저자 감사 호세 아우 구 스토 Maulin 현미경 다중 사용자 실험실 (의 리 베이 라 오프 레 토 의학의 학교)에서 EDS와 sem의 그의 관대 한 지원에 대 한 분석 및 비디오 판에서 그의 관대 한 기술 지원에 대 한 브라 더 텍사스 마차.

이 연구는 리 베이 라 오프 레 토의 치과 학교의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 자원 봉사 참가자 서명 동의서 (2011.1.371.583 프로세스).
1. Biofilm 형성에서 제자리에
<ol><li>
참가자의 선택
	<ol>
<li>다음 포함 기준에 따라 환자 선택: 완전 한 치열과 구강 질환의 임상 표시 없이 건강 한 개인.</li>
		<li>다음 제외 기준에 따라 환자 제외: 임신, 수 유, 치과 카 리에 스, 치 주 질환 또는 지난 3 개월 동안, 흡연 자, 또는 치 주 상태에 영향을 미칠 수 있는 조직의 질환에 항생제 치료.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intraoral 장치 준비
	<ol>
<li>Alginate 인상을 통해 상 악 아치를 기록 합니다.</li>
		<li>유형 IV 돌 돌 가루 100 g을 물 19 mL을 추가 하 여 준비 합니다. 돌 상 악 아치의 모델을 만들 alginate 몰드에 붓으십시오.</li>
		<li>디자인과 테스트 표본 (티타늄과 세라믹 디스크)를 지원 하기 위해 아크릴 intraoral 장치 조작.<ol>
<li>NiCr 와이어 (0.7 m m에 직경) 교정 플라이어 # 139를 사용 하 여에서 못 벗어난 걸쇠를 조작 하 고 모델에 그들을 배치 합니다. 그들은 루프를 형성 하 위 구치 사이 클램프 위치, 각 와이어의 한쪽 끝을 구 부.<ol>
<li>치 간 시의 지역에서 루프를 적응. Occlusal에서 연락처의 포인트는 폐색과 방해를 하지 않도록 부드러운 곡률을 삽입 합니다. 아크릴에 보존에 대 한 클램프의 끝에 접어 90 °를 확인 합니다.</li>
				<li>위 두 번째 어 금 니에 클램프를 맞게 적응 자 궁 경부 3에서 와이어의 곡률 (vestibular) 90 ° 아크릴에 보존에 대 한 클램프의 끝에 배를 (원심) 치아 윤곽. 참고: intraoral 장치에 적절 한 보존/안정성 제공, 보유 clasps 위 구치 원심 부분의 치과 아치의 양쪽에 두 번째 어 금 니 사이 배치 했다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>제조업체의 지침에 따라 자체 경화 아크릴 수 지를 조작 하 고 3 m m 두꺼운 시트를 만들기 위해 플라스틱 단계 2 유리 접시 (interposed 두께 3mm 스페이서) 사이 아크릴 수 지를 누릅니다.</li>
			<li>소자의 디자인에 따라 모델의 경구개 지역에 아크릴 시트를 카 버, 중 합 전에 잉여 아크릴 수 지를 떨어져 트림.</li>
			<li>공고히 하는 매트릭스에 녹은 왁 스를 놓고 왁 스에 대 한 대기 금속 매트릭스 [10 밀리미터 직경, 2mm 두께 (78.5 m m2의 면적)]를 사용 하 여 왁 스 디스크 조작. 수동으로 아크릴 수 지, 그들의 2는 구치와 두 번째 어 금 니 옆 다른 2 사이 4 왁 스 디스크를 포함 합니다.</li>
			<li>20 분에 대 한 압축 공기의 미만 20 psi 압력 냄비에 유해 아크릴 수 지를 보자.</li>
			<li>전기 치과 실험실 핸드 피스와 커터 intraoral 장치를 완료 하 고 연마 고무 폴란드어.</li>
			<li>위에서 설명한 장비를 사용 하 여 입에 적당 한 적합을 위한 장치를 조정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
티타늄과 지 르 코니 아 표본의 준비 참고: 표본 (n = 14) 10 mm 직경에서 및 두께에서 2 m m 이며 78.5 m m2의 면적을가지고.<ol>
<li>감소 하는 abrasiveness의 수냉식된 sandpapers 표본 표면 폴란드어 (600, 1200, 2000 모래), 약 20 분. 참고:는 표본의 연마 0.2 µ m에서 표면 거칠기 표준화를 수행 했다.</li>
		<li>청소 하 고 소독 표본 및 액체 세제와 수돗물, intraoral 장치 다음 이소프로필 알코올 초음파 목욕을 사용 하는 15 분 흡수 성 종이 타 올 그들을 건조.</li>
		<li>비-독성 핫 멜 트 접착제 (그림 1)의 약 0.1 mL와는 표본 intraoral 구강 장치에 수정.</li>
