저자는 생물막 성장 프로토콜과 존 바티스타 (Fluxion, 샌프란시스코, CA) Bioflux 시스템에 관한 기술적 인 문제에 관한 조언을 수립하는 데 도움을 윌리엄 낸스 (미시간 대학) 감사합니다. 창업 자금 AHR에 (AHR에 R21DE018820 NIH)와 미시간 대학이 작품은 국립 보건원에 의해 지원되었다

여기에 설명 된 타액 수집 프로토콜은 인체 실험에​​ 대한 미시간 심사위원회 (Institutional Review Board)의 대학에 의해 검토되었다. 참고 :이 유형의 인간 대상 연구에 대한 기관 평가와 관련하여, 사전 준비 및 권한이 호스트 기관에서 얻고해야합니다. 특히, 기관에 따라 IRB 또는 윤리 승인은 지원자의 타액 수집을 진행하기 전에 모색하고 승인해야 할 수 있습니다. 응용 프로그램을 준비에 도움으로 유용한 NIH 알고리즘 / 차트는 여기에서 찾을 수 있습니다 : <a href="http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf">http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf</a> 환경 게르만 성장 매체로 사용하기 위해 풀링 침 1. 준비 <ol><li> 타액 기부&gt; 5 개인을 모집. 더 individu을 보장하지, 어떤 식별 정보를 복용하지 마십시오그들은 병, 또는 최근 3 개월 동안 경구 항생제를 촬영 한, 또는 음식물이나 액체를 소비 한 경우 루게릭 병은 기부 전에 이전 2 시간에 물을 제외하고, 침을 기부합니다. </li><li> 50 ml의 플라스틱 튜브에 타액을 수집합니다. 얼음에 유지 플라스틱 비이커에 채취 타액 풀. 타액의 폴리머 내부 유리 표면에 부착되므로 유리를 사용하지 마십시오. </li><li> 100 배 재고에서 2.5 mm의 최종 농도 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가합니다. (주식은 단일 사용 분량 씩 냉동 -20 ° C). 얼음에 플라스틱 비커에서 10 분 동안 교반한다. </li><li> 입자상 물질을 제거하기 위해 원심 분리를 17,500 X g에서 30 분 동안 풀링 된 타액. </li><li> 사분에게 집중 타액을주고 dH보다 2 O 3 권으로 침을 희석. </li><li> 필터 소독 0.22 μm의 폴리 에테르 설폰 (PES), 저 단백 결합 필터를 이용하여 침을. 고 표면적 필터를 사용 또는 수 개의 작은 영역 필터를 사용한다. 에 침을 유지얼음에 플라스틱 용기를 필터링한다. </li><li> 풀링 된 타액에서 동결 -80 &#160; 50 ml의 플라스틱 튜브에 ° C 박테리아 성장을 필요할 때까지. 각각의 플라스틱 튜브는 하나의 사용할 수 있으며 각각의 미세 유체 아니라 1.2 ml의 최대 (1.2 ml의 X 24 우물 = 28.8 ml)에 보유하고 침 동결하는 동안 확장으로 공간이 각각의 튜브에 필요로 더 이상 35 ml의 포함되어야합니다. </li><li> 사용을 위해, 실온에서 해동 풀링 타액. 일단 해동, (어떤 침전물을 제거하기 위해 0.22 μm의 폴리 에테르 설폰, 낮은 단백질 결합 필터) 한 번 더 필터 소독. </li></ol> 접종으로 사용하기 위해 풀링 타액 2. 준비 <ol><li> 타액 기부&gt; 5 개인을 모집. 기부 전에 이전 2 시간에 물을 제외하고는 최근 3 개월 동안 경구 용 항생제를 촬영 한, 또는 음식물이나 액체를 소비 한, 어떤 식별 정보를 가지고 그들이 아픈 경우에는 개인이 침을 기부하지 않습니다 보장하지 않습니다. SA를 수집30 분 이상 mples. </li><li> 실온에서 50 ml의 플라스틱 튜브의 타액을 수집하고, 실온에서 플라스틱 비이커에 채취 타액 수영장. </li><li> 25 % 글리세롤의 최종 비율 75 %의 세포를 함유 타액 [CCS]와 사진을 수득 멸균 된 일반적인 시약 특급 글리세롤 풀링 타액 희석. </li><li> 필요할 때까지 3 ㎖ 회용 분량 씩 -80 ° C에서 타액 동결. </li><li> 마이크로 유체 시스템을 접종하기 위해 필요한 경우, 분취 량 이하, 프로토콜의 단계 3에 기재된 마이크로 유체 시스템에 피펫되기 전에 실온에서 해동하고 5 초 동안 vortexer를 부드럽게 교반한다. </li></ol> 구강 다중 종의 바이오 필름 3. 성장 <ol><li> CFS 전처리 <ol><li> 먼저 코트 CFS와 Bioflux 미세 유체 채널. 