연구를 인정 하는 저자는 vivo에서 마이크로-코네티컷 자금 NSERC 발견 그랜트 (#05573)와 혁신 (#222084) 캐나다 재단에서 자금 우리 구는 뼈와 근육 발달에 캐나다 연구의 자.

이 연구는 동물 관리 위원회의 브록 대학에 의해 승인 되었고 동물 관리 21에 캐나다 위원회에 의해 설립 하는 지침에 따라 실시.
1입니다. 마 취 Isoflurane 가스를 사용 하 여
<ol><li>미리 마 취 기계 (보충 그림 1)에서 약 1-2 L/분의 연속 흐름 속도에서 높은-품질 O2 아크릴 유리 외피 챔버를 작성.</li>
	<li>보육 실 꼬리에 쥐를 먼저 전송 하 고 밀폐 인감을 만들려고 보육 실 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>3-4 %v / v O2 1-2 L/분 (보충 그림 1)의 연속 흐름 율에에서 녹아에서 수의학 학년 isoflurane 인큐베이션 챔버 채우기 위해 시작 합니다. 주의: 폐기물 마 취 가스 처리기 저하 수 있습니다. 청소 시스템 (즉, 목탄 필터 또는 배기 연기 후드에 직접) 자리에 항상 있어야 합니다.</li>
	<li>쥐 이면 서 있을 수 더 이상 전송 얼굴 마스크 또는 코 콘 1-3 %isoflurane 받는 쥐 쥐 1-2 L/분의 유량에 O2 에 주로 녹아 코 등을 통해 호흡 하는 얼굴 마스크 또는 코 코는 적용으로 콘, 충분 한 마 취 배달 될 것입니다.</li>
	<li>이스케이프 isoflurane 가스에서 그들을 보호 하기 위해 눈의 섬세 한 막 눈 윤 활을 적용 합니다. 참고: 확인 하십시오 안과 윤 활 항생제 없이이 개입에서 결과 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
	<li>종을 (눈 종을 개통의 부드러운 자극에 응답 깜박이)를 측정 하 고 페달 (응답 곤란으로 뒷 다리 사지의 철수) 반사; 마 취의 깊이 증가 함께 종을 반사는 될 전에 결 석 페달 반사 (보충 그림 2).</li>
	<li>마 취의 적절 한 수준에 도달할 때 쥐 십시오 및 페달 반사 잃은 유지 쥐 0.5-2% isoflurane 1-2 L/min의 유량에 O2 에 녹아.</li>
	<li>지속적으로 내부 모니터링 시스템으로 직접 또는 라이브-비디오 피드 (보충 그림 3)을 통해 쥐에 시각적 상수를 유지 하 여 절차를 통해 쥐의 호흡 속도 모니터링 합니다.</li>
</ol>2. 위치 및 쥐 뒷 다리의 구속
<ol><li>탄소 섬유 스캐너 평판 (보충 그림 4)에서 부정사 위치에 쥐를 하다.</li>
	<li>오른쪽 발을 억제에 전성, 튜브의 끝에서 연장 하는 발가락과 튜브, 거품. 치과 왁 스 거품 내 단단히 발을 보유 하 고 긴밀 하 게 폐쇄 튜브 테이프를 적용 합니다. 발을 들고 튜브의 직경 플라스틱 관으로 단단히 맞게 충분히 인지 확인 합니다.</li>
	<li>엑스레이 스캐너 평판 (보충 그림 5)에 플라스틱 튜브를 밀어.</li>
	<li>때까지 긴장 된 쥐 뒷 다리를 확장 합니다. -이 보람된 호흡으로 인해 사지에 무의식적인 움직임 유도 수로 쥐 (보충 그림 5)에 어떤 해를 원인으로 다리를 확장 하지 않습니다.</li>
	<li>보기의 검색 필드에서 꼬리, 몸통을 향해 함께 왼쪽된 다리 (뒷 다리 사지 비 스캔)를 당겨 검사할 확장된 다리에서.</li>
	<li>보안 왼쪽된 다리 (뒷 다리 사지 비 검사) 및 마스킹 테이프를 사용 하 여 위치에 꼬리. 사용 하지 마십시오 (즉, 덕트 테이프 또는 화가의 테이프) 아무것도 다소 끈 적 때에 이러한 자료는 중 쥐를 해칠 것입니다 (덕트 테이프)를 제거 하거나 (화가의 테이프) 충분히 강한 파악을 제공 하지 (보충 그림 6).</li>
	<li>엉덩이, 어깨, 및 마스킹 테이프와 함께 머리에 쥐 시체를 보호 합니다. 얼굴 마스크 또는 코 콘 쥐 (보충 그림 6)를 보호 합니다. 참고: 쥐 모피에 충실 하는 기능을 제거 하려면 마스킹 테이프의 접착 면을 오 점. 스캐닝 침대에 단단히 확보 수 있도록 마스킹 테이프의 끝을 오 점 하지 않습니다.</li>
	<li>랩 제한 열 손실 (보충 그림 6) 하 수 의사 포장에 쥐. 참고: 일반 마 취, 아래 때 쥐 몸 무게 비율 19,20그들의 큰 표면 때문에 빠르게 열 손실.</li>
	<li>지속적으로 (중 직접 또는 라이브 비디오 피드) 쥐에 시각적 상수를 유지 하 여 절차를 통해 쥐의 호흡 속도 모니터링 합니다. 참고: 여기 설정 5 분 소요, 검색 인수는 인수 설정에 따라 다릅니다, 및 복구 시간은 60 분입니다.</li>
	<li>µCT 이미지를 진행 합니다. 그러나 참고: 검색 인수에 대 한 정확한 규격은 각 스캐너에 특정 유형, 소프트웨어 시스템 및 특정 연구 질문,, 몇몇 방법론 간행물 문학 1,2 에 걸쳐 존재 , 9.</li>
</ol>3입니다. 마 취에서 회복
<ol><li>Vivo에서 µCT 검색 완료 되 면, 쥐를 isoflurane의 흐름을 중지 하지만 O2의 1-2 L/min 흐름을 유지 합니다.</li>
	<li>쥐 차릴 모터 제어 (1-2 분)은 인공 호흡기에서 제거 하 고 낮은 열에서 범용 생리대에 부분적으로 배치에 개별적으로 복구할 수 있도록 키를 누릅니다. 쥐 때 일반 마 취 제19에서 1 ° C로 체온을 줄이기 위해 알려져 있습니다. 두지 마십시오 쥐 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 참고: 우리 연구 그룹에서 일화 적인 증거 보고 먹고 시작 직후 isoflurane 마 취에서 회복 쥐 하 고 그래서 그것은 그들의 음식 및 물 복구 하는 동안 그들에 게 제공 하는 것이 중요 합니다. 비록 우리가이 동작을 관찰 해야, 반복된 전신은 음식 섭취 또는 몸 무게 1,9에 크게 증가 발생 하지 않습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Longo, A. B., Sacco, S. M., Salmon, P. L., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+use+of+micro-computed+tomography+does+not+alter+microarchitecture+of+the+proximal+tibia+in+sham+or+ovariectomized+sprague-dawley+rats.">Longitudinal use of micro-computed tomography does not alter microarchitecture of the proximal tibia in sham or ovariectomized sprague-dawley rats.</a> Calcif Tissue Int. 98 (6), 631-641 (2016).