저자는 폐 관류의 기술에 대한 그의 조언 박사 Lubor Borsig을 (생리학 연구소, 취리히 대학) 감사드립니다. 이 작품은 Kanton 취리히 (Zurich)의 Krebsliga, 월터 L.와 요한나 늑대 재단, 취리히, 리디아 Hochstrasser 재단, 취리히, 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation), SNF, 스위스, Schweizerischer Verein Balgrist, 그리고 대학에서 보조금에 의해 지원되었다 취리히 (Zurich).

1.에서 시츄의 폐 관류 및 고정 <ol><li> ~ 150 μl 인산염의 IP 주입하여 마우스를 마취는 생리가 (PBS) 112.5 밀리그램 / kg (체중) 케타민, 16.5 밀리그램 / kg xylazine, 15 밀리그램 / kg acepromazine (또는 적절한 진통제를 포함하는 다른 마취로).를 포함하는 버퍼 </li><li> 마우스 반사 신경이 더 이상 관찰되지 않을 때, 다시 다운 운영 테이블에 문제를 해결 아래로 매끄러운 머리카락에 70 %의 에탄올과 모피 젖었 어. </li><li> 목으로 복부의 피부를 열고 측면에 당기거나 제거 할 수 있습니다. </li><li> 충분한 크기로 복막과 가슴을 엽니 다. 이후 재관류의 감소 효율을 피하기 위해 큰 혈관의 파열 (예를 들면 베나의 jugularis) 방지합니다. </li><li> 간 아래 대정맥 caudalis 잘라. </li><li> 폐 완전히 흰색이며 때까지 뛰는 심장의 우심실로 천천히 10-15 ML PBS를 주입 24G 바늘 - 21G를 갖춘 20 ML의 주사기를 사용하여마음 (심장 수 축제) 박동을 멈 춥니 다. </li><li> 혈관 클램프로 간, 횡경막 위의 혈관을 찔러. </li><li> 오른쪽 심실로 PBS에 3 % paraformaldehyde의 ~ 2 ML (PFA)를 삽입 24G 바늘 - 21G를 갖춘 10 ML의 주사기를 사용합니다. </li><li> 가슴 이외의 기관을 발견. 폐는 증가 될 때까지 기관에 PBS 두개골 (가슴 이외의)에 3퍼센트 PFA의 ~ 3 ML를 삽입 할 때 동일한 주사기를 사용합니다. 즉시 바늘을 제거 후 혈관 클램프로 펑크의 기관 꼬리를 찔러 및 고정 할 수 있도록 10 분 기다립니다. </li><li> 혈관 클램프 위의 혈관을 가로로 쪼개다, 클램프를 제거하고 초과 PFA를 제거 할 수 우심실로 ~ 2 ML PBS를 삽입. </li><li> 찔린 바늘이있는 모든 폐 엽 (叶)의 하단 부분은 기관에서 혈관 클램프를 제거하고의 PFA까지 첫 번째 구멍의 기관 꼬리에 중간 / PBS 1:1 삽입 PolyFreeze의 솔루션 3-5 ML를 삽입 공기가 신선한 빈터엽은 솔루션으로 대체됩니다. </li><li> 집게로 마음을 당겨와 결합 조직 인대, 혈관 및 기관을 끊어 버렸네하여주의 깊게 폐를 제거합니다. 폐에 연결된 마음을 유지. </li><li> 폐 조직 분석을 진행하는 방법에 따라 섹션 2 또는 3에 명시된 프로토콜로 진행합니다. 이 두 분석을 수행하려는 경우, 한 폐 엽을 제거하고 3에서 설명 된대로 진행합니다. 이 아래 설명 된대로 마음에 연결된 나머지 엽 (叶)을 처리합니다. </li></ol> 2. 전체 폐 엽 (叶)에 lacZ 태그 전이성 종양 세포의 시각화 <ol><li> 단단히 닫는 뚜껑이있는 플라스틱 컵에 폐를 놓고 30-60 분 동안 실온에서 PBS에 2 %의 포름 알데히드로 해결할 수 있습니다. </li><li> 고정 솔루션을 제거하고 PBS로 철저하게 3 회 씻는다. </li><li> 갓 5 - 브로 모 -4 - 클로로-3-인돌 릴-β-D-galactoside (X-걸) 착색 솔루션 (X-걸 주식 솔루션 [40 MG / ML에서 조리 적어도 10 ML을 추가Dimethylformamide] 1시 40분 기본 착색 솔루션에 희석, pH를 7.1 (표 1), 빛으로부터 보호). </li><li> 솔루션에 완전히 유지하고 공기의 교환을 허용하도록 포트에만 느슨하게 뚜껑을 배치 할 수있는 수영 폐의 상단에 거즈 조각을 놔. </li><li> 빛으로부터 보호 3-5 시간에 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> X-걸 솔루션을 제거 잔류 X-걸 솔루션을 (선택 사항) 제거하고 4% PFA를 추가 할 수 PBS로 한 번 씻어. </li></ol> 3. 