시오. 8 </sup&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 간단히 시냅스 전후의 구획에 대해 개별 NMJ를 동시에 시각화하십시오. postsynaptic 마커로 표시되었지만 presynaptic 마커로 표시되지 않은 모든 부음은 신경 퇴화 부위를 나타냅니다 ( 그림 1 ). 동물당 NMJ 당 평균 부 턴수와 평균 NMJ 수를 정량화 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilia,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li><li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li><li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor.">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li><li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization.">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li><li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li><li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin/ankryin/microtubule+cytoskeleton.">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li><li>Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos.">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

앞에서 설명한 신경 손상은 여기에서 입증되었는데 Drosophila 유충의 분절 신경에서 상해 / 스트레스를 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 4, 5, 6, 14이 실험 기술은 신경 퇴행을 초래하는 이벤트의 시간적 순서를 해부뿐 아니라 부상을 올리는 운동 신경 세포체에 전사 변화를 조사하기 이전에 사?...

신경 세포의 퇴행은 정상적인 발달 중에 발생하며 자연 노화 과정, 상해, 스트레스 또는 질병 상태에 의해 유발 될 수 있습니다. 초파리 인 Drosophila melanogaster 는 뉴런의 퇴행을 유발하는 분자 메커니즘의 현저한 유사성으로 인해 신경 퇴화를 연구 할 수있는 간단하고 강력한 모델 유기체를 제공합니다. 이러한 유사점은 질병 관련 인간 유전자의 약 70 %가 Drosophila 동족체를 가지고 있다는 사실에 의해 강조됩니다. (1) 또한, 많은 분석과 인간의 신경 퇴행성 질환을 연구하는 기술 도구 개발 및 초파리에 활용되고있다. 2 , 3 Drosophila 내에서, 신경근 접합부 (NMJ)는 세포 및 전기 생리 학적 성질의 분석을 가능하게하며, 눈에 보이는 n으로 인해 신경근 질환을 연구하는 중요한 시스템임이 입증되었다euron-muscle 연결. (2) 본 연구에서는 분절 신경의 재현 부상을 허용 초파리 유충의 생체 신경 세포의 손상 분석을 설명합니다. 이 motoneuron 부상 NMJ 24 시간 부상에서 neurodegeneration의 결과 세포 조건의 일시적인 결과가 발생합니다. 신경 퇴행을 유발하는 운동 신경 세포를 재현성있게 손상시키는 능력은 퇴행성 과정에 필요한 특정 유전자의 확인, 신경 손상에 대한 전사 반응의 해부 및 보호 신호 전달 계통의 분석과 같은 다양한 용도를 갖는다. 4 , 5 , 6 이 방법은 살아있는 동물의 신경 변성과 재생을 연구하기 위해 미세 유체와 함께 사용되었습니다. 7 우리는 모터 뉴런 degenerat을 검사하기 위해 정량 분석을 사용합니다이온은 기계적 부상 후 Drosophila NMJ에서 발견된다. 이 분석은 시냅스 후 막과 단백질의 손실이 postsynaptic 근육 막 폴드로 특징 지어진 subynaptic reticulum (SSR)의 해체에 선행한다는 사실에 근거합니다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 이시 험은 시냅스 전의 뉴런이 인접한 시냅스 후 근육에 연결을 잃은 &quot;시냅스 발자국&quot;의 정량화를 허용합니다. 퇴행성 과정 유생 (12)에 걸쳐 점진적인 것으로 도시되었으며, 변경된 시냅스 개발 또는 발아에 의해 설명 될 수 없다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 광고기존의 돌연변이보다 기계적 상해를 사용하는 유리한 점은 NMJ에서 신경 퇴행으로 이끄는 세포 사건의 시간 순서를 해부 할 수 있다는 것이다. 13

<table><tbody><tr><td>Micro-dissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Air Tank</td><td>Tech Air</td><td>UN 1013</td><td>Various tank sizes can be purchased</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Anesthetizing Apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Stainless-steel pins, size 0.1</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>To pour dissecting plates</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution</td><td>Sigma</td><td>HT 10132-1L</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>Dissecting Stereo MIcroscope</td><td>AmScope</td><td>SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>anti- nc82 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>anti-discs large antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td><td>One can you Alexa Fluor&amp;reg; 488, 594 or 647</td></tr><tr><td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-484C</td><td>Used to create humid chamber for larval recovery</td></tr></tbody></table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