</li><li>Sacco, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+irradiation+from+micro-computed+tomography+scanning+at+2,+4+and+6+months+of+age+does+not+induce+damage+to+tibial+bone+microstructure+in+male+and+female+CD-1+mice.">Repeated irradiation from micro-computed tomography scanning at 2, 4 and 6 months of age does not induce damage to tibial bone microstructure in male and female CD-1 mice.</a> Bonekey Rep. 6, 855 (2017).</li><li>Waarsing, J. H., Day, J. S., Verhaar, J. A., Ederveen, A. G., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+loss+dynamics+result+in+trabecular+alignment+in+aging+and+ovariectomized+rats.">Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats.</a> J Orthop Res. 24 (5), 926-935 (2006).</li><li>Klinck, R. J., Campbell, G. M., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+effects+on+bone+architecture+in+mice+and+rats+resulting+from+in+vivo+micro-computed+tomography+scanning.">Radiation effects on bone architecture in mice and rats resulting from in vivo micro-computed tomography scanning.</a> Med Eng Phys. 30 (7), 888-895 (2008).</li><li>Laperre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+micro-CT+protocols+for+in+vivo+follow-up+of+mouse+bone+architecture+without+major+radiation+side+effects.">Development of micro-CT protocols for in vivo follow-up of mouse bone architecture without major radiation side effects.</a> Bone. 49 (4), 613-622 (2011).</li><li>Brouwers, J. E., van Rietbergen, B., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+effects+of+in+vivo+micro-CT+radiation+on+structural+parameters+and+bone+marrow+cells+in+proximal+tibia+of+wistar+rats+detected+after+eight+weekly+scans.">No effects of in vivo micro-CT radiation on structural parameters and bone marrow cells in proximal tibia of wistar rats detected after eight weekly scans.</a> J Orthop Res. 25 (10), 1325-1332 (2007).</li><li>Francisco, J. I., Yu, Y., Oliver, R. A., Walsh, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+age,+skeletal+site,+and+time+post-ovariectomy+on+bone+mineral+and+trabecular+microarchitecture+in+rats.">Relationship between age, skeletal site, and time post-ovariectomy on bone mineral and trabecular microarchitecture in rats.</a> J Orthop Res. 29 (2), 189-196 (2011).</li><li>Altman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+skeletal+growth,+modeling,+and+remodeling+by+in+vivo+micro+computed+tomography.">Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro computed tomography.</a> Bone. 81, 370-379 (2015).</li><li>Longo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+intake+of+flaxseed+or+menhaden+oil+to+provide+varying+n-6+to+n-3+PUFA+ratios+modulate+bone+microarchitecture+during+growth,+but+not+after+OVX+in+Sprague-Dawley+rats.">Lifelong intake of flaxseed or menhaden oil to provide varying n-6 to n-3 PUFA ratios modulate bone microarchitecture during growth, but not after OVX in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Nutr Food Res. 61 (8), (2017).</li><li>Sacco, S. M., Saint, C., LeBlanc, P. J., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+consumption+of+hesperidin+and+naringin+flavanones+exerts+transient+effects+to+tibia+bone+structure+in+female+CD-1+offspring.">Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring.</a> Nutrients. 9 (3), 250 (2017).