폐 Cryosections에 lacZ 태그 전이성 종양 세포의 시각화 <ol><li> undiluted PolyFreeze 퍼가기 매체와 3분의 1에 미리 기입 표시 퍼가기 금형. 상단에있는 폐 엽을 넣고 엽이 완전히 덮여 때까지 매체를 삽입 따라 작성하십시오. 거품을 억제하기 위하여 노력하고 있습니다. </li><li> 20 분에 4 ° C에 포함 된 폐를 품다. </li><li> 그런 다음 -80 ° C.에 천천히 드라이 아이스와 이소 펜탄 및 매장의 혼합물에 포함 된 폐를 고정 </li><li> 7-10 μm cryo 잘라그라 이오 스탯에 섹션 및이 SuperFrostPlus 현미경 슬라이드에 올려 탑재합니다. </li><li> humidified 챔버에서 24 시간에 ° C 37 X-걸의 착색 솔루션을 즉시 절을 품다. </li><li> 증류수에 잠시 후 5 분에 있고 PBS 2 회에서 슬라이드를 씻어. </li><li> , 10-30 초에 대한 핵 빠른 붉은 색과 반대 얼룩은 증류수에 씻어 Immu 마운트와 슬라이드를 탑재합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 아사이 외. 높은 전이성 LM8 하위 세포 라인에서 파생 된 것과 다른 부모 던 세포에서 파생 된 SC 기본 종양, 저절로에서 감지 폐 ​​metastases를 형성하지 않는 것이 던 - 파생 LM8 OS 마우스 모델에있는 원본 문서에보고 syngeneic C3H 마우스 14. 여기에보고 된 기술을, 우리는 Dunn/LM8 마우스 OS 모델의 metastases의 형성을 reinvestigated. 우리는 안정적인 lacZ-transduced 던과 LM8 셀을 이용했다s와 쥐의 시츄 폐 관류 및 고정을위한 프로토콜. 피하에 주입 쥐 perfused 및 비 perfused 폐의 대표 이미지 lacZ는 - transduced 및 제어 던과 LM8 세포를 그림 1에 표시됩니다 비 transduced. 제어 던 세포를 주입 생쥐에서 매크로 및 미세 metastases은 비 perfused와 perfused 폐 (그림 1A, I-IV)에 탐지가 남아 있었다. 그러나, 흥미롭게도, 던 - lacZ 세포와 함께 주입 마우스에 X-여자의 얼룩은 비 perfused 폐 (그림 1A, 누나)의 표면에 단일 세포 또는 작은 세포 클러스터 (&lt;0.1 mm)의 푸른 micrometastatic foci을 공개했다. 인 폐의 현장 재관류와 고정 더욱 던-lacZ micrometastases (그림 1A, VIII)의 detectability을 개선. 그러나, 매크로 foci로 가지 (그림 1A, V, VII) 관찰되지 않았습니다. &lt;이/ P&gt; 반투명 제어 LM8 세포, 거의 감지 macrometastatic foci로 주입 마우스에 직경 0.1 mm보다 큰이 아닌 perfused 폐 (그림 1B, 난)에서 인정되었다. 폐의 재관류 (그림 1B, III)는 foci의 검출이 향상되지 않았다. 그러나, 쥐에서 여러 LM8-lacZ 세포를 주입 X-걸 스테인드 푸른 매크로 (그림 1B, V)와 micrometastases (그림 1B, 누나)가 아닌 perfused 장기의 표면에 발견되었다. 또한, 폐의 재관류는 추가의 detectability 매크로 및 micrometastases을 (- VIII 그림 1B, VII) 개선. 따라서, 마이크로 및 macrometastases은 주로 인해 장기의 표면 아래에 foci도 보게되었습니다 된 perfused 조직의 투명도에, 높은 밀도 및 더 많은에 표시되었다. 추가 H폐 조직의 cryosections를 사용하여 istological 분석 lacZ-transduced 던과 LM8 세포를 주입 쥐 폐 metastases의 개선 detectability을 확인했습니다. 던 - lacZ 또는 LM8-lacZ 세포에서 파생 된 주요 악성 종양으로 마우스에서 각각의 제어 세포, micrometastases 또는 단일 셀 foci의 주요 악성 종양으로 쥐와 달리 폐 섹션 (그림 2)에서 인정되었다. 