저자는 암 유전체학 의 실험실의 구성원과 복잡한 질병의 바이오 컴퓨팅의 구성원에게 그들의 예리한 관측 입력및 이 프로젝트의 다른 단계에서 여러 토론에 참여하는 것에 대해 감사드립니다. 자금 지원에는 이스라엘 암 협회(M.F-M 2017-2019의 ICA 보조금)와 이스라엘 혁신 당국의 카민 보조금(M.F-M.)이 포함됩니다.

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

튜브, 선적 및 저장에 환자의 혈액의 수집은 액체 생검에 중요한 초기 단계입니다. 부적절한 취급은 플라즈마의 품질을 손상시킬 수 있으므로 액체생검(47)의결과를 방해할 수 있다. 혈액 샘플이 EDTA 혈액 관에서 수집되는 경우, 혈장은 WbCs의 리시스를 피하고혈장(48)으로게놈 DNA를 방출하기 위해 혈액 수집의 2 시간 이내에 분리되어야합니다. WbCs는 또한 더 긴 시...

기술 발전은 암 게놈 과 전사1의수백의 순서로 이끌어 냈습니다. 이것은 다른 암 모형2에걸쳐 분자 변경의 풍경을 이해하는 데 기여했습니다. 이러한 경관에 대한 추가 연구는 암 또는 종양 진행에 관여하는 순차적인 체세포 변경 및 유전자 유전자 융합3을 특징으로 하는 데 도움이 되었으며, 세포멸 경로4를연속적으로 방해함으로써. 따라서, 체세포 돌연변이 및 유전자-유전자 융합은 특정 종양 유형5에대한 개별 환자에서 바이오마커로 봉사하여 종양에 대한 정보를 제공할 수 있고, 기존의 1차 종양 예후6을식별하고, 분자변화에기초하여 이차 종양을 분류하고, 약물 종양표적8을식별한다. 이러한 정보는 암 환자를 위한 개인화된 치료를 선택하고 양성 및 음성 치료 반응을 결정하는 데 용이하게 할 수 있습니다9. 그러나, 종양 조직의 유전체 프로파일링을 식별하기 위한 종양 물질을 얻는 것은 침습적절차(10)이다. 더욱이, 종양 생검은 이질성 종양의 작은 부분만을 포함합니다; 따라서 전체종양(11)의분자 프로파일을 대표하지 않을 수 있다. 연쇄 모니터링 및 종양 지장화는 종양 조직의 반복된 수집을 필요로 하며, 이는 일반적으로 종양 생검 절차의 침습성 및 이러한 절차로부터 발생하는 안전 문제로 인해 실현 가능하지않다(12).
반면에 액체 생검 기술은 지난 10년 동안 정밀 종양학에서13,14로엄청난 주목을 받고 있습니다. 주로 이 기술의 비침습성, 그리고 여러 시간 지점에서 반복될 가능성으로 인해 질병과정(15,16)에대한 사용하기 쉽고 안전한 모니터링 기술을 가능하게 한다. 액체 생검은 종양 세포가 급속하게 증식하는 현상에 근거하고, 동시에 그들 중 많은 사람들이 세포증과 괴사를 겪는다. 이것은 apoptosis17도중 정확한 크기로 절단되는 DNA 파편과 더불어 환자의 혈액으로 세포 파편의 방출로 이끌어 냅니다. 비암 세포의 세포 이물질의 방출은 또한 혈액으로 의 세포 파편의 방출로 이끌어 내고, 그러나, 이 세포에 있는 세포 세포 비율은 종양 세포18보다는 상대적으로 훨씬 낮습니다. 액체 생검 기술의 합리적은 혈액에서 지속적으로 순환하는 DNA, RNA, 단백질 및 종양 세포14,19와 같은 종양 관련 분자를 포착하는 것입니다. 다양한기술(20)은 차세대 시퀀싱(NGS), 디지털 물방울 폴리머라제 연쇄 반응(ddPCR), 실시간 PCR 및 효소-연결된 면역조산 분석(ELISA)을 포함하는 이들 분자의 분석에 사용될 수 있다. 액체 생검 기술은 종양 세포의 특징인 바이오마커를 식별할 수 있게 합니다. 이러한 바이오마커 분자는 종양의 특정 부위에서 방출되는 것이 아니라종양(21)의모든 부분에서 방출된다. 따라서, 액체 생검에서 확인된 마커는 전체 이질성 종양의 분자 프로파일링을 나타내며, 신체의 다른 종양 이외에, 따라서 조직 생검 기반기술(22)에비해 이점을 갖는다.
cfDNA는 몇 분에서 1-2 시간23에이르는 순환 혈액에서 짧은 반감기 시간을 가지고 있습니다. 그러나 cfDNA의 짧은 반감기 시간은 치료 반응 및 동적 종양 평가를 평가하여 실시간 분석을 용이하게합니다. 종양 유래 cfDNA 수준은 cfDNA 수준과 생존 결과24사이의 관계를 보여 준 여러 연구에 의해 입증 된 종양 단계 / 크기의 예후를 나타냅니다. 더욱이, 연구 결과는 cfDNA가 기존 종양 마커25보다는더 나은 예측 능력을 가지고 있다는 것을 증명했습니다. cfDNA의 예후는 암 치료 후에 더욱 두드러지며, 치료 후 cfDNA의 높은 수준은 생존율이 감소되고 치료에 대한 저항과 잘 관련이 있습니다. 반면, cfDNA 다음 치료법의 낮은 수준은 일반적으로 양성 치료 반응에 해당합니다. 또한 cfDNA는 기존의 검출 방법보다 치료 반응의 조기 검출을 용이하게 합니다.
