프로토콜은 연령 종속 방식으로 시냅스 무결성을 평가하기 위한 간단한 모델을 제공합니다. 그래서 우리는 구조적 및 기능적 분석 모두에 순종하는 조직에서 신경 퇴행성 질환을 연구할 수 있습니다. 이 기술은 등쪽 세로 근육 신경 근육 접합에서 신경 조직과 근육 조직의 보존을 용이하게합니다.
작업하기 어려운 시간 및 조직에 따라 시냅스 기능을 포괄적으로 조사합니다. 이 방법은 ALS, 파킨슨 병, 헌팅턴병 및 알츠하이머 병을 포함한 신경 퇴행성 질환연구에 적용될 수 있습니다. 해부를 시작하기 전에 200 마이크로 리터 파이펫의 끝에서 약 10 밀리미터 절단.
마취를 투여 한 후 70 %에탄올이 들어있는 6 센티미터 페트리 접시에서 6 ~10 파리를 연주하고 페인트 브러시를 사용하여 각 플라이를 부드럽게 마시십시오. 1-2분 후, 집게를 사용하여 몸이나 날개로 한 번의 비행을 해부 현미경으로 PBS 7~10밀리리터가 함유된 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시로 옮기다. PBS에 잠긴 플라이로, 무딘 Dumont 번호 5 는 조심스럽게 날개를 제거하고 다리를 제거하기 위해 큐티클의 복부 측에 작은 절개를 만들기 위해 직선 가장자리 스프링 해부 가위를 스팬을 사용하여 집게를 찾을 수 있습니다.
한 손에해부 가위를 들고 다른 한 손에는 무딘 집게를 들고, 플라이 복부 쪽을 위로 올려 놓고 시편을 집게하여 제자리에 놓고, 가위로 머리와 복부를 제거합니다. 40 마이크로리터로 설정된 200 마이크로리터 파이펫과 수정된 파이펫 팁을 사용하여 thoraces를 수집하고 격리된 조직 샘플을 PBS 900 마이크로리터와 32%포름알데히드의 150마이크로리터를 포함하는 적절하게 표지된 튜브에 넣습니다. 실온에서 30분 후, 파스퇴르 파이펫을 사용하여 고정을 제거하고 세척당 PBS 1.5 밀리리터로 3번 빨래를 헹구습니다.
양면을 시작하기 전에 돈 냉동 보호 장갑과 안전 안경과 액체 질소로 투어 플라스크를 채웁니다. 블레이드 브레이커를 사용하여 깃털 블레이드를 비스듬히 잡고 블레이드를 구부려 작은 조각을 부러뜨리세요. 블레이드 브레이커를 사용하여 블레이드를 제자리에 고정하고 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 샘플 튜브에서 모든 PBS를 제거합니다.
극저온 핀셋을 사용하여 액체 질소의 플라스크에 튜브를 잠급니다. 10초 후 파스퇴르 파이펫을 사용하여 얼음 위에 있는 각 튜브에 약 300마이크로리터의 얼음 차가운 PBS를 추가하고, 얼음 차가운 PBS가 들어있는 10센티미터 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 1개의 가난한 도끼 복부 면을 올려 놓습니다. 흉부의 무딘 쌍을 사용하여 흉부를 배치하고 집게 쌍을 찾으려면 흉부 중고 국고의 일부를 제거하여 흉부 의 중간선을 노출시하십시오.
흉부의 미드라인을 가이드로 사용하여, 흉부의 3분의 1을 얕은 컷으로 만들고 무딘 집게를 사용하여 흉부를 45도 각도로 배치합니다. 블레이드를 사용하여 흉부의 중간선을 똑바로 잘라 두 개의 헤미토레이스를 얻고 두 개의 헴피토레이스를 조심스럽게 만들어 등경 근육을 손상시키지 않고 과잉 조직을 제거하십시오. 그런 다음 근육 조직 샘플을 PBS의 적절하게 표시된 튜브에 넣습니다.
모든 흉부 샘플이 양분되면 4섭씨에서 적어도 1 시간 동안 버퍼를 차단하는 조직을 과구화합니다. 인큐베이션이 끝나면, 소용돌이는 갓 준비된 구조 얼룩 용액을 고치며, 어둠 속에서 실온에서 회전자에 2시간 동안 각 시료에 150마이크로리터의 얼룩을 추가합니다. 염색 후 PBST에서 샘플을 세척하고, 하나의 유리 현미경 슬라이드에 떨어져 반 15 밀리미터 떨어져 쌓여 다섯 보강 라벨을 배치합니다.
수정된 마이크로 파이펫 팁을 사용하여 Thoraces를 각 슬라이드로 옮기고 실험실 와이프를 사용하여 과도한 PBST를 제거합니다. 포셉을 사용하여 토레이스가 근육 쪽을 위로 향하도록 샘플을 정렬합니다. 시료가 올바르게 지향되면 200 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 각 슬라이드에 70 마이크로리터의 장착 매체를 적용하고 각 슬라이드를 커버 슬립으로 덮습니다.
그런 다음 매니큐어를 사용하여 커버 슬립의 바깥쪽 가장자리를 넉넉하게 코팅하여 각 조직 주위에 완전한 씰을 얻습니다. 시냅스 무결성을 평가합니다. 신경 근육 접합은 고추냉이 과로시다제와 플로에 주석 모터 뉴런으로 염색 할 수 있으며 43 킬로달튼 뮤톤의 타르 결합 단백질에는 21 일까지 고추냉이 과산화가 거의 또는 전혀 염색되지 않으며 야생 형 단백질은 그대로 유지됩니다.
근육 염색에 눈에 띄는 차이 관찰 되지 않습니다. 구조적 염색 등경 근육 신경 근육 접합 라벨링 외에도 시냅틱 전 및 시냅스 마커를 사용하여 시냅스 무결성평가를 제공할 수 있습니다. 액체 질소 플래시 동결은 비 플래시 냉동 조직이 해부 동안 손상에 더 취약하기 때문에 성공적인 양단을 용이하게합니다.
이 절차에 따라 보존 샘플은 시냅스 구조의 특정 측면을 측정하기 위해 공초점 현미경 검사법에 의해 분석될 수 있다.