또한, macrometastases 또한 제어 LM8 세포 (그림 2C, D)으로 주입 동물보다 LM8-lacZ 세포를 주입 쥐에 더 명확하게 볼 수 있었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> 그림 1.의 자연 metastases의 검색이 아닌 transduced (I-IV)와 lacZ는 - transduced (V-VIII) 던 (A)와 LM8 (B) 비 perfused (I, II, V, VI)와 perfused의 셀 C3H 마우스의 (3, 4, VI​​I, VIII) 폐. 대표 X-걸 - 역에서 Metastasesined 전체 폐 (V, A와 B의 VII)와 각각의 클로즈업 (바이올렛에서 VIII A와 B) 파란색 표시됩니다. 비 태그 LM8 세포 (B에 I-IV)에 주입 쥐 기관의 Macrometastatic foci가 (&gt; 0.1 mm) 별표로 표시됩니다. 클로즈업에 표시된 영역은 전체 폐에 대표입니다. 스케일 바는 전체 폐의 ​​이미지에서 1 mm와 클로즈업의 0.1 mm를 표시합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> 그림 2. 던과 폐 cryosections에 LM8 micrometastases의 감지. 10월 임베디드 폐 조직의 섹션은 humidified 챔버에서 24 시간에 37 ° C에서 X-걸의 착색 솔루션에 incubated하고 핵 빠른 빨간색으로 counterstained했다. 화살표 던-lacZ (B) 또는 LM8-lacZ 전지 (D)와 함께 주입 마우스의 폐 섹션에서 인정 micrometastatic foci를 가리 킵니다. 엠icrometastases가 아닌 transduced 던 (A) 또는 LM8 셀 (C)와 함께 주입 마우스의 폐 섹션에서 탐지가 남아 있었다. 스케일 바는 0.1 mm를 나타냅니다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Dunn/LM8 마우스 OS 모델의 여기에 제시된 결과는 인 시츄 재관류 / 폐 조직의 고정와 lacZ 태그 종양 세포의 X-걸의 착색을 결합 새로 설립 방법의 힘을 보여줍니다. 두 기술의 조합은 단일 세포 수준 micrometastatic 병변의 고감도 검출을 할 수 있으며, 폐 표면 (그림 1)뿐만 아니라 폐 섹션에서 (그림 2)에 macrometastases의 시각화을 향상시킵니다. X-걸의 얼룩도 있기 때문에 자연 혈액 및 조직 관련 색 다른 기관에서 시츄 재관류 / 고정의 (마이크로) metastases의 검출은 약간 폐 이외의 조직에서 전이성 foci의 detectability을 향상 할 수 있지만 이러한 기관 13. 재관류가 다른 기관에 전달됩니다 경우에도 간을 예를 들어, 혈액의 제거는 부분적으로 대비 베팅을 향상시킬기대하다 X-걸의 착색과 장기의 자연 색상입니다. 그러나, 방법은 lacZ 태그 종양 세포의 모든 종류에 적용됩니다, 극적 휴지 단일 셀 micrometastases의 수준에 폐 전이의 detectability을 개선하고, 매크로 및 micrometastases의 쉽고 신뢰할 수있는 정량화 수 있습니다. 이 방법과 루시 페라와 형광 단백질을 포함한 기자 유전자를 기반으로하는 다른 모든 기술의 한계는 transgene 표현의 안정성입니다. 그림 2D에 도시 된 바와 같이, macrometastatic foci 내 모든 종양 세포는 베타 갈 락토 활동의 부족을 나타내는 파란색 얼룩이 있습니다. 이 괴사에 관련된 될 수 있지만, 더 많은 가능성이 transgene 표현의 손실 때문입니다. 우리는 던과 LM8 세포가 표현에도 지속적인 선택에 따라 lacZ와 다른 transgenes의 다운 규제에 매우 효과적인 것을 관찰했다. 따라서 우리는 손쥐 K12에 최근의 연구에서 전환그리고 K7M2 모든 체외뿐만 아니라 최대 시간이 지남에 따라 100 % 생체 내 안정성 lacZ 식을 유지 인간의 호수, 143B와 미친-2 osteosarcoma 세포 라인. lacZ 표현되면 안정이 보장되고,이 기법은 mechanistically 조직 식민지 13뿐만 아니라 전이성 병변 (15)의 근절을 목표로 새로운 치료법의 개발과 테스트 과정을 조사 할 예를 들어 유전자 조작 종양 세포와 연구에 적용 할 수 16. 