물론 각각의 콘센트에 CFS의 100 μl를 추가합니다. Bioflux 제어 소프트웨어를 사용하면, 채널에서 &quot;수동&quot;을 설정 흐름을 선택 &quot;B1-B24&quot;그쪽으로t가 사용되어야한다. </li><li> 다음에, 1.0 다인 / cm² 이상으로 설정하고 전단 채널에 걸쳐 균일 한 분포의 CFS를 위해 실온에서 2 분 동안 흐름을 시작한다. CFS 균등하게 모든 채널을 통해 유입 된 것을 확인하기 위해 각 입구 채널에서 유체가 있는지 확인하십시오. </li><li> 실온에서 20 분 동안 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 출구 웰에 남아 CFS / 전처리 용액을 제거하고 웰에 유입 옮긴다. 100 μL이 총 부피 잘 콘센트에서 접종에 적용되는 압력에 균형을 될 것입니다. </li></ol></li><li> 접종 <ol><li> 물론 각각의 콘센트에, CCS 접종의 100 μl를 추가합니다. 정확히 6 초 동안 1.0 다인 / cm² 이상에서 유입 우물 (즉, 역방향)에 미세 유체 열 접시에 플레이트 (온도 37 ° C에서 설정), 제어 소프트웨어 내에서 수동을 선택하고, 출구 우물에서 설정 흐름을 놓습니다. </li><li> 40 분 수 있도록 37 ° C에서 미세 유체 플레이트를 품어초기 부착과 접종에 박테리아의 성장을위한. </li></ol></li><li> 하룻밤 성장 <ol><li> 접종 채널이 사용중인 경우, 출구 각 웰로부터 폐기물 균액 대기음. (기존 CFS의 상부에 행해질 수있다) 입구 각 웰에 CFS 1 ml의 총 부피까지 추가한다. </li><li> 37 ° C에서 미세 유체 플레이트를 품어, 수동 선택하고 20 시간 동안 0.2 다인 / cm² 이상에서 실행할 프로그램을 설정합니다. </li></ol></li><li> 얼룩 예비 세탁 <ol><li> 입구와 출구에서의 유체 대기음 웰 모두와 입구 각 웰에 100 ㎕ PBS (PH 7.4)을 추가한다. 0.2 다인 / cm² 이상에서 20 분 동안 흐름. </li></ol></li><li> 얼룩 혼합물 추가 <ol><li> 세포 생존 염색은 염색 할 각 채널에 대해 얼룩 혼합물 100 ㎕를 확인합니다. 특히, SYTO 9의 3 μL 및 DEAD / 라이브와 같은 상업 세포 생존 염색 키트를 사용하여 PBS 1 ㎖ 당 요오드화 프로피 듐의 3 μl를 추가합니다. 이 생성10 μM의 SYTO 9 및 60 μM의 요오드화 프로피 듐을 포함하는 염색 액. </li><li> 입구 우물에 남아있는 PBS를 대기음 각 웰 입구에 세포 생존 능력 얼룩 혼합물 100 ㎕를 추가합니다. 실온에서 45 분 동안 입구로부터 출구로 용액을 0.2 다인 / cm 2의 흐름 및 실행하도록 설정. </li></ol></li><li> 후 염색 세척 <ol><li> 입구 각 웰에 남아있는 얼룩을 대기음 아니라 각 입구에 PBS 100 ㎕를 추가합니다. 초과 얼룩을 제거하기 위해 실온에서 20 분 동안 콘센트에 입구에서 PBS 용액을 0.2 다인 / cm² 이상에서 흘러 실행 설정합니다. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 모음, 3D 렌더링 및 이미지 분석 <ol><li> 미세 유체 시스템에서 바이오 필름 이미지 데이터를 수집 반전 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)를 사용합니다. CLSM은 150g에 도달 할 수 Bioflux 판의 무게를 견딜 수 있는지 확인합니다. 참고 : 한푼도 주어미세 유체 채널, 생물막 구조를 식별 감도에 대한 필요성 및 요구 nsions은 다양한 강도의 형광 신호를 검출 40X 1.25 NA 대물 렌즈 또는 이와 유사한 광학 품질, 배율 및 개구 수를 가지는 하나 CLSM 맞게. </li><li> 이득 배출 캡처 게이트 표준화 및 오프셋 측정은 일정하게 유지된다. 이 사진 표백을 초래할 수 있으므로 레이저 파워가 25 %를 초과하지 않도록하십시오. </li><li> 내가 F의 ILE 유형 OME에 (LIF) (O 펜 M의 icroscopy E의 nvironment) 파일 형식 마법사 L의 eica에서 CLSM 파일을 변환합니다. 이 소프트웨어 프로그램 사이의 액세스 및 호환성을 더 쉽게 할 수 있습니다. 