</li><li>Campbell, G. M., Buie, H. R., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+irreversible+architectural+changes+occur+early+in+the+development+of+experimental+osteoporosis+as+assessed+by+in+vivo+micro-CT.">Signs of irreversible architectural changes occur early in the development of experimental osteoporosis as assessed by in vivo micro-CT.</a> Osteoporos Int. 19 (10), 1409-1419 (2008).</li><li>De Schaepdrijver, L., Delille, P., Geys, H., Boehringer-Shahidi, C., Vanhove, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+longitudinal+micro-CT+study+of+bent+long+limb+bones+in+rat+offspring.">In vivo longitudinal micro-CT study of bent long limb bones in rat offspring.</a> Reprod Toxicol. 46, 91-97 (2014).</li><li>Perilli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+early+bone+changes+using+in+vivo+micro-CT+in+ovariectomized,+zoledronic+acid-treated,+and+sham-operated+rats.">Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized, zoledronic acid-treated, and sham-operated rats.</a> Osteoporos Int. 21 (8), 1371-1382 (2010).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>Li, H., Zhang, H., Tang, Z., Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-computed+tomography+for+small+animal+imaging:+Technological+details.">Micro-computed tomography for small animal imaging: Technological details.</a> Progress in Natural Science. 18 (5), 513-521 (2008).</li><li>Campbell, G. M., Sophocleous, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+bone+and+soft+tissue+by+micro-computed+tomography:+applications+to+ex+vivo+and+in+vivo+studies.">Quantitative analysis of bone and soft tissue by micro-computed tomography: applications to ex vivo and in vivo studies.</a> Bonekey Rep. 3, 564 (2014).</li><li>Meganck, J. A., Kozloff, K. M., Thornton, M. M., Broski, S. M., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+hardening+artifacts+in+micro-computed+tomography+scanning+can+be+reduced+by+X-ray+beam+filtration+and+the+resulting+images+can+be+used+to+accurately+measure+BMD.">Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD.</a> Bone. 45 (6), 1104-1116 (2009).</li><li>Vazquez, C. M., Molina, M. T., Ilundain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+rat+large+intestine+in+reducing+diarrhea+after+50%+or+80%+distal+small+bowel+resection.">Role of rat large intestine in reducing diarrhea after 50% or 80% distal small bowel resection.</a> Dig Dis Sci. 34 (11), 1713-1719 (1989).</li><li>Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+isoflurane,+ketamine-xylazine+and+a+combination+of+medetomidine,+midazolam+and+fentanyl+on+physiological+variables+continuously+measured+by+telemetry+in+Wistar+rats.">Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats.</a> BMC Vet Res. 10, 198 (2014).</li><li>Schmitz, S., Tacke, S., Guth, B., Henke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+physiological+parameters+and+anaesthesia+specific+observations+during+isoflurane,+ketamine-xylazine+or+medetomidine-midazolam-fentanyl+anaesthesia+in+male+guinea+pigs.">Comparison of physiological parameters and anaesthesia specific observations during isoflurane, ketamine-xylazine or medetomidine-midazolam-fentanyl anaesthesia in male guinea pigs.</a> PLoS One. 11 (9), e0161258 (2016).</li><li>Stevens, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+toxicities+of+halothane,+isoflurane,+and+diethyl+ether+at+subanesthetic+concentrations+in+laboratory+animals.">Comparative toxicities of halothane, isoflurane, and diethyl ether at subanesthetic concentrations in laboratory animals.