또한, 전이성 병변의 조기 발견을 위해 사용되는 등 PET (마이크로) 중부 표준시와 MRI 등 최신 방사선 이미징 기술,의 개선을위한 벤치 마크 역할을 할 수 있습니다. 다른 추적기와 최근 PET 연구 (게시되지 않은)에서 우리는 생체 감지 폐에서의 설명 프로토콜 이후 전 생체을 metastases 확인했습니다. 새로운 작은 동물 마이크로-CT와 지속적인 연구에서는 (SkyScan) 우리가 지금까지 AB입니다르 0.5 mm 및 예 생체 다운 0.3 mm까지의 크기로 생체에 폐 metastases를 감지 할 수 있지만, 우리는 0.1 mm의 해상도로 목표로하고 있습니다. 흥미롭게도, 우리가 인 시츄 재관류와 X-걸의 착색의 결합 방법에 micrometastases 매크로에서 구별 할 설정 한 크기 제한입니다. 이 다시 쉽게하고 비용 효율적인 기술의 감도와 유용성을 강조.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Narketan10 (케타민) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 MG / ML 솔루션 </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazine) </td><td> Streuli 제약 AG </td><td></td><td> 20 MG / ML 솔루션 </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromazine) </td><td> Fatro 스파 </td><td></td><td> 10 MG / ML 솔루션 </td></tr><tr><td> 불독 유형 혈관 클램프를 Serrefine </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 18051-35 </td><td> 곡선, 35mm </td></tr><tr><td> 뚜껑이있는 플라스틱 컵 </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 뚜껑 25 ML 컵 </td></tr><tr><td> 5 - 브로 모 -4 - 클로로-3-인돌 릴-β-D-galactoside (X-걸), 분말 </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002 - G005 </td><td> 저장, N-디 - methylformamide 40 MG / ML에, N에 용해 가벼운 보호 -20 ° C에서 </td></tr><tr><td> 최대에 빛을 보호 4에 ° C 저장 산도 7.1 equilibrated 기본 착색 솔루션. 1개월 </td><td> 자수성가 </td><td></td><td> 100 ML / L 10xPBS, 1.64 g / L K3Fe (CN) 6, 2.1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ML / L 1M MgCl2, 2 ML / L 10% NP40, 1 ML / L 10 % 나트륨 - Deoxycholate </td></tr><tr><td> PolyFreeze 임베딩 매체 </td><td> Polysciences, 스위스 대리점 : Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> 금형을 삽입 </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 그라 이오 스탯 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost 슬라이드 </td><td> Menzel </td><td> J1800AMN​​Z </td><td></td></tr><tr><td> 핵 빠른 레드 - 황산 알루미늄 용액 </td><td> 부 채도 Waldeck GmbH의 및 공동 KG 지구ributor : Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu 마운트 </td><td> 열 전자, 스위스 배급 : Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 시약 및 장비.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