이러한 유형의 파일을 변환하는 등 IMARIS, 상업적으로 사용할 수있는 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol> 이미지 / 도표를위한 3D 렌더링 <ol start="4"><li> 일단 OME 형식으로 변환 그러한 이미지를 렌더링 IMARIS 같은 상용 소프트웨어를 사용3D로. &quot;Easy3D&quot;및 &quot;능가&quot;옵션의 조합을 사용하여이를 수행한다. 참고 : 배경 신호 및 임계 값에주의해야한다. IMARIS의 히스토그램으로 수집 범위를 획득하기 위해 사용될 수 있고, 이미지가 분석되고,이 사이에서 일정하게 유지되어야한다. </li><li> &quot;스냅 샷&quot;기능을 사용하여 이미지를 저장하고 파일 형식을 저장하기 전에 이미지 해상도에 신중하게 고려해야합니다. </li><li> 이러한 코렐 드로우 또는 어도비 일러스트 레이터와 같은 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 그림으로 이미지를 조립합니다. </li></ol> 그래프 및 표에 대한 3D 이미지 분석 <ol start="7"><li> 이미지 분석을위한 ImageJ에 23 COMSTAT / COMSTAT2 38 자유롭게 사용할 수 있습니다. 각각 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 및 http://comstat.dk/에서 패키지를 다운로드합니다. 가장 최근의 자바 업데이트가 설치되어 있습니다. 참고 : 소프트웨어 플랫폼 자바는 프리 오을 설치해야합니다이미지 분석 소프트웨어를 사용하려면 r. <ol><li> &quot;분할 채널&quot;로 &quot;hyperstack&quot;모드와보기 각 생물막 이미지의 OME 파일을 가져올 COMSTAT2 플러그인과 ImageJ에 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 개별적으로 두 채널 ImageJ에의 &quot;히스토그램&quot;기능을 사용하여 (레드 / 프로피 듐 요오드화 / 죽은 존재 채널 0, 녹색 / SYTO-9 / 라이브 인 채널 1)를 분석 할 수 있습니다. 이 함수는 신호 (배경)와 0 인 픽셀 (255) 인 상태 ( &quot;가치&quot;로 도시) 0에서 255까지 각각의 컬러 강도 ( &quot;카운트&quot;로 도시) 8 비트 OME 파일의 픽셀들의 총 수를 나열 완전한 신호 포화와 픽셀. </li><li> 스프레드 시트 프로그램에 데이터를 반출하고 대응하는 신호 강도에 의해 각 화소에 가중을 모든 신호 값을 표준화. 이것은 그 신호 강도의 수치 8 비트 값 (255)에 의해 소정의 신호 강도에 총 개수를 승산함으로써 수행된다. </li><li> 캡처 된 각각의 바이오 필름 이미지의 두 채널에 대한 모든 가중치, 0-255 합계. 어느 채널로부터의 총 신호 퍼센트를 결정하기 위해 두 채널 가중치의 합을 가라. 빨간색과 녹색 신호 퍼센트 (%가 &quot;DEAD&quot;와 퍼센트 각각의 치료를위한 &quot;라이브&quot;IE)의 상대적 비율 또는 백분율을 결정하기 위해이 작업을 수행합니다. </li><li> 동일하지 않은 분산에 대한 수정이 꼬리 학생의 T-test를 이용하여 예를 들어, 통계 분석을 수행합니다. P &lt;0.05의 값은 의미있는 것으로 간주되고 P &lt;0.01의 그 값은 매우 중요한 것으로 간주됩니다. </li></ol></li></ol> 문화 독립적 인 분석 5. 수확 생물막 세포 <ol start="1"><li> 입구와 출구 우물에서 모든 시간에 사용되지 않은 침을 제거합니다. 1 ml의 멸균 증류수로 3 회 우물을 씻으십시오. </li><li> 소프트웨어 제어 인터페이스를 사용하여, 흡입 웰 멸균 증류수 100 ㎕를 추가하고, 합격&gt; 8.0 다인 / cm 2의 채널을 통해 앞으로 멸균 증류수 (800 초, 전단 속도&gt; 745 μL / 시간 흐름 -1)에서 5 분 이상. 적어도 5 분 동안 반대 방향으로 반복하고 순방향를 반복하고 세정 공정 과정을 역방향. </li><li> 철저한 바이오 필름 ​​제거 (그림 2)에 대한 (세포를 염색하는 경우 / 표시) 빛에 의해 또는 표면 형광 현미경으로 확인합니다. 문화 독립적 인 분석을 위해 -80 ° C에서 100 μL 세포 현탁액 및 저장소를 수집합니다. 커뮤니티 조성물의 비용 효과 분석 등 낸스에 기재된 방법을 이용하여 세균 태그 인코딩 FLX 앰플 리콘 pyrosequencing 기법 (bTEFAP)을 사용을 통해 달성 될 수있다. (20) </li></ol>