		<li>구강에서 견본을 포함 하는 장치를 설치 합니다. 참고: 포함 하는 표본 intraoral 장치 48 h에 대 한 착용 한다. 장치 제거 하 고 환자는 먹고 구강 청소를 수행 하는 동안 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 저장 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 세균 생존 능력의 평가
참고: 샘플 크기 n = 10.
<ol><li>SYTO9의 3 µ L을 추가 하 여 염색 솔루션 준비 (녹색 형광 핵 산 염료)와 3 µ L propidium 요오드 화물 (빨간색 형광 핵 산 염색) 살 균의 1 mL의 증류수. 참고: 빛 으로부터 보호 하는 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>24-잘 접시에는 견본을 전송 하 고 모든 비 부착 한 세포를 제거 하는 PBS와 함께 그들을 씻어.</li>
	<li>Biofilm 포함 된 견본을 충당 하기 위해 형광 염료 솔루션의 적절 한 볼륨 (1 mL)을 추가 합니다. Disorganize는 biofilm를 하지 않도록 매우 신중 하 게 염료를 추가 합니다.</li>
	<li>빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 20-30 분에 대 한 견본 품 어.</li>
	<li>부드럽게 biofilm 샘플 어떤 과잉 염료를 제거 하는 멸 균 증류수로 씻는 다.</li>
	<li>유리 하단 접시에는 견본을 놓고 multiphoton 레이저 현미경 biofilm 분석에 대 한 검색을 수행 합니다. 참고: 세균성 세포 생존 능력 분석 multiphoton 현미경 시스템을 사용 하 여 실행 되었다. Propidium 요오드 화물의 형광 546/680의 여기/방출 파장 필터를 사용 하 여 검색 및 477/600 nm SYTO9에 대 한. 가져온 이미지의 크기는 5.16188 x 5.16188 m m, 각 표본 (78.5 m m2)의 전체 면적의 전체 면적의 33.94 %26.64 m m2 에 해당 했다. 이미지는 1024 x 1024 픽셀의 해상도 샘플의 가장 중앙 부분에서 만들어졌다. 빨강 채널 및 녹색 이미지는 별도로 피지 소프트웨어31를 사용 하 여 분석 되었다. 선택 도구를 사용 하 여 각 셀을 선택한 및 형광의 강도 빼서 이미지 배경 픽셀의 통합된 밀도 통해 측정 했다.</li>
</ol>3. 에너지 흩어지는 분광학 (EDS)에 의해 표본 화학 성분의 분석
참고: 샘플 크기 n = 3.
<ol><li>각 biofilm 무료 테스트 소재의 3 표본 선택 하 고 전자 빔 전압 10 kV32의 분산 에너지 분석기를 결합 하는 스캐닝 전자 현미경을 사용 하 여 각 시료의 2 가지 영역에서 화학 성분 평가.</li>
</ol>4. 전자 현미경 검사 법을 검사 하 여 세균성 Biofilm의 형태소 분석
참고: 샘플 크기 n = 1.
<ol><li>2.5%도 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼, pH 7.0-7.3, 24 h에에서 희석에 표본 immersing 하 여는 biofilm를 해결.</li>
	<li>PBS 버퍼에 샘플을 세척 (pH 7.6 =).</li>
	<li>1 시간에 1% 오스뮴 tetroxide와 biofilm 접미사</li>
	<li>PBS 버퍼에 샘플을 세척 (pH 7.6 =).</li>
	<li>탈수 biofilm 샘플 신중 하 게, 에탄올 솔루션 (50%, 70%, 90%, 95%, 및 100%)의 농도 증가 그들을 유지. 참고: 100% 농도에서 에탄올의 3 교류를 수행 합니다. 총 탈수 단계 약 2 시간 걸립니다.</li>
	<li>임계점 건조 기에 견본을 전송 하 고 이산화탄소 (CO2)와 함께 여러 대체는 표본 건조 될 때까지.</li>
	<li>장치에서 말린된 견본을 제거 하 고 스캐닝 전자 현미경 소유자에 그들을 마운트.</li>
	<li>스퍼터-코트 120에 대 한 시료의 표면에 금 20 nm 층 s.</li>
	<li>스캐닝 전자 현미경 실에서 골드 코팅 된 디스크를 삽입 합니다. 각 표본, 가변 압력 하에서 20-30 kV와 650 X 배율12의 5 가지 다른 영역에서 이미지를 가져옵니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 설명 하는 프로토콜 세균성 세포 생존 능력 및 형태학 상 특성의 분석을 포함 하 여 보 철 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 biofilm 형성을 평가 하기 위해 개발 되었다. 이 작업을 수행 하기 위해 biofilm 형성의 현장에 모델 intraoral 장치 시험 자료의 샘플 및 48 h에 대 한 동적 구강 환경에 노출 그들을 유지 하는 능력의 구성 설계 되었습니다. 장치는 편안 하 고 쉽게 ?...

