우리는 그들의 도움이 논의 및 의견 Jha 실험실의 구성원 감사. 스는 암 과학 연구소의 싱가포르 (R-713-006-014-271), 국가 의료 국립 연구 재단 싱가포르와 싱가포르 교육부의 연구 센터 우수 이니셔티브의 밑에서 교부 금에 의해 지원 되었다 연구 위원회 (CBRG-검; BNIG11nov001 및 CS-IRG; R-713-000-162-511), 교육 학술 연구 기금 (모에 AcRF 계층 1 T1-2012 년 10 월-04). Y.Z., G.S.C., 및 C.Y.T. 암 과학 연구소의 싱가포르, 싱가포르의 국가 대학에 의해 수 여 하는 대학원 친교에 의해 지원 되었다.

1입니다. 준비
<ol><li>MCF10A 문화 매체를 준비: Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) F12 (1:1) 5% 혈 청, 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 그리고 10 µ g/mL 인슐린 승마 /.</li>
	<li>혈 청 무료 매체를 준비: DMEM/F12 (1:1)와 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 10 µ g/mL 인슐린.</li>
	<li>SiRNA는 다음 순서를 사용 하 여: siControl: 앞으로: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' 역: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3' siTIP60: 앞으로: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3' 역: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'</li>
	<li>10 cm 세포 문화 요리와 24-잘 접시를 사용 합니다.</li>
</ol>2. TIP60를 사용 하 여 siRNA의 일시적인 고갈
<ol><li>하루에 1, transfection 시 약 (예: Lipofectamine RNAiMAX)의 aliquot 15 µ L의 2 mL 혈 청 매체 (예를 들어, Opti 메모리) 감소와 각각 10 µ L의 각 siRNA (10 µ M 주식), 그들을 혼합.</li>
	<li>20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.</li>
	<li>1 x 106 MCF10A 셀 10 cm 접시에 배양의 3 mL 함께 씨앗 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>10 cm 접시에 siRNA 혼합물에 의해 드롭 추가 합니다.</li>
	<li>세포는 동일 하 게 37 ° C 배양 기에 그것을 올려 놓기 전에 배포 되도록 요리를 흔들어.</li>
	<li>후 보육의 6 h, 포함 하는 siRNA 매체를 8 mL 신선한 문화 매체의 바꿉니다.</li>
	<li>하루에 2, siRNA 혼합물의 다른 배치를 준비 하 고 20 분 동안 실내 온도에 그들을 품 어.</li>
	<li>1 일 추가 문화 매체의 8 mL을 aspirate 하 고 신선한 문화 매체의 3 mL와 함께 그것을 대체.</li>
	<li>요리에 의해 드롭 siRNA 혼합물의 두 번째 배치를 추가 합니다. 요리는 시 약은 완전히 인큐베이터에 그들을 올려 놓기 전에 혼합 되도록 흔들어.</li>
	<li>6 h 후 siRNA 포함 된 매체를 8 mL 신선한 문화 매체의 바꿉니다.</li>
</ol>3. 씨 셀 상처 치유 분석 결과 대 한
<ol><li>3 일에 매체를 삭제 하 고 셀 염 분 (PBS) 버퍼 인산 염 버퍼의 2 mL을 한 번 씻어. PBS 버퍼를 삭제 합니다.</li>
	<li>접시에 1 mL의 트립 신-EDTA 버퍼 x 1 추가 하 여 siControl 및 siTIP60 치료 세포를 trypsinize. 다시 20 분 동안 인큐베이터에에서 넣어.</li>
	<li>각 접시에 완전 한 문화 매체의 4 mL를 추가 하 고 셀 pipetting에 의해 resuspend 15 mL 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>5 분 동안 200 g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>다시 혈 청 자유로운 매체의 5 mL로 세포를 일시 중단 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>SiControl 및 siTIP60; 6 x 105 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 잘 혼합 셀 인지 확인 합니다. 100 %confluency 위해 24-잘 접시의 한 잘에 세포 현 탁 액의 500 µ L를 추가 합니다. 5 ~ 6 우물 각각 siControl와 siTIP60에 대 한 씨앗</li>