</a> Anesthesiology. 42 (4), 408-419 (1975).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 vivo에서 µCT 뒷 다리 사지의 스캔 하는 동안 적절 한 마 취, 배치, 및 쥐의 구속에 대 한 첫 번째 자세한 지침과 시청자 들을 제공 합니다. 이러한 지침 높은 해상도 얻기 위해 비보에 µCT 검사 시스템의 사용자와 경골 뼈 3 차원 마이크로-아키텍처의 정량화에 대 한 처리 수의 높은 품질의 이미지를 사용 합니다. 중요 한 단계는 부자연 스러운 위치에만 적절 한 위치와 구속까지 긴장 된, 다른 모든 중요 한 구조에서 뒷 다리를 확장 뿐만 아니라 쥐의 적절 한 마 취를 포함 하는 보장 하기 위해 필요한 프로토콜. 최적의 이미지 결과 대 한 쥐, 완전 한 이완을 취 수 하 고 십시오, 페달 반사 손실 됩니다 필수적입니다. 또한, 스캐닝 다리를 확장 해야 하 고 거품에는 제 지 한다 전체 발과 발목. 스캐닝 다리의 최적의 위치를 달성 하기 위해 위에서 설명한 방법을 보장 됩니다: 1) 연구에서 쥐의 뒷 다리 사지는 일관 되 게 같은 방향으로, 따라서 허용 회전 각 다리의 같은 영역을 통과 하 x 선 빔 지향 주위에 샘플; 2) 모두 자발적이 고 무의식적인 뒷 다리 사지 운동의 발생 하지, 따라서 운동 아티팩트 획득된 이미지;의 품질을 방해에 대 한 가능성을 최소화 3) 장애물 개체 (즉, 꼬리)에서 부정확 한 골밀도 TMD 측정 생산 부분 볼륨 효과 대 한 가능성을 최소화 수 없습니다. 이러한 지침 isoflurane 신진 대사와 포지셔닝의 속도 긴장과 몸 크기 22에 따라 다 수 각 개별 쥐, 수정할 수 있습니다. 가장 일반적인 생체 내에서 스캐닝 기계는 작은 동물 모델을 위한 (즉, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니 피그) 다른 동물 크기의 검색을 허용 하도록 상호 동물 단계를 있을 것 이다. 따라서, 그들은 몸 무게의 넓은 범위를 수용할 수 있습니다.
비록 vivo에서 µCT 검색 위치를 변경 하 여 초기 검사에서 얻은 이미지 품질, 있다면 다시 검색 쥐에 대 한 허가 반복 스캔에 대 한 방사선 및 isoflurane 마 취의 추가 복용에 쥐 노출 됩니다 시간의 연장된 기간입니다. 쥐 경골에 초점을 맞춘 4 개월 동안 600 mGy의 월간 반복된 방사선 노출 마이크로-아키텍처 contralateral 뒷 다리 1에 비해 뼈를 불리 한 효과 발생 하지 않습니다. 하지만이 두 스캔에 반복의 안전을 확인 하지 않습니다. 즉각적인 계승입니다. 설명 된 기술의 더 한계 뼈 구조에서 몇 가지 변화를 호출할 수 있습니다 아직도, 그것을 유지 하는 그것에 적용 된 힘과 긴장 된 뒷 다리를 확장 하는 필요를 포함 합니다. 월간 반복 vivo에서 µCT 이미징 한 뒷 다리의 관련 된 우리의 실험실에서 이전 연구는 대뇌 피 질에서 차이 결과 동안 스캔 하는 동안 뒷 다리 사지의의 심각도 각 연구 목적에 따라 달라 집니다, 마이크로 건축 매개 변수, 편심, 반복된 확장, 안정화 및 1스캔 받아야 하지 않았다 contralateral 뒷 다리에 비해. 이심률은 타원형 모양의 외피 뼈 및 로드 베어링을 변경에 대 한 응답 변경의 측정 이다. 따라서, 위치에 대 한 뒷 다리의 제 지의이 방법을 사용 하 여 반복 vivo에서 µCT 이미징, 고려 여야 한다 평가 하 고 해석 로드 베어링 마이크로 건축 매개 변수를 변경 하면.
위의 지침 이미징 및 뼈 조직의 분석 제공 되었다, 하는 동안 뒷 다리 사지의 부드러운 조직 이미징 때 프로토콜에 약간의 조정 제출 되어야 합니다. 특히, 있는 뒷 다리는 몸통에서 확장 이며 절제 된 방법 합니다 수 고려, 현재 프로시저 misshapes 스캔의 기간에 대 한 비정상적인 위치에 연부 조직 (근육, 지방 조직)의 방향으로. 따라서, 뒷 다리 사지의 부드러운 조직의 이미징에 사용 하기 위해이 모델을 추정 하는 경우 일부 조정 여야 한다 감소 하거나 서로 관하여 조직의 위치 변화 제거 억제 기술.
그러나 또한, 지침 작성 되었습니다 특히 기반 연구 그룹의 경험에,, 다른 상용 vivo에서 µCT 스캐너에 맞게 수정할 수 있습니다. 다른 제안된 방법 놓고 뒷 다리를 제 지 하는 시스템을 스캔 vivo에서 µCT의 제조 업체에 의해 사용할 수 있습니다. µCT 단위를 상업적으로 사용할 수 있는 비보에 폴 리 프로필 렌, 확장 된 폴리스 티 렌, 기입 하 고는 돌기를 치과 왁 스와 함께 플라스틱 튜브 허용 재료와 스캔 다리 억제 방법으로 발. 그러나,이 프로토콜에 표시 하는 방법을 제공 하는 더 많은 제어 하 고 일관 된 위치 및 스캔된 다리의 구속 그리고, 일관 되 게 높은 품질의 이미지를 생산. 현재의 방법에서 제시 하는 지침 쥐는 기화 기, 튜브, 마스크, 유도 챔버, 산소 등의 마 취에 필요한 특수 장비를 필요로 합니다. 장비는 주사 마 취약에 비해 다소 높은 비용으로 연결 되어, 있지만 수 연구원은 신속 하 고 정확 하 게 유도 대안 이점을 제공 하는 의식의 특정 깊이에서 취 수 방법입니다.
고해상도 vivo에서 µCT 기술을 이용 하는 연구원은 그들의 개입을 조사 비디오, 현재 방법에 설명 된 지침을 사용 하 여 관심의 것 이다 수 제대로 일관 되 게 동양 고 높은 쥐 뒷 다리를 제 지 품질 x 선 이미지입니다. 이 µCT 이미지 수집 vivo에서 의 분야에서 연속체를 제공 하 고 일관성과 정확성 연구 내에서 최적화 향해 한 걸음으로 문학에 있는 학문 간 비교를 사용할 수 있도록. 마찬가지로, 비록 일부 변경이 필요한 2,10것 쥐를 포함 하 여 다른 설치류 종에 사용 하기 위해 이러한 프로토콜 및 방법을 확장할 수 있습니다. 예를 들어 거품 튜브에 발 감 검색 중 다리 움직임의 가능성을 최소화 하기 위해 발목을 포함할 수 있습니다. 또한, 전체 발 거품 소유자에 맞습니다. 따라서, 그들은 쥐의 발을 보호 하는 경우 처럼 발가락 홀더 쪽으로 확장 하지 않습니다. 또한, 마우스의 시체는 쥐로 테이프와 같은 구속을 필요 하지 않습니다. 스캔 하는 동안 마우스에 마 취를 유지 하기 위한 작은 코 콘을 사용할 수 있습니다. 작은 코 콘 사용할 수 없는 경우 하나 사용할 수 원뿔에 니트 릴 장갑 보안 하 고 코 주위 물개를 유지 하면서 마 취를 제공 하기 위해 마우스의 코를 들어갈 수 있는 공간을 제공 하는 장갑에 작은 절 개를 만들 수 있습니다.
대 퇴 골, 요 추 등 다른 골격 사이트의 적절 하 고 일관 된 위치에 대 한 지침을 조사 및 설립 근 위 경골은 뼈 쥐에서 마이크로 구조 변경의 주요 사이트, 문학에 있는 일관성. 그러나, 요 추 척추의 이미지를 포함 하는 미래 연구에 착수할 때 고려 되어야 합니다 이미징 척추의 주변 장기와 조직에 방사선 노출을 제공.