박테리아 biofilms 복잡 한, 기능적 및 구조적으로 미생물 지역 사회 조직, 세포 외, 생물학적으로 활성 폴리머 매트릭스1,2합성 미생물 종의 다양성에 의해 특징. 생물 비 생물 적인 표면에 세균성 접착 침 glycoproteins1,,34주로 구성 된 인수 박막의 형성에 의해 앞에 있습니다. 미생물 및는 박막 사이의 약한 물리 화학 상호 작용 처음 설립 하 고 세균성 adhesins 인수 박막의 당단백질 수용 체 사이 강한 상호 작용에 의해 따라. 미생물 다양성 형성 multispecies 커뮤니티1,,34, , 이미 연결 된 박테리아의 수용 체에 보조 식민지 개척자의 coaggregation를 통해 점차 증가 5.
구두 microbiota 및 호스트와의 공생 관계의 항상성 구강 건강 유지에 중요 하다. 구두 biofilms 안에 dysbiosis 카 리에 스 그리고 치 주 질환2,5의 개발에 대 한 위험을 증가할 수 있습니다. 임상 연구는 치아 나 치아에 biofilm의 축적과 치은 염 또는 페리-임 플 란 트 mucositis6,7의 개발 원인-효과 관계를 보여 줍니다. 염증 과정의 진행 임 플 란 트8의 필연적인 손실과 peri implantitis 이끌어 낸다.
치과 임 플 란 트 및 보 철 그들의 구성 요소는 세균성 식민 및 biofilm 형성9경향이 있습니다. 화학 성분 및 표면 지형 낮은 미생물 접착을 제공 하는 자료의 사용 정도와 요정 이식 질병9,10의 진행을 줄일 수 있습니다. 티타늄 임 플 란 트;에 대 한 보 철 abutments의 제조에 대 한 자료를 가장 많이 사용 되는 그러나, 세라믹 재료 최근에 도입 되었다 그리고 그들의 미적 속성 및 생체 적합성11,12티타늄 대신 인기를 얻고 있다. 또한 중요 한 것은, 세라믹 재료 미생물, 주로 그들의 표면 거칠기, 습윤, 및 표면 자유 에너지10,13때문에 살 일 걸 요 감소 잠재력 관련 되어 있다.
생체 외에서 연구 보 철 인접 표면9,14,15,,1617미생물 접착의 이해에 중요 한 발전에 기여 했다. 그러나, 구강, 전단 세력의 존재에 의해 뿐만 아니라 다양 한 온도 산도 및 양분 가용성 특징의 동적 환경이 이다 생체 외에서 실험 프로토콜18, 재현할 수 19. 이 문제를 해결 하려면 대신 advantageously 비보 전 분석10,20, 의 3 차원 구조를 유지 하는 biofilm 형성의 현장에 모델의 사용은 21 , 22 , 23 , 24.
구두 기판에 형성 된 biofilm의 복잡 한 구조의 분석 현미경 검사 법 기술 광학 밀도 문제25표시할 수 있는 사용을 해야 합니다. Multiphoton 레이저 스캔 현미경 biofilm 구조 분석26현대 옵션입니다. 그것은 적외선 파장, 펄스 femtoseconds27에 가까운 조명 소스와 비선형 광학의 사용에 의해 특징입니다. 이 메서드는 autofluorescence 자료 또는 자료 fluorophores, 비선형 광학 신호 제 2 고조파 발생으로 알려진 현상에서 파생 된에 의해 생성 된 이미지 외에 의해 표시의 이미지 수집에 대 한 표시 됩니다. Multiphoton 현미경의 장점 중27여기 빛 강도 의해 발생 하는 최소 세포 손상으로 얻은 좋은 이미지 깊이입니다.
Multiphoton 현미경에 의해 abiotic 표면에 biofilm의 생존 능력 분석, 형광 핵 산의 사용 다른 스펙트럼 특성을 가진 염료 그리고 세균성 세포에 침투 수 용량 필요28. 라이브 하 고 죽은 박테리아28,,2930사이의 시각적 차별화 Fluorophores SYTO9 (그린 형광) 및 propidium 요오드 화물 (레드 형광)를 사용할 수 있습니다. Propidium 요오드 화물 SYTO9는 손상과 손상 된 막으로 세균 세포를 입력 하는 동안 손상 된 멤브레인과만 박테리아 침투. 두 염료 셀 안에 있는 경우, propidium 요오드 화물 핵 산에 대 한 큰 선호도 있으며 배 수량 SYTO9, 그것에 게 빨간28,30을 표시 합니다.
보기는 구강 환경 복잡성과 구강 biofilm이, 치아와 치과 재료의 표면 biofilm 분석 수 있는 현미경 기술 필요. 이 문서에서는 일련의 프로토콜 비교 형태학 및 세포 수준에서 구두 biofilms 분석에 관련 된 방법으로 구두 biofilm 형성 티타늄 및 보 철 abutments에 대 한 세라믹 재료에 대 한 구현.