<ol>
	<li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).</li><li>Wimpenny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metropolis.">Microbial metropolis.</a> Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).</li><li>Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+ruin:+the+formation+of+disease-associated+oral+biofilms.">The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms.</a> Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Cate, J. M., Zaura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+numerous+microbial+species+in+oral+biofilms:+how+could+antibacterial+therapy+be+effective.">The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective.</a> Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).</li><li>Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+and+collective+recalcitrance+of+microbial+biofilm+communities.">The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities.</a> Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , (2011).</li><li>Smith, H., Smith, H., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. , 1-29 (1964).</li><li>Haffajee, A. D., Socransky, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+microbial+aspects+of+periodontal+biofilm+communities,+development+and+treatment.">Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment.</a> Periodontology. 42, 7-12 (2000).</li><li>McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+In+vitro+biofilm+models:+an+overview.">Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview.</a> Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).</li><li>Baehni, P. C., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-plaque+agents+in+the+prevention+of+biofilm-associated+oral+diseases.">Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases.</a> Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).</li><li>Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+oral+microbial+communities+of+wild-type+and+toll-like+receptor+2-deficient+mice+using+a+454+GS+FLX+Titanium+pyrosequencer.">The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer.</a> BMC microbiology. 10, 101 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel.">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).</li><li>Auschill, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+two+antimicrobial+agents+on+early+in+situ+biofilm+formation.">Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation.</a> Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).</li><li>Coenye, T., Nelis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+model+systems+to+study+microbial+biofilm+formation.">In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation.</a> Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+biofilms+in+antimicrobial+resistance.">Role of biofilms in antimicrobial resistance.</a> ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).</li><li>Wimpenny, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+validity+of+models.">The validity of models.</a> Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).</li><li>Umland, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-validated+essential+genes+identified+in+Acinetobacter+baumannii+by+using+human+ascites+overlap+poorly+with+essential+genes+detected+on+laboratory+media.">In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media.</a> 3 (4), (2012).</li><li>Nance, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+dental+plaque+biofilm+system+to+visualize+and+quantify+the+effect+of+antimicrobials.">A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).</li><li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li><li>Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+approaches+for+multidimensional+biological+image+data.">Visualization approaches for multidimensional biological image data.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+an+alcohol-free+CPC-containing+mouthwash+against+oral+multispecies+biofilms.">Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms.</a> The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology.">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).</li><li>Kim, J., Park, H. D., Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+to+bacterial+biofilm+formation.">Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation.</a> Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).</li><li>Mosier, A. P., Cady, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+bacterial+surface+interactions+using+microfluidic+systems.">Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems.</a> Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).</li><li>Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multispecies+oral+bacterial+community+in+a+saliva-conditioned+flow+cell.">Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).</li><li>Cuadra-Saenz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer-2+influences+interactions+amongst+pioneer+colonizing+streptococci+in+oral+biofilms.">Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms.</a> Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).</li><li>Rickard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer+2:+a+concentration-dependent+signal+for+mutualistic+bacterial+biofilm+growth).">Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth).</a> Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).</li><li>Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+penetration+and+efficacy+in+an+in+vitro+oral+biofilm+model.">Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).</li><li>Diggle, M. A., Clarke, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+sequence+typing+at+the+speed+of+light.">Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light.</a> Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).</li><li>Hiyari, S., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+diagnostics:+molecular+analysis+of+oral+biofilms.">Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms.</a> Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).</li><li>Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+biofilms:+emerging+concepts+in+microbial+ecology.">Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology.</a> Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+in+the+age+of+genomics+and+metagenomics:+concepts,+tools,+and+recent+advances.">Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances.</a> Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).</li><li>Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+bacterial+infections+through+culture-independent+approaches.">Studying bacterial infections through culture-independent approaches.</a> Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).</li><li>Socransky, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+of+the+gingival+crevice+area+of+man.+I.+Total+microscopic+and+viable+counts+and+counts+of+specific+organisms.">The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms.</a> Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).</li><li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews).">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li><li>Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+spatial+distribution+of+viable+and+nonviable+bacteria+in+hydrated+microcosm+dental+plaques+by+viability+profiling.">Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling.</a> Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).</li><li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing.">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li><li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas.">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li></ol>