cfDNA는 암 관련 돌연변이의 조기 발견 가능성을 증가시킵니다: 초기 단계 질병15도중, 현상의 개시26 및 2 년 까지 암 진단 의 앞에2년 27까지. cfDNA는 다중 종양 영역 또는 초점으로부터 방출되기 때문에, 그 분석은28을나타내는 종양 게놈의 포괄적인 보기를 제공한다. 따라서, cfDNA는 조직 견본29에서놓쳤을 지도 모르다 체질 돌연변이를 검출할 수 있습니다. 종양 내 이질성 및 과열 돌연변이는 수천 개의 염기에 걸쳐 게놈 영역의 깊은 시퀀싱에 의해 검출될 수 있으므로, 따라서 cfDNA의 분석은 뚜렷한 게놈시그니처(13)를가진 특정 분자 아류형을 발견할 수 있게 한다. 조직 샘플을 통해 유사한 수준의 정보를 얻으려면 많은 고체 생검이 필요했을 것입니다.
더욱이, 수술 치료 및/또는 화학요법 후 결장, 난소 및 폐암과 같은 국소질환 환자의 cfDNA 수준은 암 재발 및 치료 결과에 대한 강력한 예후 마커로입증되었다(20). 더욱이, 결장, 유방 및 폐암환자에서, 혈액에서 cfDNA의 분석은 성공적으로 종양 특정 변경을 검출할 수 있었습니다, 이는 사전에 재발의 정확한 예측으로 이끌어13. 더욱이, 항EGFR 요법을 받는 CRC 환자에서 KRAS 돌연변이와 같은 치료 저항마커(30); 다양한 치료법으로 치료 후 유방암 환자에서 PIK3CA, MED1 또는 EGFR과 같은 유전자를 위한 VAFs(31); EGFR 표적TKIs(32)로 치료된 폐암 환자에서 EGFR T790M 저항돌연변이도 cfDNA 분석에 의해 확인될 수 있다.
요약하자면, cfDNA 분석은 종양학13, 33의분야에서 정확한 바이오마커를 식별하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜에서, 3개의 신경교종 환자의 혈액 샘플 및 3개의 건강한 통제는 혈장에서 WbCs 및 cfDNA에게서 게놈 DNA를 얻기 위하여 처리되었습니다. 신경교암에서, IDH, TERT, ATRX, EGFR 및 TP53의 돌연변이는 신경교종 종양의 조기 진단에 도움이 될 수 있는 예후 마커뿐만 아니라 진단역할을 하며, 다른 유형의 신경교종 종양을 분류하고, 개별 환자를 위한 정확한 치료를 안내하고 치료 반응34,35을이해한다. 이 유전자의 돌연변이 상태는 혈액 유래 cfDNA를 사용하여 확인할 수 있습니다. 본 원고에서는, 우리는 신경교종 암(12)에있는 돌연변이 변경을 공부하기 위해 이용된 혈장 유래 cfDNA의 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 문서에서 설명된 이러한 cfDNA 기반 액체 생검 프로토콜은 다른 많은 유형의 암에서 돌연변이 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 최근 연구는 cfDNA 기지를 둔 액체 생검이 암36의50의 다른 모형을 검출할 수 있다는 것을 보여주었습니다.
혈액 샘플 수집, 저장 및 선적은 이러한 단계 동안 제어되지 않은 온도가 WBC의 리시스를 일으켜 WBC에서 혈장으로 게놈 DNA를 방출하고 cfDNA 샘플의 오염을 유발하기 때문에 이 프로토콜에서 중요한 단계이며, 이는절차(37)의나머지 부분에 영향을 미친다. 제어되지 않은 온도로 인한 혈류용액은 PCR단계(38)와같은 cfDNA의 하류 시료 준비 과정을 손상시킬 수 있다. 혈청은 혈장보다는 생식선 cfDNA의 높은 비율을 포함하지만 종양 관련 cfDNA39에대한 큰 배경 잡음이 나타난다. 따라서 종양 관련 cfDNA를 분리하기 위해 혈장은 적합한샘플(39)이다. 혈액 수집 튜브를 포함하는 항 응고제에서 그려진 혈액은 플라즈마를 분리하고 cfDNA 오염을 피하기 위해 즉시 또는 최대 2 시간 이내에 원심 분리되어야합니다. 이 프로토콜에서, 전용 상용 cfDNA 보존 혈액 수집 튜브가 사용됩니다 (재료의 표참조), 이는 혈액 수집 튜브를 포함하는 항응고제에 대한 대안이다. 이러한 전용 혈액 수집 튜브는 cfDNA 및 cfRNA를 보존하고, 주변 온도에서 최대 30일, 최대 8일 동안 37°C에서 WbC의 용액을 방지합니다. 이를 통해 혈액 샘플 선적 시 및 플라즈마 및 WBC가 분리될 때까지 적절한 온도를 유지할 수 있습니다40.