<table><tbody><tr><td>Hydrogum 5</td><td>Zhermack Dental</td><td>C302070</td><td></td></tr><tr><td>Durone IV</td><td>Dentsply</td><td>17130500002</td><td></td></tr><tr><td>NiCr wire&amp;nbsp;</td><td>Morelli</td><td>55.01.070</td><td></td></tr><tr><td>JET auto polymerizing acrylic</td><td>Cl&amp;aacute;ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental wax&amp;nbsp;</td><td>Cl&amp;aacute;ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pressure pot&amp;nbsp;</td><td>Essencedental</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandpapers 600 grit</td><td>NORTON</td><td>T216</td><td></td></tr><tr><td>Sandpapers 1200 grit</td><td>NORTON</td><td>T401</td><td></td></tr><tr><td>Sandpapers 2000 grit</td><td>NORTON</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Metallographic Polishing Machine</td><td>Arotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Hot melt adhesive</td><td>TECSIL</td><td>PAH M20017</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips, 10 &amp;micro;L</td><td>KASVI</td><td>K8-10&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips, 1,000 &amp;micro;L</td><td>KASVI</td><td>K8-1000B&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate&amp;nbsp;</td><td>KASVI</td><td>K12-024</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver inverted microscope&amp;nbsp;</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon vision ii laser</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC</td><td>ZEISS</td><td>440452-9903-000</td><td></td></tr><tr><td>SDD sensors - X-Max 20mm&amp;sup2;</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde solution</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Sodium cacodylate Buffer&amp;nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>97068&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S9638</td><td>Used for preparation of phosphate buffered saline</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9791&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>1.06404</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9333&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute for analysis EMSURE</td><td>MERK</td><td>1.00983</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Critical Point Dryer</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD 050 Sputter Coater</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oral biofilm formation on different materials for dental implants