전이 암 유형의 대부분의 사망의 주요 원인과 암 연구에 따라서 주요 초점입니다. 그러나, radiologic 이미징 및 치료 퇴치의 성공에 의해 micrometastases의 검출이 제한 남아 있습니다. 동물 모델은 암 연구 1 귀중한 도구가 될 입증하고 있지만, 모니터링 / micrometastases의 시각화는 잠복기 연구의 도전과 전이성 확산의 부정확 한 평가를 잠재적으로 임상 실험 2에서 실망스러운 결과로 연결 남아 있습니다. 따라서, 마침내 정상 조직에있는 단일 세포 수준 metastases의 재현하고 안정적​​으로 감지 할 수 있도록 방법을 조정에 큰 관심이 있습니다. 주요 초점은 따라서 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로-CT), 양전자 방출 단층 촬영 장치 (PET), bioluminescence 또는 형광 이미징과 같은 생체에 종양 세포의 검출을 허용 기법,에 &lt;&gt; 3,4을 논의하게 될 것입니다. 현재 다른 osteosarcoma 모델의 기본 종양의 성장과 전이의 생체 모니터링에 대해 이러한 기술을 최적화하고 있습니다. 이러한 기술 중 일부는 qPCR 5, FACS 6 조직 학적 염색법의 다른 유형과 같은 고전적인 방법 옆에 전이의 예 생체 분석에 사용할 수 있습니다. 벤치 마크로서, 우리는 안정 transfection 또는 lacZ 유전자와 종양 세포의 형질 도입이 박테리아 효소 chromogenic 기판 5 - 브로 모 -4 - 클로로-3-인돌 릴 - 베타-D를 대사 β-갈 락토 인코딩 본 연구에서 설정 한 불용성 인디고 염료 7 여기에 표시된대로 단일 세포 수준에 마우스 조직 예를 생체 내 종양 세포의 매우 민감하고 선택 histochemical 파란 착색을 할 수 있습니다 투 - galactopyranoside (X-걸). 이 연구에 전이 8 정밀한 검증이 새로운 평가 할 수있는 저가의 장비를 많이 사용하지 도구입니다ticancer 요법 9-11. X-여자의 착색의 제한 요소는 잘 vascularized의 조직의 혈액 관련 붉은 얼룩을 지정할 수있는 낮은 콘트라스트입니다. 폐 조직에서이 문제가 인 시츄 폐 관류, 최근 Borsig 외 12. 혈액을 취소하고 아래 시츄에 문제를 해결하고 삽입 마취에서 마우스의 폐를 perfused에 의해 설립 된 기술로 해결 될 수 기관을 통해 인플레이션. 이 방법은 또한 폐의 붕괴를 방지함으로써 조직 학적 분석을위한 조직의 품질을 향상 기능 폐 폐포의 형태를 유지하고 있습니다. 본 연구에서 우리는 lacZ - 표현 종양 세포의 X-여자의 착색의 조합을 활용하고 인 시츄 살포 및 폐 조직의 고정. 새로운 프로토콜을 설명 이 세련된 프로토콜은 폐의 단일 전이성 세포의 높은 감도 감지 할 수 있습니다 및 D에 대한 최근의 연구에서 우리를 활성화원래 14 비 전이성로 설명 된 마우스 모델 13의 &quot;휴지&quot;폐 micrometastases를 etect.