A. H. R. and N.S.J. have received research awards from a variety of sources such as the National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) and the Society for Applied Microbiology to fund research studies in their lab over the past five years. All other authors: none to declare.

이 방법 용지 설정하는 데 필요한 기본 단계를 하이라이트 및 풀링 인간 타액에서 유래 필터 멸균 25 %의 풀링 된 인간 타액에서 재배 경구 다중 종 생물막의 개발을 허용하는 방식으로 마이크로 유체 시스템을 실행. 생물막을 특성화 방법들이 주어진다 있지만 이러한 설명 방식이, 예를 들어, 얼룩 또는 라벨을 도입 할 수있다, 등의 수정 및 추가 기술이라는 것을 기억해야한다. 예를 들어 말하자?...

<html> 바이오 필름은 구조적으로 표면 일에 집계 박테리아의 복잡한 사회입니다. 이 사회는 일반적으로 바이오 필름이 내 서로 상호 작용하는 수많은 종을 포함하고있다. 구강 바이오 필름, 시각적으로 가장 눈에 띄는되는 치석은, 인간의 지속적인 문제 및 분류 학적으로 다양한 멀티 종 커뮤니티 3 세대에서의 통제되지 않은 개발 결과입니다. 이러한 다양한 지역 사회의 구성 요소 박테리아는 자신의 자유 부동 (플랑크톤)의 대응 4-6 이상의 항생제에 대한 저항력 1,000 배까지 될 수 있습니다. 미국에서 연간 치과 의사 사무실에 5 억 방문하고, 약 108,000,000,000달러는 치료 또는 치주을 방지하기 : 치아 우식증과 치주 질환을 일으킬 수있는 이러한 구강 생물막 지역 사회를 치료하지 않을 경우, 상당한 공중 보건 부담을 초래하고있다 질환과 충치 7. 어려움을 극복하기위한 그들의 사기가 지속적으로 실험실 문화 작업의 매력적인 용이성. &quot;(8) - 스미스에 의해 약화되어 있기 때문에 내용은&quot;&gt; &quot;많은 미생물이 자연 상태에서 미생물 동작을 공부 옹호하는 동안, 그들 중 몇 그렇게.입니다. 현재, 구강 생물막 연구가 생체 내 및 생체 외 접근의 다양한 사용하여 수행되는, 자신의 장점과 각각 9,10 불리. 시험관이 자주 설정 비교적 용이하지만 임상 부족할 수있다 모델 생물막 시스템을 사용하는 접근 / 실제 관련성 (10, 11). 생체 내 접근 방식은 일반적으로 인간의 구강 환경의 특정 측면을 재현, 그러나 다시 제한으로 고통 때문에 동물 사이의 해부학, 생리학, 미생물학 및 면역학의 차이로 12 인간이 할 수있다 동물 모델 시스템에 의존, (13). 그것은 구강 생물막 주목해야한다또한 인간 자원 봉사자의 입을 내 스텐트에서 개최 에나멜 표면에 개발,하지만이 방식은 현재 상대적으로 비용이 많이 들고 노동 집약적 인 14, 15입니다 수 있습니다. 궁극적으로, 새로운 제 또는 구강 건강을 개선하는 기술은 임상 시험 조건 (11)에서 인간 시험한다. 현재, 새로운 구강 건강 관리 에이전트를 식별하고 평가하는 자주 사용하는 수법은 첫 번째 실험 연구는 잠재적 인 효과를 식별 한 다음 동물 연구 및 기술 (9)의 성공을 평가하기 위해 임상 사용 &quot;현장 시험&quot;을 수행하기 위해 수행하는 것입니다, 16, 17. 불행하게도, 실험실 연구는 큰 공간을 차지 모델 시스템에 의존하는 경향이 사용하기 기술적으로 도전하고, 자주 10,18 의미 잠재적 인 실제를 유도하기 위해 몇 종 하나 또는 최대 커뮤니티를 단순화가 들어 있습니다. 치석 바이오 필름이 COMPL에서 여러 종의 형태를 포함하는 점을 감안EX 인공 미디어 실제 시나리오 10,19에서와 유사한 방식으로 동작 공동체를 생성 할 가능성이 하나를 포함 생물막 또는 몇 종의 개발, 환경 타액 흐르는. 시간, 비용, 트레이닝 요구 사항, 실제 환경에 비해 실험실 모델 생물막 시스템의 빈약 대표성을 해결하기 위해, 우리는 최근 높은 처리량 및 환경 게르만 생물막 시스템 (20) (도 1)를 개발 하였다. 접종 등의 중간 처리되지 않은 풀링 인간의 박테리아 세포 함유 타액 (CCS) 등의 무 세포 풀링 된 인간의 타액 (CFS)의 사용으로 시스템의 혜택을 제공합니다. 유일하게, 시스템은 미세 유체 기술, 공 초점 레이저 주사 현미경, 및 세균 배양 독립적 다양성 분석 기술을 결합한다. 따라서, 모델 시스템은 접종 37 종 멀티 생물막을 성장 환경으로 게르만 (사용 타액이다 필터 살균이 흐르는 C를 °타액)과 구강 바이오 필름은 초기 치은 연상 치석 (20)에서 발견의 풍부함 대표의 연쇄상 구균, 나이 세리아, Veillonella 및 포피 종을 포함하여 종 ()가 포함되어 있습니다. 이 작품은 새로 개발 된 모델 시스템의 사용을 설명하는 고려할 때 특히주의가 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 미세 유체의 융합, 문화 독립적 인 다양성 분석 기술에 부여해야합니다. 우리의 연구 그룹에 의해 이러한 기술의 조합은 의도적이고뿐만 아니라 새로 개발 된 모델 시스템에 높은 처리량 기능을 추가 할뿐만 아니라 질문에 쉽게 다른 시스템과 이전에 해결 될 수 없다는 것을 질문 할 수 있습니다. 이 바이오 필름의 3 차원 분석을 가능으로 첫째, CLSM은 기존의 현미경을 통해 뚜렷한 장점이 있습니다. 바이오 필름은 이기종 재치이기 때문에 종종 진가를 인정받지 못한,이 매우 중요하다H 종 조성물 및 공간적 위치에 대해서뿐만 아니라 생리 학적 조건은 6,21 바이오 필름 ​​내의 상이한 공간 위치에 부과된다. 입체 렌더링 소프트웨어 및 이미지 분석 소프트웨어, 생물막 구조, 구성 요소 사이의 공간 관계 종 및 미생물 사멸의 정도와 협동하여 22-24을 분석 할 수있다. 이러한 능력은 표준 투과광 또는 표면 형광 현미경을 사용하여 불가능합니다. 주의 깊게 통제 된 조건 (유량, 온도, pH 등)에서 바이오 필름의 연구를 가능하게하고 만 액체 25-27의 작은 볼륨을 필요로 다음, 미세 유체 미생물학 분야에 특별한 관심을 얻고있다. 