치과 임 플 란 트 및 보 철 그들의 구성 요소 세균성 식민 및 biofilm 형성 하는 경향이 있다. 제공 하는 낮은 미생물 접착 재료의 사용 정도와 요정 이식 질병의 진행을 줄일 수 있습니다. 보기는 구강 환경 복잡성과 구강 biofilm이, 치아와 치과 재료의 표면에의 한 biofilm 분석 수 있는 현미경 기술 필요. 이 문서에서는 일련의 프로토콜 비교 형태학 및 세포 수준에서 구두 biofilms 분석에 관련 된 방법으로 구두 biofilm 형성 티타늄 및 보 철 abutments에 대 한 세라믹 재료에 대 한 구현. 이 연구에 설명 된 대로 치과 족 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 구두 biofilm 형성 평가를 제자리에 모델 방법론 타당성을 시연 함으로써 48 h biofilm의 만족 스러운 보존을 제공 합니다. Multiphoton 현미경 시험 자료에 형성 된 biofilm의 지역 담당자의 분석을 수 있습니다. 또한, fluorophores의 사용 및 multiphoton 현미경을 사용 하 여 이미지의 처리에는 세균 생존 능력의 분석을 미생물의 아주 이질적인 인구에 있습니다. 전자 현미경 검사 법 생물학 견본의 준비 biofilm, 좋은 해상도, 이미지 및 아무 유물의 구조 보존을 촉진합니다.

후 48 h 제자리에 성장의 biofilm의 식민 밀도 multiphoton 현미경 (시료의 총 스캔된 영역에 관하여 티타늄 및 지 르 코니 아 디스크에 식민지 지역의 비율에 의해이 연구에서 대표 되었다 26.64 mm2)입니다. 그림 2 3 시험된 재료의 표면에 세균성 식민 밀도를 나타냅니다. 캐스팅의 표면에 biofilm의 높은 밀도 관찰 되었다 가공된 티타늄 디스크 (0...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants at JoVE.com

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

치과 임 플 란 트에 대 한 다른 자료에 구두 Biofilm 형성

여기, 선물이 세균성 세포 생존 및 형태학 상 특성의 분석을 포함 하 여 치과 보 철물 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 구두 biofilm 형성 평가 하는 프로토콜. 현장에서 모델 관련 강력한 현미경 검사 법 기술 된 구두 biofilm 분석에 사용 됩니다.

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

oral-biofilm-formation-on-different-materials-for-dental-implants

Research

JoVE Journal

Medicine

11.4K 조회수.  University of São Paulo. 여기, 선물이 세균성 세포 생존 및 형태학 상 특성의 분석을 포함 하 여 치과 보 철물 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 구두 biofilm 형성 평가 하는 프로토콜. 현장에서 모델 관련 강력한 현미경 검사 법 기술 된 구두 biofilm 분석에 사용 됩니다.