	<li>부드럽게 앞뒤로 접시 그리고 사이드-투-사이드 분산 되도록 흔들어. 원형 모션을 하지 마십시오. 24 h에 대 한 인큐베이터에 접시를 남겨 주세요.</li>
	<li>TIP60의 최저 효율 확인 나머지 셀을 수확. 이렇게 하려면 5 분 동안 200 g에서 나머지 세포 현 탁 액을 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>RNA는 상업적인 시 약을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 분리 하 고 최저 효율을 평가 하는 실시간 양이 많은 PCR을 진행.</li>
</ol>4. 상처를 만듭니다
<ol><li>단계 대조 현미경 셀 완전히 장착 되었는지 확인 하려면 확인 하십시오. 세포는 현미경 관찰 (4 배, 10 배, 및 20 배 확대) 셀 셀 confluent 단층 형성 하고있다 연결 완벽 하 게 됩니다. 참고: siControl 셀 일반적으로 siTIP60 셀 보다 더 나은 연결합니다. 이 때문에 TIP60의 소모 셀 더 엽 같은20으로 예상 된다. 여기, 일반 벤치탑 화이트 빛 단계 대조 현미경 사용 됩니다.</li>
	<li>상처를 생성 하려면 부드럽게 200 µ L 피 펫 팁; 우물의 중앙에 걸쳐 직선을 긁어 생성 된 상처의 길이 우물의 직경으로 동일 합니다. 모든 나머지 우물에 대 한이 단계를 반복 합니다. 각 잘 새로운 피 펫 팁을 사용 합니다.</li>
	<li>부드럽게 씻어 5 번 잘 각 혈 청 무료 사용 하 여 분리 된 세포를 제거 하는 매체.</li>
	<li>각 잘 하 혈 청 자유로운 매체의 1 mL을 추가 하 고 라이브 셀 이미징에 진행.</li>
</ol>5입니다. 라이브 셀 이미징의 설치
<ol><li>현미경을 라이브 셀 이미징 챔버에서 온도 37 ° c.에 도달 하면 되도록 설정 하기 전에 적어도 1 시간을 제어 하는 온도</li>
	<li>라이브 셀 이미징 시작 하기 전에 이산화탄소 (CO2) 가스 공급을 켜십시오. 5% CO2 농도 설정 합니다.</li>
	<li>현미경의 무대에서 24-잘 접시를 놓고 이미징에 대 한 10 배 확대와 대물 렌즈를 선택 합니다. 직접 카메라 대신 접 안경에 내보낸된 빛 고 상처와 주위 세포를 찾기 위해 초점을 조정 합니다. 참고:이 경우에, 단계 대조와 흰색 빛 사용 되었다.</li>
	<li>라이브 셀 옵저버 시스템을 사용 하 여 각 잘에서 상처의 위치를 표시. 참고: 라이브 셀 이미징 시스템의 자동화 된 단계는 여러 위치에서 이미지 수집에 대 한 수 있습니다. 이미지는 한 번 모든 간격 모든 표시 된 위치에 이동 됩니다.</li>
	<li>시간 조건 설정: 1 시간 간격 및 72 h 기간; 이 설정에 따라 시스템 것입니다 사진을 찍고 각 표시 된 위치에 72 h. 어떤 원하는 시간 간격 설정에 대 한 모든 시간과 모니터링 기간. 참고: 여기, 기간 72 h는 최고의 이러한 셀 시작 후 72 h 혈 청 자유로운 매체에 죽어가 고 있기 때문에.</li>
</ol>6. 단일 셀 이동 추적
<ol><li>후에 72 h. JPEG 형식에서 이미지와 동영상을 AVI 형식에서으로 데이터를 내보낼 데이터를 내보냅니다. 참고: 이것은 중요 ImageJ 소프트웨어만 AVI 형식의 동영상을 인식할 수 있기 때문 에입니다. SiTIP60 및 siControl 세포 사이 다른 셀 마이그레이션 속도 비디오에서 명확 하 게 관찰할 수 있습니다.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어에 AVI 비디오를 엽니다.</li>
	<li>MTrackJ 플러그인 (플러그인 해야 합니다 다운로드 및 설치 별도)를 열고: 플러그인 > MtrackJ.</li>
	<li>MtrackJ 도구 모음에서 "추가" 탭을 클릭 하 여 비디오에서 선택 하는 단일 셀에 대 한 트랙을 추가 합니다. 침략의 끝에 셀 및 자체에 마이그레이션할 수 있는 셀을 선택 (단일 셀 마이그레이션). 비디오에서 선택한 셀의 움직임에 따라 하 고 그들을 추적 하는 것은 MtrackJ를 사용 하 여.</li>
	<li>도구 모음에서 "측정" 탭을 클릭 하 여 이동 거리를 측정 합니다. 참고: 여기는 siControl에 거의 셀 단일 세포, siTIP60 세포의 많은 단일 세포로 이동 하는 반면 단일 셀 운동 측정 하기 어려운 만들기로 이동. 그러나, 침략 앞에 있는 세포의 움직임 수 여전히 추적 되며, siControl 및 siTIP60 셀에 계산.</li>
	<li>동영상 AVI 형식으로 트랙을 저장 합니다.</li>
</ol>7입니다. 셀 마이그레이션 능력의 정량화
<ol><li>정량화, 0 h 이미지와 "n" h, 여기서 "n" _는 timepoint 닫히면 siTIP60 또는 siControl 세포는 완전히 상처에서 이미지를 선택 합니다. 참고: 여기, 48 h 선택 되었다, siTIP60 세포에 상처 거의 완전히 폐쇄 했다.</li>
	<li>ImageJ는 다음 수식을 사용 하 여를 사용 하 여 백분율 마이그레이션 계량: (0 h-"n" h의 영역에서 상처의 지역) / 0 h x 100의 지역.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM.">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li><li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53.">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li><li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Rvb1/Tip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60/NuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage.">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li><li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+TIP60.">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li><li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control:+many+tricks+in+one+HAT.">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li><li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity.">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+the+p53+DNA-binding+domain+regulates+apoptosis+induction.">Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction.</a> Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).</li><li>Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60-dependent+acetylation+of+p53+modulates+the+decision+between+cell-cycle+arrest+and+apoptosis.">Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis.</a> Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).</li><li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration,+metastasis,+and+patient+survival.">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li><li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response.">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway.">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes.">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li><li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer.">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li><li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ligase+EDD1/UBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60.">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+from+dissemination+to+organ-specific+colonization.">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li><li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program.">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li><li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration.">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li><li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