Vivo에서 마이크로-단층 (µCT)를 사용 하 여 비파괴 이미징의 설치류 모델을 사용 하 여 높은 해상도에서 내부 구조를 포함 하는 강력한 도구입니다. Vivo에서 µCT의 비 파괴적인 자연 시간이 지남에 같은 설치류의 이미징 반복에 대 한 수 있습니다. 이 기능 뿐만 아니라 설치류 실험 설계에 필요한 총 수를 감소 시키고 그로 인하여 발생할 수 있습니다, 하지만 개입에 장기 응답을 이해 하는 연구자 간 주제 변이 감소. 반복 vivo에서 µCT을 사용 하 여, 쥐 및 쥐에 실험 발달 및 변화를 마이크로 아키텍처 뼈 뼈 미네랄 밀도 (BMD)는 수명 1,2,3의 기간에 걸쳐 해명 있다 ,,45,6,,78 로 뼈 건강 다이어트 9,10, 같은 개입에 대 한 응답 ovariectomy 7,11 그리고 pharmacologic 요원 8,,1213. 골밀도 뼈 마이크로-아키텍처 특정 골격 사이트, 즉 근 위 경골, 대 퇴 골과 요 추 척추에 전반적인 뼈 건강 및 유지 하는 골절의 위험을 나타내는 이며 그래서는 기본 조치에 대 한 응답을 측정 하는 경우는 내정간섭입니다.
µCT 이미지 수집 vivo에서 x-레이 소스 및 탐지기 조사 14,15동물 주위 회전으로 여러 각도에서 인수 되 고 2 차원 x-선 예측을 포함 한다. 결과 이미지의 품질이 포함 하 여 많은 요인에 의존 하지만에 국한 되지 않음: 수집 매개 변수를 선택 (즉, 공간 해상도, x 선 전압, 암페어, 회전 단계, 적용 된 필터, 노출 시간), 한계는 µCT의 (즉, 줄이 또는 일부 볼륨 효과 일으킬 반지 또는 먼지 같은 스캐너 기반 아티팩트) 스캐너 및 적절 한 위치와 동물의 감 금. 이러한 요소의 이전 2 특정 검색 컴퓨터에 따라 사용자가 어느 정도 조작 될 수 있습니다, 그리고 연구 목표 및 수정 하는 데 필요한 최적화 스캐너의 기능 또는 취득된 이미지의 처리. 이전 검색, 설치류의 적절 한 위치는 이러한 요인의 후자에 스캐너 기반 제한 또는 특정 연구 목적을 달성 하기 위해 선택 된 수집 매개 변수 얻을 수 있습니다. Vivo에서 화상 진 찰을 포함 하는 많은 간행물 문학 14,15,,1617에 게시 된, 클래식 원고 스타일은 그런 상세한 "방법" 정보 포함 될 수 없습니다. 따라서,이 문서와 비디오 가이드의 목표는이 공 허이 함을 채우기 것입니다. 여기 우리는 지시 µCT 스캐너 vivo에서 의 사용자가 얼마나 하 쥐, anesthetize 위치 하 고 뒷 다리 뼈 마이크로-아키텍처의 결과 더 정확 하 게 계량 분석 될 수 있는 높은 품질의 이미지를 생산을 억제 하고자 합니다.
뒷 다리 이외의 개체 x 선 광선의 방지 장애물 가장 정확한 골밀도 뼈 마이크로 아키텍처 값을 측정 하는 것이 필수적입니다. 엑스레이 개체와 다양 한 두께 밀도의 조직 통과, x-레이의 일부는 (즉, 감쇠)을 통과 하는 물자에 의해 흡수. 샘플의 측정된 질량 밀도 두께, 그리고 존재와 주변 조직의 두께 의해 영향을 받습니다, 이후 골밀도 결정 하는 데 사용 하는 교정 유령 같은 방식으로 스캔는 필수적입니다. 따라서, x 선 빔 앞 이나 관심 영역을 통과 후 개체 (즉, 꼬리)를 통과 하는 것입니다, 그 개체에는 x 선 에너지의 일부를 흡수 수와 전송 이미지 획득에 방해가 됩니다. 또한, 이러한 검사 샘플 검사를 유사한 합니다 팬텀을 스캔할 때 시뮬레이션 하기 위해 매우 어려울 것 이다. 결과적으로, 이러한 감쇠 차이 뼈의 골밀도 측정의 평가 있는 부정확 이어질. 따라서, 용이성, 정확성에 대 한 x 선 소스, 관심 및 x 선 검출기의 지역 사이 있는 장애물의 수를 제한 하 최상 이다.
전 임상 모델에서 개입에서 골격의 경도 평가 프로토콜을 검색 하는 동안 그들의 움직임을 제한 하는 동물의 반복 된 마 취를 포함 한다. µCT 검사, 주사 및 흡입 마 취 1,2,,45,6, 를 포함 하 여 진행 하는 동물을 정복 하기 위해 존재 하는 전신의 여러 가지 방법 12. 달리 isoflurane 같은 흡입 마 취약, 주사 마 취약을 사용 하 여 반복된 전신 인해 감소 체중, 수술 관용과 설치류, 다른 생리 적인 매개 변수에 중요 한 변화에 특히 쥐 및 기니 피그, 사용 18,,1920반복에 대 한 중요 한 금기를 제안. Isoflurane 높은 휘발성은 신속한 유도 및 복구 하는 동안 마 취 에이전트 마 취의 다양 한 수준의 생산 및 마 취 시간 긴장, 섹스, 신체 구성, 금식된 상태, 및의 circadian 사이클에 따라는 동물입니다. 주사 마 취약 또한 포즈를 그들의 사용에 추가적인 방 벽 그들은 높은 국가 관할 기관에 의해 규제 됩니다. 그러나 흡입 마 취는, 호흡 시스템;에 직접 배달 포함 유도 및 복구 시간과 더 나은 길이 및 마 취19,20의 깊이 제어할이 방법에 대 한 빠른 있습니다. 흡입 마 취 방법에 제한 유도, 유지 보수 및 복구 18,19동안 심장 박동과 혈압을 특수 기화 장비 및 일부 변경에 대 한 그것의 요구를 포함 한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi Animal Health</td>
			<td>108737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td>990-1091-3SINEWA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scavengers/Charcoal Filters</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td>985-1005-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-CT Scanner</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SkyScan 1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Kerr Dental Laboratory</td>
			<td>623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam (Backer Rod)</td>
			<td>Rona</td>
			<td>CF12086</td>
			<td>1&#8221;x10&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SP-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-fiber bed</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SP-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Wrap/Bandage</td>
			<td>Dura-Tech</td>
			<td>17473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Gel</td>
			<td>OptixCare</td>
			<td>006CLC-4256</td>
			<td>Antibiotic-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>000731-500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proper positioning and restraint of a rat hind limb for focused high resolution imaging of bone micro-architecture using in vivo micro-computed tomography