비디오: Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

구강 Biofilms의 종합, 생물 구조 및 Transcriptome 평가를위한 분석 도구 - 상자가 Mutans Streptococci의 중재

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

연구

면역학 및 감염병학

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of them being fluorescence in situ hybridization (FISH).1,2 We performed a pilot study in which oral biofilm samples collected from fixed orthodontic appliances (palatal expanders) were stained by FISH, the objective being to assess the three-dimensional organization of natural biofilm and plaque accumulation.3,4 FISH creates an opportunity to stain cells in their native biofilm environment by the use of fluorescently labeled 16S rRNA-targeting probes.4-7,19 Compared to alternative techniques like immunofluorescent labeling, this is an inexpensive, precise and straightforward labeling technique to investigate different bacterial groups in mixed biofilm consortia.18,20 General probes were used that bind to Eubacteria (EUB338 + EUB338II + EUB338III; hereafter EUBmix),8-10 Firmicutes (LGC354 A-C; hereafter LGCmix),9,10 and Bacteroidetes (Bac303).11 In addition, specific probes binding to Streptococcus mutans (MUT590)12,13 and Porphyromonas gingivalis (POGI)13,14 were used. The extreme hardness of the surface materials involved (stainless steel and acrylic resin) compelled us to find new ways of preparing the biofilm. As these surface materials could not be readily cut with a cryotome, various sampling methods were explored to obtain intact oral biofilm. The most workable of these approaches is presented in this communication. Small flakes of the biofilm-carrying acrylic resin were scraped off with a sterile scalpel, taking care not to damage the biofilm structure. Forceps were used to collect biofilm from the steel surfaces. Once collected, the samples were fixed and placed directly on polysine coated glass slides. FISH was performed directly on these slides with the probes mentioned above. Various FISH protocols were combined and modified to create a new protocol that was easy to handle.5,10,14,15 Subsequently the samples were analyzed by confocal laser scanning microscopy. Well-known configurations3,4,16,17 could be visualized, including mushroom-style formations and clusters of coccoid bacteria pervaded by channels. In addition, the bacterial composition of these typical biofilm structures were analyzed and 2D and 3D images created.

We present a protocol for structural and compositional analysis of natural oral biofilm from orthodontic appliances with in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Oral biofilm samples were collected from palatal expanders, scraping acrylic-resin flakes off their surface and referring them for molecular processing.

형광에 원위치 하이브리드화 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 맛이 좋은 확장기의 사정 Biofilm 분석

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

의학

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

생체공학

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites are not distributed evenly in dental biofilms. A complex interplay of sorption to and reaction with organic matter in the biofilm reduces the diffusion paths of solutes and creates steep gradients of reactive molecules, including organic acids, across the biofilm. Quantitative fluorescent microscopic methods, such as fluorescence life time imaging or pH ratiometry, can be employed to visualize pH in different microenvironments of dental biofilms. pH ratiometry exploits a pH-dependent shift in the fluorescent emission of pH-sensitive dyes. Calculation of the emission ratio at two different wavelengths allows determining local pH in microscopic images, irrespective of the concentration of the dye. Contrary to microelectrodes the technique allows monitoring both vertical and horizontal pH gradients in real-time without mechanically disturbing the biofilm. However, care must be taken to differentiate accurately between extra- and intracellular compartments of the biofilm. Here, the ratiometric dye, seminaphthorhodafluor-4F 5-(and-6) carboxylic acid (C-SNARF-4) is employed to monitor extracellular pH in in vivo grown dental biofilms of unknown species composition. Upon exposure to glucose the dye is up-concentrated inside all bacterial cells in the biofilms; it is thus used both as a universal bacterial stain and as a marker of extracellular pH. After confocal microscopic image acquisition, the bacterial biomass is removed from all pictures using digital image analysis software, which permits to exclusively calculate extracellular pH. pH ratiometry with the ratiometric dye is well-suited to study extracellular pH in thin biofilms of up to 75 &#181;m thickness, but is limited to the pH range between 4.5 and 7.0.