뉴런의 퇴행은 정상적인 발달과 상해, 스트레스 및 질병에 대한 반응으로 발생합니다. 신경 세포 변성의 세포 특징은 인간과 무척추 동물에서 이러한 과정을 유도하는 분자 메커니즘과 현저하게 유사합니다. 초파리 Drosophila melanogaster 는 강력하지만 단순한 유전 모델 유기체로서 신경 퇴행성 질환의 세포 복잡성을 연구합니다. 실제로 질병 관련 인간 유전자의 약 70 %는 Drosophila 상 동체를 가지고 있으며 인간의 신경 퇴행성 질환을 연구하기 위해 파리를 사용하여 과다한 도구와 분석법이 기술되었습니다. 더 구체적으로 Drosophila 의 신경근 접합점 (neuromuscular junction, NMJ)은 신경 세포와 근육 사이의 구조적 연결을 분석 할 수 있기 때문에 신경근 질환을 연구하는 효과적인 시스템으로 입증되었습니다. 여기, 우리는 Drosophila의 생체 내 운동 신경 손상 분석에 대해보고합니다.재현 가능하게 24 시간까지 NMJ에서 신경 퇴행을 유도한다. 이 방법론을 사용하여 우리는 운동 신경 세포의 퇴행을 초래하는 세포 사건의 시간 순서를 기술했다. 부상 방법은 다양한 응용 분야를 가지고 있으며, 신경 퇴행에 필요한 특정 유전자를 확인하고 신경 손상에 대한 전사 반응을 해부하기 위해 활용되어왔다.

여기에 제시된 절차를 사용하여, 우리는 기계적 신경 상해가 신경 퇴행성 사건의 일시적인 해부를 허용한다는 것을 증명했습니다. 14 , 18 사건의 순서는 이전에 특징 지어졌고 세포 골격의 즉각적인 붕괴, 축색 성 인신 매매 결함, ubiquitinated 단백질의 축적, 그리고 후속 적으로 24 시간의 신경 손상 이후에 시작된다. 손상되기 전?...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration at JoVE.com

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

여기에 우리는 세 번째 instar 애벌레의 neuromuscular 접합 (NMJ)에서 모터 뉴런의 신경 퇴화를 시각화하고 계량하기 위해 초파리 유충의 분절 신경을 손상시키는 간단하고 널리 액세스 할 수있는 방법을 설명합니다.

학습 할 간단한 신경계 상해 방법론<em&gt; Drosophila</em&gt; 모터 뉴런 변성

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

a-simple-neuronal-mechanical-injury-methodology-to-study-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

5.5K 조회수.  Quinnipiac University.  여기에 우리는 세 번째 instar 애벌레의 neuromuscular 접합 (NMJ)에서 모터 뉴런의 신경 퇴화를 시각화하고 계량하기 위해 초파리 유충의 분절 신경을 손상시키는 간단하고 널리 액세스 할 수있는 방법을 설명합니다. 

비디오: A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

연구

발생학

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

에 중추 신경 시스템 복구를 조사하기 위해 상해 패러다임<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

신경과학

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

에 신약 표현형을 평가<em&gt; 초파리</em&gt; 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기<em&gt; 초파리</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

드로소필라 멜라노가스터에서 축사 사망 시축과 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

신경변성과 관련하여 성인 Drosophila에서 시냅스 퇴성을 시각화

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Assessing the Structural Integrity of the Dorsal Longitudinal Muscle Neuromuscular Junctions in Drosophila

Source: Sidisky, J. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61363">Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a protocol for assessing the structural integrity of neuromuscular junctions in the dorsal longitudinal muscles of Drosophila. The procedure involves staining neurons and muscles with two distinct antibodies and comparing fluorescence patterns between mutant and wild-type flies. A reduction in neuronal staining in mutant flies indicates neurodegeneration, while the muscle structure remains intact.

Drosophila에서 등쪽 종근 신경근 접합부의 구조적 무결성 평가

1. Flash freezing and thorax bisection

	Before beginning the bisections, fill a Dewar flask with liquid nitrogen wearing proper cryo-protective gloves ...

학습 할 간단한 신경계 상해 방법론

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

에 중추 신경 시스템 복구를 조사하기 위해 상해 패러다임

에 신약 표현형을 평가

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화

드로소필라 멜라노가스터에서 축사 사망 시축과 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

신경변성과 관련하여 성인 Drosophila에서 시냅스 퇴성을 시각화

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

Drosophila에서 등쪽 종근 신경근 접합부의 구조적 무결성 평가