그 달성으로 비교 점으로, 비슷한 유량 및 전단에 20 시간 동안 흐름 셀 모델 시스템 (틀림없이 많은 구강 생물막 연구를위한 주력 모델로 간주되는 시스템) 내에서 인간의 타액에서 구강 생물막 성장미세 유체 소자 28-31 800 μL 대조적으로 마이크로 유체 시스템에서, 적어도 200 mL로 요구한다. 따라서, 미세 유체 모델 생물막 시스템은 정의 된 조건에서 수량 제한 물질의 연구를 할 수 있습니다. 마지막 pyrosequencing 기법 기술은 사회 분석을 수행하는 물질의 소량 만이 필요하도록 지난 10 년 최적화에도 희소 생물막 종의 ID를 획득하기 위해 시퀀스의 깊이를 제어하도록 충분히 다재다능되었다. 세균성 태그 인코딩 FLX 앰플 리콘 pyrosequencing 기법 (bTEFAP) 등이 기술의 사용은, 생물막의 생태에 관한 관련 질문에 대한 허용했다가 (32, 33)를 해결해야합니다. 이러한 질문은 pyrosequencing 기법 이유로 인해 시간과 플라스미드 라이브러리 및 데이터 (33, 34)를 도출하는 데 필요한 복잡한 기술 및 분석 단계를 작성하는 데 필요한 비용을 사용할 수없는 과거에 어려움을 고취. 문화 독립적 인 AP와 물론 큰 장점이러한 pyrosequencing 기법으로 proaches는, 기존의 실험실 미디어 (즉, 실행 가능한하지만 비 경작 종) 내에서 독립적으로 성장 할 수없는 종의 박테리아가 성장 식별 모델 시스템 내에서 그리고 지역 사회에서의 상대적인 풍부, 36 (35)를 정량화 할 수 있다는 것입니다 . 이르면 1963과 같은 관점을 추가하려면, 후반 지그문트 Socransky은 인간의 구강 잇몸 틈새에서 분리 된 물질에서 박테리아의 약 50 %가 실험실 성장 조건 (37)를 사용하여 배양 할 수 없다고 추정했다. 이 방법 용지의 목적은 시판중인 마이크로 유체 (Bioflux) 시스템에서의 경구 다중 종 생물막을 개발하는 방법을 설명하는 것이다 : (I) 조건 인간 구강 대표 및 (II) 종의 조성 및 풍부 그 치은 연상 치석 비교입니다. 또한, 모두 프리웨어 및 상용 소프트웨어를 사용하여, 우리는 어떻게 기본 생물막을 강조아키텍처 조치가 생물막 바이오 매스, 조도 및 생존 능력을 정량화하는 방법에 중점을두고, CLSM 데이터로부터 유도 될 수있다 (라이브 / 죽은 얼룩에 따라). 마지막으로, bTEFAP에 의해 다양성 분석을위한 바이오 필름 재료를 수확하는 데 필요한 단계가 설명되어 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="951">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:525px;">SUPPLIES AND EQUIPMENT</td>
			<td style="width:224px;">AVAILABLE FROM COMPANY</td>
			<td style="width:203px;">CATALOG NUMBER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorval ultracentrifuge&#160; (SS-34 compatible)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Unit-dependent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific SS-34 Rotor&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>28-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific Inc</td>
			<td>23-290-065</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>73520-986&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>NC0542269</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioFlux microfluidic system</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>Bioflux 200 system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux 24-channel plate</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>910-0004</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>10010023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SPE or eqivalent system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrosequencing facilities</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Ultra Low Temperature Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips (20, 200, and 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux dedicated software</td>
			<td>Bioflux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica SPE</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COMSTAT/COMSTAT 2</td>
			<td colspan="2">Freeware (http://www.comstat.dk/)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