현재 사용 가능한 cfDNA 추출 방법론에는 위상 격리, 실리콘 멤브레인 기반 스핀 컬럼 및 자기 비드 기반절연(41)의세 가지 유형이 있습니다. 실리콘 멤브레인 기반 스핀 컬럼 방법은 다른 cfDNA 추출 방법에 비해 높은 무결성을 가진 높은 양의 cfDNA를산출하였다(42).
DNA의 정량적 평가는 액체 생검의 근본적인 요구 사항이며, 쉽게 구현하고 광범위한 사용을 위해 간단하고 저렴하며 표준화 된 절차를 개발할 필요가 있습니다. cfDNA 정량화를 위해 일반적으로 사용되는 세 가지 방법은 분광광측정, 형광및 qPCR이다. 불소측정 방법은 정확도, 비용 및 전도의 용이성에 관한 다른 방법에 대해 더 잘입증된다(43).
cfDNA의 무결성과 순도는 아가로즈 전기포고증 또는 모세관 전기포에 의해 추정될 수 있다. 아가로스 전기 포근은 cfDNA의 낮은 농도에서 감도를 나타내지 않으며 cfDNA의 정확한 단편 크기를 표시하는 고해상도가 없습니다. 한편, 모세관 전기포는 관련 과제를 극복함으로써 아가로산 전기포에 비해 이점이 있으며, 따라서 연구원이 cfDNA 단편 크기 분석을 위해 널리 사용되고 있다. 이 프로토콜에서, 절연 된 cfDNA의 단편 크기 분포는 자동화 된 모세관 전기 포근 계측기를 사용하여 추정되었다 (재료의 표참조).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Clip for Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5042-1398</td>
			<td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td>
			<td>Norgen Biotek Corp.</td>
			<td>63950</td>
			<td>Norgen&#39;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&#8212; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Cleaner Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for Gel Matrix</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>185-5990</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Basic Chip Vortex</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>MS-3-S36</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740952.5</td>
			<td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells 
			(e.g., bacteria), and many other sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac Connecting System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19419</td>
			<td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>84010</td>
			<td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (96&#8211;100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block or similar at 56 &#176;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (adjustable)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