Vivo에서 마이크로-단층 (µCT)를 사용 하 여 라이브 동물 모델에서 높은 해상도에서 내부 구조의 비파괴 이미징 포함 하는 강력한 도구입니다. 시간이 지남에 같은 설치류의 반복된 이미징에 대 한 수 있습니다. 이 기능 뿐만 아니라 설치류 실험 설계에 필요한 총 수를 감소 시키고 그로 인하여 발생할 수 있습니다, 하지만 경도 또는 평생 응답 개입을 평가 하는 연구자 간 주제 변이 감소 시킨다. 처리 하 고 뼈 마이크로-아키텍처의 결과 더 정확 하 게 계량 분석 될 수 있는 높은 품질의 이미지를 얻으려고 µCT 스캐너 vivo에서 의 사용자 해야 제대로 쥐, anesthetize 위치 그리고 뒷 다리를 제 지. 이 위해, 완전 한 이완의 수준에 쥐 취 수 하 고 페달 반사 손실 됩니다 필수적입니다. 이러한 지침은 isoflurane 대사의 속도 긴장과 바디 크기에 따라 다 수 각 개별 쥐, 수정할 수 있습니다. µCT 이미지 수집 비보에 대 한 적절 한 기술을 뼈 마이크로-아키텍처 내에서 연구를 통해의 정확 하 고 일관 된 측정을 수 있습니다.