일반적으로 생체 내에서 검출 경구 생물막 다수 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을 촉진 시험 관내 시스템에서의 약간 높은 처리량이있다. 또한, 인공 대신 미디어, 영양원으로서 천연의 사람의 타액을 사용하는 시스템은, 생체 모방 커뮤니티 셀룰러 및 생물막 별 속성의 표현을 지원하기 위해 특히 바람직하다. 우리는 인간 구강 유사한 조건 하에서, 치은 연상 치석을 위해 종 조성물에 대하여, 비교 가능한 멀티 종 경구 생물막의 개발을위한 방법을 설명한다. 특히,이 방법은 문서 시판 마이크로 유체 시스템이 멀티 - 유래의 종 경구 생물막의 개발을 용이하게하도록 적응 풀링 타액 내 성장시킬 수있는 방법을 설명한다. 더욱이, 방법은 시스템의 설명 confoca와 함께 사용될 수있다L 레이저 스캐닝 현미경 표시됩니다 건축과 생존 분석을위한 3-D 생물막 복원을 생성합니다. (연쇄상 구균, 나이 세리아, Veillonella, Gemella 및 포피 포함) 미세 유체 시스템에서 바이오 필름 ​​내에서 성장하는 미생물의 넓은 다양성을 감안할 때, 프로토콜은 또한 더 하위 문화 또는 DNA 추출 및 분석을위한 생물막 세포를 수확하는 방법에 대한 표시됩니다. 미세 유체 생물막 시스템과 현재의 최​​첨단 데이터 분석 모두의 한계는 해결 될 것입니다. 궁극적으로,이 문서가 구강 생물막 (biofilm)의 연구를 개선하고 미세 유체 플랫폼과 통합 할 수있는 추가 기술의 개발에 도움이 될 기본 기술을 제공 할 것으로 상상된다.