암 환자의 종양에 있는 돌연변이를 확인하는 것은 질병 관리에 있는 아주 중요한 단계입니다. 이 돌연변이는 암 환자에 있는 처리 선택 그리고 그것의 반응을 위한 종양 진단을 위한 biomarkers 역할을 합니다. 종양 돌연변이를 검출하기 위한 현재 금 표준 방법은 종양 생검을 통해 종양 DNA의 유전 시험을 관련시킵니다. 그러나, 이러한 침습적 방법은 종양 돌연변이 레퍼토리의 후속 시험으로서 반복적으로 수행되기 어렵다. 액체 생검은 사용하기 쉽고 비 침습적 생검 접근법으로 종양 돌연변이를 검출하기위한 새롭고 새로운 기술입니다.
암세포는 급속하게 번식합니다. 동시에, 수많은 암세포는 세포멸을 겪습니다. 이 세포에서 파편은 종양 DNA 돌연변이를 전송하는 세포 없는 DNA (cfDNA) 단편에게 불린 섬세하게 단편화된 DNA 조각과 더불어 환자의 순환 계통으로 풀어 놓입니다. 따라서 액체 생검 기술을 사용하여 cfDNA 기반 바이오마커를 식별하기 위해 혈액 샘플을 암 환자로부터 수집하고 혈장 및 버피 코트의 분리가 뒤따릅니다. 다음으로, 혈장은 cfDNA의 분리를 위해 처리되고, 각각의 버피 코트는 환자의 게놈 DNA의 분리를 위해 처리된다. 두 핵산 샘플은 그 때 그들의 양과 질을 위해 검사됩니다; 차세대 염기서열분석(NGS) 기술을 이용한 돌연변이를 분석하였다.
이 원고에서는 혈액 수집, 혈장 및 버피 코트 분리, cfDNA 및 생식선 DNA 추출, cfDNA 또는 생식선 DNA의 정량화 및 cfDNA 단편 농축 분석을 포함한 액체 생검에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