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Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

본 연구에서보고 된 소설 프로토콜 결합에 의한 마우스의 단일 셀 해상도로 폐 metastases의 선택적 검출 할 수 있습니다<em&gt;에서 시츄</em&gt; 폐 관류 및 고정하고 X-걸 착색<em&gt; lacZ</em종양 세포를&gt; 태그.

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

17.2K 조회수.  Balgrist University Hospital, Zurich. 본 연구에서보고 된 소설 프로토콜 결합에 의한 마우스의 단일 셀 해상도로 폐 metastases의 선택적 검출 할 수 있습니다에서 시츄 폐 관류 및 고정하고 X-걸 착색 lacZ 태그.

비디오: Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

고립의 방법<em&gt; 전의 VIVO</em쥐 모델에서&gt; 폐 관류 : 쥐 EVLP 프로그램 개발에서 교훈을

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

연구

의학

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

급성 폐 손상의 열기 기관 절개 위산 흡인 쥐 모델은 최대한 급성 치명적 폐 손상의 결과

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

질병 모델링에 대 한 인간의 3D 폐 조직 문화 (3D-Ltc)의 생성

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ quality exacerbated by excessive geographic transportation distance and stringent donor organ acceptance criteria pose limitations to current LTx efforts. Ex situ lung perfusion (ESLP) is an innovative technology that has shown promise in attenuating these limitations. The physiologic ventilation and perfusion of the lungs outside of the inflammatory milieu of the donor body affords ESLP several advantages over traditional cold static preservation (CSP). There is evidence that negative pressure ventilation (NPV) ESLP is superior to positive pressure ventilation (PPV) ESLP, with PPV inducing more significant ventilator-induced lung injury, pro-inflammatory cytokine production, pulmonary edema, and bullae formation. The NPV advantage is perhaps due to the homogenous distribution of intrathoracic pressure across the entire lung surface. The clinical safety and feasibility of a custom NPV-ESLP device have been demonstrated in a recent clinical trial involving extender criteria donor (ECD) human lungs. Herein, the use of this custom device is described in a juvenile porcine model of normothermic NPV-ESLP over a 12 h duration, paying particular attention to management techniques. Pre-surgical preparation, including ESLP software initialization, priming, and de-airing of the ESLP circuit, and the addition of anti-thrombotic, anti-microbial, and anti-inflammatory agents, is specified. The intraoperative techniques of central line insertion, lung biopsy, exsanguination, blood collection, cardiectomy, and pneumonectomy are described. Furthermore, particular focus is paid to anesthetic considerations, with anesthesia induction, maintenance, and dynamic modifications outlined. The protocol also specifies the custom device's initialization, maintenance, and termination of perfusion and ventilation. Dynamic organ management techniques, including alterations in ventilation and metabolic parameters to optimize organ function, are thoroughly described. Finally, the physiological and metabolic assessment of lung function is characterized and depicted in the representative results.

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

This paper describes a porcine model of negative pressure ventilation ex situ lung perfusion, including procurement, attachment, and management on the custom-made platform. Focus is made on anesthetic and surgical techniques, as well as troubleshooting.

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: 폐 기능 및 대사 평가

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ ...

Lung Rapid Recovery Procurement Combined with Abdominal Normothermic Regional Perfusion in Controlled Donation after Circulatory Death

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years confirm that the outcomes after lung transplantation from cDCD are similar to those from brain death donors; however, the utilization of lungs from asystole donors remains low. Several reasons may be involved: different legal frameworks among countries and centers with different premortem interventions, inadequate lung donor care before procurement, or even poor experience with cDCD procedures and protocols.
Initially, the rapid recovery technique was commonly employed for the procurement of thoracic and abdominal organs in cDCD, but, in the last decade, abdominal normothermic regional perfusion (ANRP) with extracorporeal membrane oxygenation devices has become a useful method to restore blood flow to abdominal organs, allowing their quality improvement and their functional assessment prior to transplantation. This makes the donation procedure more complex and generates doubts about injury to the grafts due to dual temperature.
The aim of this article is to describe a protocol based on a single center experience with Maastricht III donors combining lung cooling rapid recovery in the thorax and abdominal normothermic regional perfusion. Tips and tricks focused on premortem interventions and lung procurement procedure techniques are explained. This may help to minimize the reluctance among professionals to use this combined technique and encourage other donor centers to use it, despite the increased complexity of the procedure.

The protocol combines a lung cooling rapid recovery technique with abdominal normothermic regional perfusion for abdominal graft procurement in controlled asystole donors, which is a safe and useful method to expand the donor pool.

순환기 사망 후 통제된 기증에서 복부 정상 국소 관류와 결합된 폐 빠른 회복 조달

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years ...

Agarose-embedded vibratome section을 사용한 혁신적인 폐 이미징

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

저자 스포트라이트: Agarose Embedded Lung Tissue Section을 사용한 공간 단백질 발현 연구 

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...