이 방법은 쥐, 및 위치에 대 한 마 취의와 뒷 다리의 구속 µCT 이미징 vivo에서 용이 하 게 고품질의 수집에 대 한 경골 마이크로-아키텍처의 분석에 대 한 적절 한 이미지. 완전히 확장 되 고 다리와 전체 발과 발목 거품 (그림 1A)는 획득된 한 이미지의 배수 및 대뇌 피 질의 마이크로 아키텍처 (분석에 대 한 충분 한 품질의 결과에서 제 지를 포함 한다 쥐 뒷 다리의 적절 한 위치 그림 1B)입니다. 부족 한 배치 및 뒷 다리 (그림 1C)의 구속 운동 아티팩트 (그림 1D), 이미지에 스캔 시야 (그림 1E)에서 완전히 제거 되지 않은 꼬리 x 선 방해할 것입니다 하는 동안 발생할 수 있습니다. 스캔된 샘플 (그림 1 층)에 의해 감쇠 골밀도 및 조직 미네랄 밀도 (TMD) 측정을 변경 하 고. 이러한 배치 오류 중 안 더 분석 해야 가난한 품질 검사를 발생 합니다. 품질의 달성 이미지 잘 배수 네트워크의 정량화 및 후방 사지의 대뇌 피 질의 구조 변경 및 부적절 하거나 불충분 데이터14를 생산할 예정 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56346/56346fig1.jpg"> 그림 1입니다. 쥐 뒷 다리 사지의 배치의 대표 이미지 및 횡단면에서 근 위 경골의 해당 인수 이미지. (A) 거품에 완벽 하 게 절제 된 발목 쥐 뒷 다리의 적절 한 배치, 다리 확장 및 꼬리는 경골에서 경골 배수 및 외피의 (B) 횡단면에 충분 한 이미지 품질을 제공 합니다. 마이크로-아키텍처입니다. (C)는 다리와 쥐 뒷 다리의 부적절 한 배치 완전히 확장 하 고 완전히 거품에 절제 된 발목 (D) 운동 유물, 횡단면에 줄무늬 본에 발생할 수 있습니다. (E) 개체와 같은 꼬리 없는 경골 (F)에서 뽑아 경골에서 x 선 감쇠 방해 귀 착될 수 있다 변경 된 BMD와 TMD 측정, 비록 시각적으로 분명 시야의 방해. 패널 F 에서 왼쪽 아래 경골 통과 이후 x 선 빔 방해 하 보기의 필드에 꼬리의 일부를 보여 줍니다. 왼쪽된 패널에서 빨간색 점선 오른쪽 패널에 표시 하는 횡단면을 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/56346fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1입니다. Isoflurane 마 취 장치 Isoflurane 마 취 단위 3-4 %isoflurane 전신 마 취의 유도 대 한 1-2 L/분의 연속 흐름 율에 O2 에 녹아를 제공 하도록 설정. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_1.jpg">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 2입니다. 마 취의 깊이 보장합니다. 연속 받은 쥐의 발가락을 곤란 하 게 하 여 측정 페달 반사 얼굴 마스크 또는 코 콘을 통해 마 취 제를 흡입. 다리는 약간 확장 하는 때 고통 응답 더 분명 하다. 매우 강한 pinches 또는 포 셉 또는 클램프를 사용 하 여 조직 손상을 일으킬 수 있다 하 고 따라서 사용할 수 없습니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_2.jpg">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 3입니다. 라이브 피드 생리 적 모니터링 카메라 보기의 화면 캡처. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_3.jpg">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 4입니다. 탄소 섬유 스캐너 평판에 부정사 자리에 누워 쥐. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_4.jpg">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 5입니다. 오른쪽 전성 거품 관에서 제 지 하는 쥐의 발. 쥐의 오른쪽 발은 발가락 (여기 사진) 튜브 확장 전성 거품 관에서 제 지. 거품 튜브에 플라스틱 홀더 구속 (참조 하십시오 테이블의 특정 재료/장비 에 대 한 자세한 정보). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_5.jpg">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 6입니다. 오른쪽 다리를 똑바로 확장 위치에 보안 쥐. 꼬리와 왼쪽 발 (몸통)으로 오른쪽 다리에서 녹화, 엉덩이 확보 하 고 쥐 몸통 수 의사 포장 열 손실을 제한 (파란색)에 싸여 있다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_6.jpg">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

