우리의 프로토콜은 전이성 식민지화 및 성장에 있는 어떤 후보 유전자든지의 역할을 빠르고 쉽게 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 전이, 형성 및 성장의 실시간 모니터링뿐만 아니라 절제 또는 조직학적 얼룩없이 동일한 동물의 전이 수와 크기를 정량화할 수 있습니다. 완전한 성장 매체에서 12웰 플레이트에서 잘 150, 000 세포당 4개의 T1 세포를 플레이트.
하룻밤 사이에 37도에서 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 다음 날, 세포에서 성장 매체를 흡인. 루시파라제 바이러스 성 체신화 500 마이크로리터와 500 마이크로리터의 형광 단백질 바이러스 성 슈퍼나티를 추가하여 루시파아제와 형광 단백질 바이러스 슈퍼나티제로 세포를 동시에 감염시다.
그런 다음 밀리리터 헥사디메린 브로마이드당 8밀리그램의 마이크로리터 1개를 추가하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 24~48시간 동안 배양합니다. 트립신의 500 마이크로 리터와 네 개의 T1 세포를 트립시니화. 2~5분 후, 모든 세포를 선택 매체의 4밀리리터로 6센티미터 접시에 옮기면 트립신을 담금질합니다.
선택이 완료되면 감염된 4개의 T1 세포가 50~100배배배율로 역형 형광 현미경을 사용하여 ZsGreen 형광 단백질을 발현하고 있는지 확인합니다. 또한 감염된 4개의 T1 세포가 시판적으로 이용 가능한 루시파아제 활성 키트를 사용하여 루시파라제를 발현하고 있는지 확인한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 생체 내 실험 설계의 최적화를 수행합니다.
미디어를 흡인하고 1X PBS로 셀 플레이트를 헹구세요. 트립시니저는 15센티미터 플레이트당 5밀리리터의 트립신으로 세포를 2~5분 동안 분리하고 모든 세포를 원추형 튜브로 옮기습니다. 트립신을 담금질하기에 충분한 완전한 성장 매체로 조직 배양 접시에서 남은 세포를 씻으십시오.
같은 원물 튜브에 세척을 추가합니다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산하여 총 셀 수를 결정합니다. 다음으로, 세포를 122회 G로 3분간 원심분리하고, 수퍼나티를 흡인시한다.
원하는 농도에서 1X PBS에서 세포를 다시 중단한다. 여기서, 25, 000 세포는 PBS의 각 마우스 및 100 마이크로리터로 주입됩니다. 따라서 다시 중단된 세포는 밀리리터당 250, 000 세포에 있습니다.
세포 현탁액을 주입 할 때까지 얼음에 보관하십시오. 동물 시설에서 후드에서 작업, 부드럽게하지만 철저하게 튜브를 반전하거나 균일하게 다시 중단되도록 1 밀리리터 주사기를 사용하여 세포를 혼합. 이제 셀 서스펜션으로 1밀리리터 루어 락 주사기를 적재하고 과도한 기포를 추방합니다.
반 인치 30 게이지 바늘을 주사기에 놓고 베벨을 위로 놓고 기포를 추방합니다. 마우스를 설치류 제지제에 부드럽게 배치합니다. 측면 꼬리 정맥을 보이고 넓혀야합니다.
그렇지 않은 경우 꼬리의 베이스를 부드럽게 꼬집어 따뜻한 수돗물에 꼬리를 담그고 정맥을 팽창시다. 꼬리를 청소하기 위해 알코올 닦기를 사용하여 꼬리 정맥에 바늘을 삽입하고 측면을 위로 구부리고 세포 현탁액 100 마이크로 리터를 주입하십시오. 바늘이 정맥에 제대로 삽입되면 약간 앞뒤로 쉽게 밀어야하며 플런저를 밀어 넣을 때 저항이 없어야합니다.
성공적인 주사는 또한 정맥의 청색이 주입 다음 몇 초 동안 흰색으로 변하는 플러시를 초래해야합니다. 천천히 바늘을 제거하고 멸균 거즈를 사용하여 주사 부위에 압력을 가하여 출혈을 막습니다. 마우스를 케이지에 반환하고 전체 복구를 보장하기 위해 15 분 동안 모니터링하십시오.
생체 내 라이브 동물 이미징 장치를 켜고 이미지 소프트웨어를 열고 로그인합니다. 초기화 버튼을 클릭하고 기기가 초기화될 때까지 기다립니다. 뷰 필드를 D.로 처음 사용하면 편집, 기본 설정, 수집 및 자동 노출을 클릭하여 노출 설정을 편집합니다.
최대 노출 시간을 기본 60초에서 300초로 변경하고 확인을 클릭합니다. D-luciferin으로 1 밀리리터 주사기를 로드한 다음 주사기에 반 인치 30 게이지 바늘을 추가하고 기포를 추방합니다. 마취 된 마우스의 질량을 측정하고 기록합니다.
엄지손가락과 포인터 손가락을 사용하여 목 덜미를 꼬집고 핑키 핑거와 손의 베이스 사이에 꼬리를 움켜쥐어 마우스를 억제합니다. 머리를 아래쪽을 가리키며 45도 각도로 마우스를 반전시다. 바늘을 마우스왼쪽 IP 공간에 위쪽으로 베벨 측을 삽입합니다.