플라즈마 분리 cfDNA 또는 cfRNA 방부제 관에서 채취한 8.5-9 mL 혈액은 부피에서 ~4mL 플라즈마 주위의 수율을 냅니다. EDTA 튜브에서 채취한 혈액으로부터 분리된 혈장의 양은 온도에 따라 달라질 수 있다. 37°C 이상의 온도에서 혈액을 함유하는 EDTA 튜브의 노출은 혈장 부피수율(44)을감소시다.
불소계 분석 결과 각 신경교종 환자의 1mL...

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Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

이 논문에서 우리는 혈액 수집, 혈장 및 버피 코트 분리, cfDNA 및 생식선 DNA 추출, cfDNA 또는 생식선 DNA의 정량화 및 cfDNA 단편 농축 분석을 포함한 비 침습적 액체 생검 기술에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

detection-of-cell-free-dna-in-blood-plasma-samples-of-cancer-patients

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.8K 조회수.  Bar-Ilan University. 이 논문에서 우리는 혈액 수집, 혈장 및 버피 코트 분리, cfDNA 및 생식선 DNA 추출, cfDNA 또는 생식선 DNA의 정량화 및 cfDNA 단편 농축 분석을 포함한 비 침습적 액체 생검 기술에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

비디오: Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

소변 샘플에서 셀 무료 DNA 무결성 분석

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

연구

암 연구학

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Testing for PD-L1 expression with the PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C3 companion diagnostic assay, which gives a tumor proportion score (TPS), has been validated on tumor tissue. We developed an optimized laboratory-developed test (LDT) that uses the 22C3 antibody (Ab) concentrate on a widely available IHC autostainer for biopsy and cytology specimens. The PD-L1 TPS was evaluated with 120 paired whole-tumor tissue sections and biopsy samples and with 70 paired biopsy and cytology samples (bronchial washes, n = 40; pleural effusions, n = 30). The 22C3 Ab concentrate-based LDT showed a high concordance rate between biopsy (~100%) and cytology (~95%) specimens when compared to PD-L1 IHC expression determined using the PD-L1 IHC 22C3 companion assay at both TPS cut points (&#8805;1%, &#8805;50%). The optimized LDT presented here, using the 22C3 Ab concentrate to determine the PD-L1 expression in both tumor tissue and in cytology specimens, will expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with NSCLC for treatment with pembrolizumab monotherapy in a reliable and reproducible manner.

To expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with lung cancer for treatment with pembrolizumab, in a reliable and reproducible manner, we developed an assay that uses the 22C3 antibody concentrate on a widely available immunohistochemical autostainer, for both biopsy and cytology specimens.

22C 3를 사용 하 여 반대로 PD L1 항 체 생 검 및 비 작은 세포 폐 암 환자에서 세포학 샘플에 집중

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful biomarkers for clinical practice. Here, we present a protocol to extract, reverse transcribe and evaluate the expression levels of circulating miRNAs from plasma samples of patients with colorectal cancer (CRC). microRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs of 18-25 nucleotides in length that regulate the expression of target genes at the translational level and play an important role, including that of pro- and anti-angiogenic function, in the physiopathology of various organs. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and treatment decision-making and monitoring. Circulating miRNA extraction was performed using a rapid and effective method that involves both organic and column-based methodologies. For miRNA retrotranscription, we used a multi-step procedure that considers polyadenylation at 3&#39; and the ligation of an adapter at 5&#39; of the mature miRNAs, followed by random miRNA pre-amplification. We selected a 24-miRNA custom panel to be tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and spotted the miRNA probes on array custom plates. We performed qRT-PCR plate runs on a real-time PCR System. Housekeeping miRNAs for normalization were selected using GeNorm software (v. 3.2). Data were analyzed using Expression suite software (v 1.1) and statistical analyses were performed. The method proved to be reliable and technically robust and could be useful to evaluate biomarker levels in liquid samples such as plasma and/or serum.

We present a protocol to evaluate the expression levels of circulating microRNA (miRNAs) in plasma samples from cancer patients. In particular, we used a commercially available kit for circulating miRNA extraction and reverse transcription. Finally, we analyzed a panel of 24 selected miRNAs using real-time pre-spotted probe custom plates.