그것은 셀 마이그레이션 과정에서 셀 수 중 이동 부착 시트;의 형태로 알려져 느슨한 클러스터; 또는 단일, 고립 된 세포입니다. 모드와 다이나믹 셀의 다른 한 상태에서 변화할 수 있다 그리고 표현 형 시간 변경할 수 있습니다. 전통적인 상처 치유 분석 결과 12 또는 24 h와 같은 긴 시간 간격으로 현미경에서 찍은 스냅 사진을 기반으로 합니다. 이 어렵게 상처 폐쇄의 동적 및 셀 움직임의 패턴을 ?...

HIV Tat에 상호 작용 단백질 60 kDa (TIP60)은 히스톤과 비 히스톤 단백질1,2acetylate 수 있는 lysine acetyltransferase 이다. 그것의 기능은 전사, DNA 손상 복구 및 apoptosis1,3,,45,6, 를 포함 하 여 여러 신호 전달 경로에 영향을 찾을 수 있습니다. 7 , 8. 또한, TIP60 자주 downregulated 암에 그 downregulation 암 전이 상관은 고 가난한 생존 요금9,,1011,12, 13,14. 종양 전이 암 관련 된 죽음의 주요 원인입니다. 그것은 다단계 과정 그리고 전이의 초기 단계는 마이그레이션 및 인접 조직을15,16으로 종양 세포의 내 습을 포함 한다. 그렇게 하기 위해 종양 세포는 먼저 기본 종양 질량 총칭 침입 셀 시트의 모양에서 분리 해야 합니다 또는으로 단일 셀17분리. 이 과정 동안 종양 세포는 종종 엽 전환 (응급), 형태학 및 세포 접착 기능17,18에 변화 결과로 상피 받을.
몇 가지 기법 연구는 마이그레이션 개발 되었습니다 그리고 종양의 내 습 능력 세포 생체 외에서. 그 중, 상처 치유 분석 결과 가장 효율적이 고 경제적인19이다. 첫째,이 방법은 마이그레이션할 및 간격 닫기 셀 되므로 셀 confluent 단층에 인공 갭의 창조를 포함 한다. 둘째, 시작 및 실험의 끝에 간격의 이미지를 캡처할 수 있습니다. 마지막으로, 간격 폐쇄의 비교는 세포 이동의 비율을 결정 하는 데 사용 됩니다. 단계 대조 현미경 일반적으로 기존의 상처 치유 분석 실험에 대 한 이미지를 캡처하는 데 사용 됩니다. 상처 치유 분석 결과의 또 다른 장점은 그것은 부분적으로 종양 세포 마이그레이션 vivo에서 유사한입니다. 유사 하 게 종양 전이 에 비보를 상처 치유 분석 실험에서 셀 마이그레이션 상피 시트의 집단 이주와 분리 된 단일 셀의 마이그레이션을 보여줍니다.
그러나, 셀 마이그레이션 동적, 알려져 있다 그리고 실시간으로 세포의 움직임을 문서화 하는 필요 있다. 예를 들어, 기존의 상처 치유 분석 결과 단일 셀 움직임을 분석 하는 연구원을 허용 하지 않습니다. 다른 한편으로, 상처 치유 분석 실험에 대 한 배양 세포 들은 세포 증식을 억제 하는 혈 청을 굶 어입니다. 이것은 세포 증식으로 인해 간격 폐쇄의 가능성을 배제 하기 위해 이루어집니다. 그럼에도 불구 하 고, 있을 것입니다 아직도 일부 확산 및 세포 죽음, 및 단계 실험은 그들을 구별 수 없습니다 전후를 찍은 이미지.
라이브 세포 이미징 기술을 기존의 상처 치유 분석의 이러한 제한을 해결합니다. 라이브 영상 현미경을 사용 하 여 CO2 배양 기 및 적절 한 온도 제어와 결합 하 여, 연구원은 간격 크기를 측정할 수 있으며 세포 적극적으로 마이그레이션의 움직임을 추적 하는 동안 시간이 지남에 폐쇄의 그것의 비율의 끝에는 침략 앞에. 따라서, 라이브 셀 이미징 셀 마이그레이션 모니터링 구현만 셀 이동의 더 나은 시각화를 제공 하지 않습니다 하지만 또한 셀 마이그레이션 및 세포 증식, 제공 하는 더 구별 가능성에 대 한 수 세포 이동의 신뢰할 수 있는 분석.
이 연구에서는 MCF10A 유 방 상피 세포 상처 치유 분석 결과 및 라이브 셀 이미징 셀 마이그레이션에 TIP60의 역할을 연구 하기의 조합을 설명 하기 위해 사용 되었다. TIP60의 소모 증가 마이그레이션 능력 MCF10A 세포에서 발생합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MCF10A cell</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-10317TM</td>
			<td style="width:257px;">Breast epithelial cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM/F12 media (1:1)</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Epithelial growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:211px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cholera Toxin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C-8052</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-0888</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Insulin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I-1882</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">House serum</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Trypsin</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>For MCF10A detach from plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:211px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">267110</td>
			<td>For counting cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Opti-MEM reduced serum media</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-070</td>
			<td>For siRNA mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">56532</td>
			<td>Transfect reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15596-026</td>
			<td>For mRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:211px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-8891</td>
			<td>For cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:211px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">172-5125</td>
			<td>For real time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">7500 Fast Real Time PCR system</td>
			<td style="width:211px;">Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Real time qPCR mechine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">10-cm dish</td>
			<td style="width:211px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">664160</td>
			<td>For Knockdown experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">24-well plate</td>
			<td style="width:211px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">662160</td>
			<td>For wound healing assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siControl siRNA</td>
			<td style="width:211px;">Self designed</td>
			<td style="width:119px;">Self designed</td>
			<td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siTIP60 siRNA</td>
			<td style="width:211px;">Self designed</td>
			<td style="width:119px;">Self designed</td>
			<td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Live cell observer</td>
			<td style="width:211px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of breast epithelial cell migration after the transient depletion of tip60