작은 볼륨을 다시 그려 IP 공간에 입력을 확인합니다. IP 공간에서 다시 그릴 때 바늘의 바닥에 색이 없어야합니다. 킬로그램 당 150 밀리그램의 복용량에 대 한 D-luciferin의 적절 한 볼륨을 주입.
D-루시퍼린 투여 직후 타이머를 시작합니다. 마우스를 코 콘에 코가 있는 이미징 장치에 평평하게 놓고 1~2% 이소플루란이 투여되고 있는지 확인합니다. 발광 및 사진 상자를 클릭합니다.
노출 시간을 자동으로 변경한 다음 획득 제어판에서 획득을 클릭합니다. 이미징 후 마우스를 케이지로 반환하고 15분 동안 모니터하여 완전한 회복을 보장합니다. 본문 프로토콜에 설명된 바와 같이 안락사를 따르는 것은 각 마우스에서 폐를 분리 및 제거하고 1X PBS에서 헹구어 과도한 혈액을 제거한다.
브라이트필드의 10X에서 로브의 ZsGreen 전이 의 이미지를 획득하고 GFP 와이드 밴드 필터가 있는 형광 스테레오스코프를 사용하여 형광을 얻습니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지의 전이 의 크기와 수를 정량화합니다. 생체 내 라이브 동물 이미징 장치로 획득한 이미지에서 얻은 데이터를 처리하고 분석하려면 이미지 소프트웨어의 각 마우스에 대한 모든 이미지 파일을 엽니다.
이미지 창 왼쪽 상단의 화살표를 클릭하고 적절한 단위로 변경하여 형광 데이터에 대한 생물 발광 데이터와 효율성을 위한 광채를 제공합니다. 도구 팔레트 창에서 ROI 도구를 먼저 클릭하여 마지막 시점의 이미지를 사용하여 관심 영역 또는 ROI를 만듭니다. 그런 다음 화살표를 클릭하고 하나를 선택하여 하나의 ROI를 삽입합니다.
ROI의 테두리를 클릭하고 마우스의 가슴으로 이동합니다. ROI의 크기를 조정하여 마우스의 가슴을 덮고 신호를 제외하지 않도록 합니다. 그런 다음 ROI 측정을 클릭하고 원시 번호를 Excel 시트에 복사하거나 입력합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 플롯하고 분석합니다. 이미지 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 ROI를 복사한 다음 다른 시간 지점에서 이미지 파일에 붙여 넣고 측정 ROI를 클릭합니다. YAP와 TAZ를 모두 대상으로 하는 탠덤 miR-30 계의 shRNAs를 발현하는 레트로바이러스 벡터는 4개의 T1 세포에서 YAP 및 세금 단백질 발현 및 전사 활성을 감소시킨다.
4개의 T1 루시파라제 세포는 이 탠덤 YAP/TAZ shRNA 벡터 또는 통제된 miR-30 계 shRNA의 ZsGreen 표현 버전으로 안정적으로 변형되었다. 생체 발광 이미지는 YAP/TAZ 녹다운 세포로 주입된 마우스에 비해 대조구 세포로 주입된 마우스에서 전이성 부담이 증가하는 속도가 훨씬 빠르다는 것을 보여준다. 실험 과정에서 각 마우스에 대해 측정된 log10 변환된 루시파아제 신호의 플롯은 또한 YAP/TAZ 녹다운 세포로 주입된 마우스에 비해 대조군 세포로 주입된 마우스에서 속도가 더 빠르다는 것을 보여준다.
수동으로 계산될 때 제어 세포를 가진 마우스에 비해 YAP/TAZ 녹다운 세포를 주입한 마우스에서 형성된 전이가 현저히 적다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용할 때도 동일한 추세가 관찰되었습니다. 뿐만 아니라 더 많은 전이 대조군 마우스에서 형성 했다, 하지만 그들은 일반적으로 더 큰.
일관되게, 폐에 있는 전이성 부담은 또한 YAP/TAZ 녹다운에 의해 급격하게 감소되었습니다. 각 마우스에 동일한 수의 건강한 세포를 성공적으로 주입하는 것은 고품질 데이터를 보장하는 데 중요합니다. 특히 바이러스가 인간전염성인 경우, 전염성 레트로바이러스 및 렌즈바이러스로 작업할 때 주의사항을 사용하고 안전 지침을 따르는 것을 기억하십시오.
이 기술은 우리가 전이성 질병의 처리를 위한 새로운 치료 표적을 확인하고 시험하는 방법을 제공하는 후보 유전자 및 전이성 식민지 및 성장의 역할을 설명하는 것을 허용했습니다. 이 절차에 따라, 폐를 포함하는 전이는 변경된 유전자가 전이에 어떻게 영향을 미치는지 조사하고 관련될 수 있는 그밖 단백질을 확인하기 위하여 면역형성 또는 조직학적 얼룩에 의해 추가 분석될 수 있습니다.