전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

대변 DNA 무결성 검출에 의한 대장암 위험 및 유병률 평가

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from healthy mice as well as mice with AML driven by MLL-AF9. Specifically, we describe a two-step cell staining process, whereby healthy or leukemia BM cells are first stained with a fluorogenic dye that detects mitochondrial superoxides, followed by staining with fluorochrome-linked monoclonal antibodies that are used to distinguish various healthy and malignant hematopoietic progenitor populations. We also provide a strategy for acquiring and analyzing the samples by flow cytometry. The entire protocol can be carried out in a timeframe as short as 3-4 h. We also highlight the key variables to consider as well as the advantages and limitations of monitoring ROS production in the mitochondrial compartment of live hematopoietic and leukemia stem and progenitor subpopulations using fluorogenic dyes by flow cytometry. Furthermore, we present data that mitochondrial ROS abundance varies among distinct healthy HSPC sub-populations and leukemia progenitors and discuss the possible applications of this technique in hematologic research.

We describe a method for using multiparameter flow cytometry to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in murine healthy hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and leukemia cells from a mouse model of acute myeloid leukemia (AML) driven by MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, protein amounts, or other relevant molecules. These methods have shown to be substantial alternatives to PCR or ELISA for clinical and research applications. Moreover, the detection of protein amount (by Western blot or immunohistochemistry) is often insufficient to provide information for cancer diagnosis, whereas the measurement of enzyme activity represents a valuable biomarker. Measurement of enzyme activity also allows for the diagnosis and potential treatment of pathogen-borne diseases. In all eukaryotes, topoisomerases are the key DNA-binding enzymes involved in the control of the DNA topological state during important cellular processes and are among the important biomarkers for cancer prognosis and treatment.
Over the years, topoisomerases have been substantially investigated as a potential target of antiparasitic and anticancer drugs with libraries of natural and synthetic small-molecule compounds that are investigated every year. Here, the rolling circle amplification method, termed rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay that allows for the quantitative measurement of topoisomerase 1 (TOP1) activity in a simple, fast, and gel-free manner is presented.By cleaving and ligating a specially designed DNA substrate, TOP1 converts a DNA oligonucleotide into a closed circle, which becomes the template for rolling circle amplification, yielding ~103 tandem repeat rolling circle products. Depending on the nucleotide incorporation during the amplification, there is the possibility of different readout methods, from fluorescence to chemiluminescence to colorimetric. As each TOP1-mediated cleavage-ligation generates one closed DNA circle, the assay is highly sensitive and directly quantitative.

A protocol for the sensitive and quantitative detection of topoisomerase 1 activity using the rolling circle enhanced enzyme activity detection assay is described. The method allows detection of topoisomerase 1 activity from purified components or cell/tissue extracts. This protocol has wide-ranging applications in any field involving detection of enzymatic activity.

간단하고 빠른 롤링 서클 증폭 기반 조잡한 생물학적 시료에서 토포이소머라제 1 활성 검출

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...

cell-free DNA를 이용한 유리체 망막 림프종 진단

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To diagnose VRL, specimens such as vitreous humor and, more recently, aqueous humor are collected. Diagnostic testing for VRL on these specimens includes cytology, flow cytometry, and molecular testing. However, both cytopathology and flow cytometry, along with molecular testing using cellular DNA, necessitate intact whole cells. The challenge lies in the fact that vitreous and aqueous humor typically have low cellularity, and many cells get destroyed during collection, storage, and processing. Moreover, these specimens pose additional difficulties for molecular testing due to the high viscosity of vitreous humor and the low volume of both vitreous and aqueous humor. This study proposes a method for extracting cell-free DNA from vitreous and aqueous specimens. This approach complements the extraction of cellular DNA or allows the cellular component of these specimens to be utilized for other diagnostic methods, including cytology and flow cytometry.

저자 스포트라이트: 유리체액에서 Cell-Free DNA 추출을 사용한 VRL 진단 발전 

A procedure to extract cell-free DNA from vitreous and aqueous humor to perform molecular studies for diagnosing vitreoretinal lymphoma is established here. The method offers the ability to concurrently extract DNA from the cellular component of the sample or to reserve it for ancillary testing.

유리체 망막 림프종의 진단 및 모니터링을 위한 유리체 및 수성 체액 검체의 Cell-Free DNA 추출

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...

Methods Article

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출