상처 치유 분석 결과 효율적인 셀 마이그레이션 시험관을 공부 하는 가장 경제적인 방법 중 하나. 전통적으로, 이미지는 시작과 단계 대조 현미경을 사용 하 여 실험의 끝에 고 셀의 마이그레이션 능력 상처의 폐쇄에 의해 평가 됩니다. 그러나, 셀 이동은 동적 현상, 그리고 종래의 방법 단일 셀 이동 추적에 대 한 허용 하지 않습니다. 현재 상처 치유 분석 실험에 개선 하기 위해, 우리는 셀 마이그레이션 실시간으로 모니터링 하 라이브 세포 이미징 기술을 사용 합니다. 이 메서드는 셀 추적 시스템을 기반으로 셀 마이그레이션 속도 확인할 수 있습니다 하 고 셀 마이그레이션 및 세포 증식 사이 명확한 구별을 제공 합니다. 여기, 우리 TIP60의 존재에 의해 영향을 하는 유 방 상피 세포의 다른 마이그레이션 능력을 연구 분석 상처 치유에 라이브 셀 이미징의 사용을 보여 줍니다. 세포 운동 성 높은 동적으로, 우리의 메서드는 상처 치유의 상처 폐쇄 상처 치유 분석 실험에 사용 되는 전통적인 이미징 기술을 함께 찍은 스냅샷 보다 과정에 더 많은 통찰력을 제공 합니다.

일반 스키마의 라이브 셀 이미징 기반 셀 마이그레이션 분석 결과 그림 1A 는이 프로토콜의 스키마입니다. MCF10A 셀 siControl 전형적인 상피 형태를 보여와 페. TIP60의 고갈 후 MCF10A 셀 제어 셀 (그림 1B)에 비해 더 엽 했다.
TIP60 때 려 눕 힘 효율성의 시험 <st...

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Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

여기, TIP60 소진 MCF10A 유 방 상피 세포를 사용 하 여 상처 치유 분석 결과에서 셀 이동의 실시간 모니터링 하는 것이 선물이. 라이브 세포 이미징 기술 우리의 프로토콜의 구현 분석 하 고 실시간으로 단일 셀 운동 시간을 시각화 수 있습니다.

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.8K 조회수.  National University of Singapore. 여기, TIP60 소진 MCF10A 유 방 상피 세포를 사용 하 여 상처 치유 분석 결과에서 셀 이동의 실시간 모니터링 하는 것이 선물이. 라이브 세포 이미징 기술 우리의 프로토콜의 구현 분석 하 고 실시간으로 단일 셀 운동 시간을 시각화 수 있습니다.