A pH-sensitive ratiometric dye is used in combination with confocal laser scanning microscopy and digital image analysis to monitor extracellular pH in dental biofilms in real-time.

치과 바이오 필름에 세포 외 pH를 비례 영상

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition leads to a better understanding of cariogenic and periopathogenic mechanisms. Microbial changes taking place in the oral cavity during childhood are of interest for several reasons. The evolution of the child oral microbiota and shifts in its composition need to be analyzed further to understand and possibly prevent the onset of disease. At the same time, advanced knowledge of the natural composition of oral biofilm is needed. Early stages of caries-free permanent dentition with healthy gums provide a widely unaffected subgingival habitat that can serve as an in situ baseline for studying features of oral health and disease. Analysis of children's oral biofilm during different stages in life is thus an important theme in the field. Modern molecular analysis methods can provide comprehensive information about the bacterial diversity of such biofilms. To enable microbiota data comparison, it is important to standardize each step in the procedure for molecular data generation. This procedure spans from clinical sampling, Next Generation Sequencing (NGS), bioinformatic data processing, to taxonomic interpretation. One of the most critical factors here is biofilm sampling. Sampling in children is even more challenging in particular due to limited space in subgingival areas. We thus focus on the use of paper points for subgingival sampling. This article provides a detailed protocol for oral biofilm sampling of the subgingival sulcus, the mucosa, and saliva in children.

Changes in the oral microbiome throughout childhood are of growing interest. Comparison of different microbiome studies reveals a lack of standardized sampling protocols. Limited space makes sampling the sound subgingival sulcus of children challenging. Paper point sampling is presented here in detail as the method of choice for this area.

건강 한 아이에서 미생물 분석을 위한 구두 Biofilm 샘플링

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro

Over the past several decades, biodegradable materials have been extensively explored for biomedical applications such as orthopedic, dental, and craniomaxillofacial implants. To screen biodegradable materials for biomedical applications, it is necessary to evaluate these materials in terms of in vitro cell responses, cytocompatibility, and cytotoxicity. International Organization for Standardization (ISO) standards have been widely utilized in the evaluation of biomaterials. However, most ISO standards were originally established to assess the cytotoxicity of nondegradable materials, thus providing limited value for screening biodegradable materials. 
This article introduces and discusses three different culture methods, namely, direct culture method, direct exposure culture method, and exposure culture method for evaluating the in vitro cytocompatibility of biodegradable implant materials, including biodegradable polymers, ceramics, metals, and their composites, with different cell types. Research has shown that culture methods influence cell responses to biodegradable materials because their dynamic degradation induces spatiotemporal differences at the interface and in the local environment. Specifically, the direct culture method reveals the responses of cells seeded directly on the implants; the direct exposure culture method elucidates the responses of established host cells coming in contact with the implants; and the exposure culture method evaluates the established host cells that are not in direct contact with the implants but are influenced by the changes in the local environment due to implant degradation. 
This article provides examples of these three culture methods for studying the in vitro cytocompatibility of biodegradable implant materials and their interactions with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). It also describes how to harvest, passage, culture, seed, fix, stain, characterize the cells, and analyze postculture media and materials. The in vitro methods described in this article mimic different scenarios of the in vivo environment, broadening the applicability and relevance of in vitro cytocompatibility testing of different biomaterials for various biomedical applications.

Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro

We introduce three methods of direct culture, direct exposure culture, and exposure culture for evaluating the in vitro cytocompatibility of biodegradable implant materials. These in vitro methods mimic different in vivo cell-implant interactions and can be applied to study various biodegradable materials.

체외에서 생분해성 임플란트 재료를 연구하기 위한 직접 및 간접 배양 방법

Over the past several decades, biodegradable materials have been extensively explored for biomedical applications such as orthopedic, dental, and ...