적절 한 위치와 뼈 마이크로 아키텍처를 사용 하 여 생체 내에서 마이크로-단층의 집중된 고해상도 이미징 쥐 뒷 다리의 구속

이 종이 마이크로 단층 (µCT) 스캐너 vivo에서 의 사용자 anesthetize, 올바르게 위치 하 고 경골의 고해상도 이미징 동안 최소한의 운동에 대 한 쥐의 뒷 다리를 제 지 하는 방법을 지시 합니다. 결과 뼈 마이크로-아키텍처를 정확 하 게 계량을 처리할 수 있는 높은 품질의 이미지.

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

proper-positioning-restraint-rat-hind-limb-for-focused-high

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

9.8K 조회수.  Brock University. 이 종이 마이크로 단층 (µCT) 스캐너 vivo에서 의 사용자 anesthetize, 올바르게 위치 하 고 경골의 고해상도 이미징 동안 최소한의 운동에 대 한 쥐의 뒷 다리를 제 지 하는 방법을 지시 합니다. 결과 뼈 마이크로-아키텍처를 정확 하 게 계량을 처리할 수 있는 높은 품질의 이미지.

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

연구

생체공학

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

고해상도 3D 영상의 전 VIVO</em마이크로 중부 표준시로> 생물 학적 샘플

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

높은 강도의 실시간 모니터링의 초음파 (HIFU) 절제를 집중<em&gt; 체외</em&gt; 집중 초음파에 대한 조화 운동 이미징을 사용하여 개 간을 (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

심근 구조, 기능의 생체 양적 평가에서 관류 및 생존 능력은 심장 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

In vivo small-animal imaging has an important role to play in preclinical studies. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging hybrid imaging modality that shows great potential for both preclinical and clinical applications. Conventional optical parametric oscillator-based PAT (OPO-PAT) systems are bulky and expensive and cannot provide high-speed imaging. Recently, pulsed-laser diodes (PLDs) have been successfully demonstrated as an alternative excitation source for PAT. Pulsed-laser diode PAT (PLD-PAT) has been successfully demonstrated for high-speed imaging on photoacoustic phantoms and biological tissues. This work provides a visualized experimental protocol for in vivo brain imaging using PLD-PAT. The protocol includes the compact PLD-PAT system configuration and its description, animal preparation for brain imaging, and a typical experimental procedure for 2D cross-sectional rat brain imaging. The PLD-PAT system is compact and cost-effective and can provide high-speed, high-quality imaging. Brain images collected in vivo at various scan speeds are presented.

A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

A compact pulsed-laser diode-based photoacoustic tomography (PLD-PAT) system for high-speed in vivo brain imaging in small animals is demonstrated.

다음을위한 고성능 컴팩트 광 음향 단층 촬영 시스템<em&gt; In Vivo</em&gt; 소형 동물 뇌 영상

In vivo small-animal imaging has an important role to play in preclinical studies. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging hybrid imaging modality ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

적절 한 위치와 뼈 마이크로 아키텍처를 사용 하 여 생체 내에서 마이크로-단층의 집중된 고해상도 이미징 쥐 뒷 다리의 구속

요약

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이 비디오의 챕터

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

고해상도 3D 영상의 전 VIVO 생물 학적 샘플

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

에 대한 바이러스 나노 입자

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

높은 강도의 실시간 모니터링의 초음파 (HIFU) 절제를 집중

심근 구조, 기능의 생체 양적 평가에서 관류 및 생존 능력은 심장 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

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인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징