바이오 필름의 3D 렌더링 대표 결과는 그림 3에 표시됩니다. IMARIS 소프트웨어의 유용한 도구가 수집 된 생물막 스택의 각 슬라이스를 검사하고 입체 복원을 만들 결합하는 옵션입니다. 또한, 인공 음영 효과는 시각적 도움 입체 구조를 해석하기 위해 첨가 될 수있다. 렌더링 된 바이오 필름은 바이오 필름 또는 마이크로 식민지 구조를 탐구하?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms at JoVE.com

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

이 방법 용지의 목적은 일반적으로 인간 치은 연상 치석에서 식별 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을위한 마이크로 유체 시스템의 사용을 설명하는 것이다. 방법은 생물막 구조, 생물막 생존 및 강조 표시됩니다 문화에 의존 또는 문화 독립적 인 분석을위한 수확 바이오 필름에 대한 접근을 설명한다.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

use-high-throughput-vitro-microfluidic-system-to-develop-oral-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

13.4K 조회수.  The University of Michigan.  이 방법 용지의 목적은 일반적으로 인간 치은 연상 치석에서 식별 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을위한 마이크로 유체 시스템의 사용을 설명하는 것이다. 방법은 생물막 구조, 생물막 생존 및 강조 표시됩니다 문화에 의존 또는 문화 독립적 인 분석을위한 수확 바이오 필름에 대한 접근을 설명한다. 

비디오: Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

종양 Microenvironment를 재현을위한 마이크로 유체 장치<em&gt; 체외에서</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

연구

생체공학

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

높은 처리량 마이크로 유체 신속하고 저렴한 비용으로 프로토 타입 포장 방법

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

의 체계적인 분석<em&gt; 체외</em멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용하여&gt; 셀 롤링

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or lethality. However, the probability of a synthetic small molecule being bioactive is low; therefore, thousands of molecules must be tested in order to find those of interest. Liquid handling robotics systems are designed to handle large numbers of samples, increasing the speed with which a chemical library can be screened in addition to minimizing/standardizing error. To achieve a high-throughput forward chemical genetics screen of a library of 50,000 small molecules on Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocols using a bench-top multichannel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement. With these protocols, 3,271 small molecules were discovered that caused visible phenotypic alterations. 1,563 compounds induced short roots, 1,148 compounds altered coloration, 383 compounds caused root hair and other, non-categorized, alterations, and 177 compounds inhibited germination.

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A high throughput screen of synthetic small molecules was conducted on the model plant species, Arabidopsis thaliana. This protocol, developed for a liquid handling robot, increases the speed of forward chemical genetics screens, accelerating the discovery of novel small molecules affecting plant physiology.

높은 처리량 앞으로 화학 유전학의 화면 애기 thaliana 을 액체 처리 로봇의 사용을 최적화

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항의 높은 처리량 식별. 모종 홍수 분석을 사용하여 토마토토마토

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...