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Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

연구

암 연구학

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

라이브 영상은 탁 내성 유방암의 미세 소관 동적 불안정성을 연구하는

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move within tissues in a tightly orchestrated manner. During tumor development, this equilibrium is disturbed, and tumor cells leave the epithelium of origin to invade the local microenvironment, to travel to distant sites, and to ultimately form metastatic tumors at distant sites. The dot assay is a simple, two-dimensional unconstrained migration assay, to assess the net movement of cell sheets into a cell-free area, and to analyze parameters of cell migration using time-lapse imaging. Here, the dot assay is demonstrated using a human invasive, lung colony forming breast cancer cell line, MCF10CA1a, to analyze the cells' migratory response to epidermal growth factor (EGF), which is known to increase malignant potential of breast cancer cells and to alter the migratory phenotype of cells.

Cell migration is essential for development, tissue maintenance and repair, and tumorigenesis, and is regulated by growth factors, chemokines, and cytokines. This protocol describes the dot assay, a two-dimensional, unconstrained migration assay to assess the migratory phenotype of attached, cohesive cell sheets in response to microenvironmental cues.

셀 시트의 마이그레이션 분석 하 점 분석 결과 사용 하 여

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon named apoptosis reversal leads to increased tumorigenicity in various cell models under different stimuli. Previous studies have been focused on tracking this process in vitro and in vivo; however, the isolation of real reversed cells has yet to be achieved, which limits our understanding on the consequences of apoptosis reversal. Here, we take advantage of a Caspase-3/7 Green Detection dye to label cells with activated caspases after apoptotic induction. Cells with positive signals are further sorted out by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for recovery. Morphological examination under confocal microscopy helps confirm the apoptotic status before FACS. An increase in tumorigenicity can often be attributed to the elevation in the percentage of cancer stem cell (CSC)-like cells. Also, given the heterogeneity of breast cancer, identifying the origin of these CSC-like cells would be critical to cancer treatment. Thus, we prepare breast non-stem cancer cells before triggering apoptosis, isolating caspase-activated cells and performing the apoptosis reversal procedure. Flow cytometry analysis reveals that breast CSC-like cells re-appear in the reversed group, indicating breast CSC-like cells are transited from breast non-stem cancer cells during apoptosis reversal. In summary, this protocol includes the isolation of apoptotic breast cancer cells and detection of changes in CSC percentage in reversed cells by flow cytometry.

Here, we present a protocol to isolate apoptotic breast cancer cells by fluorescence-activated cell sorting and further detect the transition of breast non-stem cancer cells to breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal by flow cytometry.

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

유기체 배양을 사용하여 마우스 전립선 상피 세포의 분화 능력 평가

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary epithelium using transplantation techniques takes advantage of the hormonal environment provided by the adolescent rodent host. These studies are ideally suited to explore the impact of various biological manipulations on mammary gland development and dissect many aspects of mammary gland biology. A common, but limiting, feature is that transplanted epithelial cells are strongly influenced by the surrounding stroma and outcompeted by endogenous epithelium; to utilize native mammary tissue, the abdominal-inguinal white fat pad must be cleared to remove host mammary epithelium prior to the transplantation. A major obstacle when using the rat model organism is that clearing the developing mammary tree in post-weaned rats is not efficient. When transplanted into gland-free fat pads, donor epithelial cells can repopulate the cleared host fat pad and form a functional mammary gland. The interscapular fat pad is an alternative location for these grafts. A major advantage is that it lacks ductal structures yet provides the normal stroma that is necessary to promote epithelial outgrowth and is easily accessible in the rat. Another major advantage of this technique is that it is minimally invasive, because it eliminates the need to cauterize and remove the growing endogenous mammary tree. Additionally, the interscapular fat pad contains a medial blood vessel that can be used to separate sites for grafting. Because the endogenous glands remain intact, this technique can also be used for studies comparing the endogenous mammary gland to the transplanted gland. This paper describes the method of mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad of rats.

This article describes a transplantation method to graft donor rat mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of recipient animals. This method can be used to examine host and/or donor effects on mammary epithelium development and eliminates the need for pre-clearing, thereby extending the usefulness of this technique.

쥐 유방 상피 세포 이식에 갑피 흰 지방 패드

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...