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active compounds from plants are challenging because of the complex plant matrix and time-consuming isolation and identification procedures. Therefore, a stepwise approach for screening natural compounds from plants, including the isolation and identification of potentially active molecules, is presented. It includes the collection of the plant material; preparation and fractionation of crude extracts; chromatography and spectrometry (UHPLC-DAD-HRMS and NMR) approaches for analysis and compounds identification; bioassays (antimicrobial and antibiofilm activities; bacterial &#34;adhesion strength&#34; to the salivary pellicle and initial glucan matrix treated with selected treatments); and data analysis. The model is simple, reproducible, and allows high-throughput screening of multiple compounds, concentrations, and treatment steps can be consistently controlled. The data obtained provide the foundation for future studies, including formulations with the most active extracts and/or fractions, isolation of molecules, modeling molecules to specific targets in microbial cells and biofilms. For example, one target to control cariogenic biofilm is to inhibit the activity of Streptococcus mutans glucosyltransferases that synthesize the extracellular matrix&#8217; glucans. The inhibition of those enzymes prevents the biofilm build-up, decreasing its virulence.

Natural products represent promising starting points for the development of new drugs and therapeutic agents. However, due to the high chemical diversity, finding new therapeutic compounds from plants is a challenging and time-consuming task. We describe a simplified approach to identify antimicrobial and antibiofilm molecules from plant extracts and fractions.

식물의 추출물과 분획에서 새로운 항균 및 항바이오필름 분자를 식별하여 치과 용 충치를 방지하기 위한 체계적인 접근법

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

생물학

Effects of Mechanical Methods Used in Peri-implantitis Treatment on Implant Surface Decontamination and Roughness

Various mechanical methods have been proposed for decontaminating dental implant surfaces with varying success. This in vitro study evaluated the decontamination efficiency of an air abrasion (AA) system with erythritol powder, a polyether-ether-ketone (PEEK) ultrasonic tip, and titanium curettes (TIT) and their effects on implant surface topography using scanning electron microscopy (SEM). A total of 60 implants were stained with permanent red ink and placed in 3D-printed Class 1A and Class 1B peri-implantitis defects, forming six groups (n=10 per group) based on defect type and treatment protocol. Additionally, one positive and one negative control implant was used. Erythritol powder, PEEK ultrasonic tips, and titanium curettes were applied for 2 min in Class 1A defects and 3 minutes in Class 1B defects. Residual red ink areas were quantified with digital software, and implant surface changes were analyzed using SEM and EDS. None of the methods achieved complete decontamination. However, erythritol powder was significantly the most effective, leaving a residual ink rate of 24% &#177; 6% (p &#60; 0.001). PEEK ultrasonic tips resulted in 41% &#177; 4% residual ink, while titanium curettes left 55% &#177; 3%. Significant differences were observed among all methods. No significant difference in decontamination efficacy was found between Class 1A and Class 1B defects. SEM analysis showed minimal surface damage with erythritol powder and PEEK tips, whereas titanium curettes caused moderate to severe damage. Based on both decontamination efficiency and surface preservation, erythritol powder and PEEK tips are safe and effective options for peri-implantitis treatment, while titanium curettes are less effective and cause considerable surface damage. These findings may assist clinicians in peri-implantitis treatment planning.

The present protocol describes an experimental model based on ink-staining which can be used for in vitro implant surface decontamination and roughness research to contribute to clinical decision-making.

임플란트 주위염 치료에 사용되는 기계적 방법이 임플란트 표면 오염 제거 및 거칠기에 미치는 영향

Various mechanical methods have been proposed for decontaminating dental implant surfaces with varying success. This in vitro study evaluated the ...

아시네토박터 생물막 형성 평가 및 생물막의 특성화

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

저자 스포트라이트: Acinetobacter Biofilm 정량화, 평가 및 시각화를 위한 포괄적인 프로토콜 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Acinetobacter Biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...