연구는 어빙과 과학의 웨이즈만 연구소에서 나노 및 바이오 나노 이미징을위한 체르나 Moskowitz 센터에서 실시되었다. 우리는이 프로토콜을 설계 및 실행하는 그녀의 도움을 Orna Yeger에 감사하고 있습니다.

1. 샘플 준비 <ol><li> 검사하는 조직을 추출 후, mineralized 조직은 악기에 위치하고 몇 군데 있습니다. 이미지에 마우스 대퇴골의 하나는 다음과 같은 단계를 따라야합니다 : <ol><li> C57/Bl6 배아 18.5 일 postceutus (E18.5)에서 생긴 다리를 게시 제거합니다. </li><li> 에폭시 수지 또는 다른 접착제를 사용하여 폴리스티렌 피펫 팁 (20-200 μl)의 좁은 끝을 밀봉하고, 작업 버퍼 (PBS 또는 기타)와 팁을 입력합니다. </li><li> 단단히 끝에 다리를 맞춤 및 parafilm 시트와 함께 다른 쪽 끝을 밀봉. </li><li> 적당한 홀더에 피펫 팁을 놓고 제 3의 프로토콜을 따르십시오. 마우스 다리의 배아에서 대퇴골을 시각화 들어, 악기는 40 KV 200 μA로 설정됩니다. 8μ 해상도 4X 배율로 1,000 프로젝션 이미지 획득해야합니다. </li></ol></li><li> 비 mineralized 조직은 처음에는 많은 가능한 프로토콜 8,9 중 하나를 사용하여 관심있는 조직의 X - 선 감쇠를 증가하기 위해 고정 및 스테인드해야합니다. 쥐의 폐 및 이와 유사한 샘플은 준비 프로토콜은 다음과 같습니다 : <ol><li> 누드 쥐 폐에 비 작은 세포 폐 암종 (NSCLC) NCI - H460의 Orthotopical 주입 </li><li> 폐암의 nodules는 주입의 사주 감지되고 시작 </li><li> 쥐를 희생 즉시 헤파린과 혼합 생리 식염수로 달이다 </li><li> 기관지 순환을 얼룩이 좌심실에 Microfil (Flowtech)의 희석 용액 (복합 솔루션, 희석제 3 ML과 치료 요원의 0.3 ML 2 ML)의 그것을 주사 </li><li> 암흑의 폐, 심장의 압축을 풉니다 </li><li> 50 ML의 플라스틱 시험관에 단단히를 피팅하여 샘플을 (프로토콜 제 2 장 참조) 고정 </li><li> 옷감은 에탄올의 감쇠 튜브의 하단에 배치하여 포화 에탄올 분위기를 만들기 </li><li> 악기의 소지자에 접착제 또는 나사 튜브 </li><li> 이미징 매개 변수 (3 장)을 설정 진행합니다. 쥐의 폐의 완전한 이미지의 소스는 40KV 및 100 μA에서 설정됩니다. 16μ 해상도에 도달하기 위해서는 하나는 0.5x의 확대에 2,500 투영 이미지를 획득한다. </li></ol></li></ol> 2. 샘플 고정 높은 해상도에서 측정하는 동안 시료 위치에 변화를 방지하는 것이 중요합니다. 이 경우, 샘플은 단단히 크기에 맞는 플라스틱받는 사람으로 고정됩니다. 폴리스티렌 피펫 팁, 플라스틱 파스퇴르 pipettes 또는 특별히 만든 플라스틱 소유자는 이러한 측면에 사용됩니다. 실험 요구 사항에 따라 샘플을 공중에 검사가 될 수도 있고 아니면 에탄올 또는 버퍼 솔루션에 열중. 일반 고정 및 악기의 마우스 배아의 다리의 최종 위치는 그림 1에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 마이크로 중부 표준시 악기의 배아 마우스 다리의 최종 위치. 3. 수집 매개 변수를 설정 : X - 선 전압 및 전류, CCD의 노출 시간 <ol><li> 홀더에 배치, 샘플은 악기의 순환 단계에 들어가게된다 </li><li> 첫 번째 X - 레이 이미지는 전압과 전류 임의로 세트로 이루어집니다. </li><li> 이미지가 너무 어두운 경우, 하나 먼저 광자의 수를 증가해야하므로 전류를 조금 향상시킬 수 있습니다. 이 충분하지 않다면, 하나는 약간 X - 선 광자의 에너지를 증가해야 X - 선관의 전압을 즉. </li><li> 이미지가 너무 밝은 경우, 하나는 먼저 현재의 후, 전압을 감소한다. </li><li> 이미지의 밝기는 비닝 증가 수 있습니다. 2 비닝은 2x2 픽셀의 각 행렬의 합계 소요 반면 1 비닝는 계정에 이미지에서 각 픽셀의 강도 걸립니다. 이미지 비닝 1의 경우보다 약 4 배 밝게되지만, 절반 해상도를합니다. </li><li> 최적의 밝기를 설정 후, 하나는 한쪽 다른 쪽 실험의 합리적인 기간에 최고의 명암 사이의 타협으로 카메라의 노출 시간을 최적화할 수 있습니다. </li><li> 특히 낮은 흡수 샘플 이미지의 대비는 주로 그 낮은 에너지 광자의 광자 흐름을 감소 필터를 사용하여 향상시킬 수 있습니다. </li></ol> 4. 샘플 위치 <ol><li> 작업 배율을 선택합니다. 가능한 선택은 0.5x 4X, 10X, 20x 및 40x 있습니다. 보기의 필드는 증가 배율로 감소하게된다. </li><li> X - 선 소스와 샘플 사이 예제와 검출기 사이의 거리를 설정하여보기의 최적 해상도와 필드를하십시오. 샘플 거리에 소스를 증가하는 것은보기의 필드를 감소하고 해상도를 증가시킵니다. 검출기 거리에 샘플은 반대 효과가 있습니다. </li></ol> 3D로 볼 수 있도록 전체 필드에 존재해야합니다모든 각도에서 투영 이미지. 하나는 여러 각도에서 샘플을 회전하여 가능한 한 가까이 가능한 회전축에 샘플을 가져하여이 문제를 확인해야합니다. 이를 위해, 하나는 다음과 같은 단계를 따라야합니다 : <ol start="3"><li> 0 데그에서 이미지를 가지고, 그리고 -20 데그에서 샘플을 돌린다. 원하는 볼륨이 옆으로 옮겨있다면, 하나는 회전 축을 위치 조정하여 위치를 수정해야합니다. </li><li> 보정 후, 샘플은 다른 각도로 회전 수 있으며, 관심 분야는 -90에서 90 데그 모든 각도에서 이미지를 내부 때까지 위치, 다시 수정. </li></ol> 5. 고해상도 tomogram <ol><li> 측정하는 동안, 샘플 한 번에 작은 각도에 의해 각각의 각도를 한 투영 이미지의 회전은 이미 사용 중입니다. 이미지의 총수는 항상 한쪽에 원하는 해상도와 다른 측면에서 측정 및 파일 크기의 시간 사이의 타협이다. 마찬가지로 Fig.2에 나타난 모든 단일 프로젝션이 샘플의 모든 조각이 다른 이상 한 superposed, 따라서 샘플의 3 차원 구조를 밝힐 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 0 ° (A), 45 ° (B)와 90 ° (C) 회전 각도로 쥐의 폐의 투영 이미지. <ol start="2"><li> 단지 최소한 -90 90 데그 사이에 투영 이미지를 복용 후, 하나는 샘플 볼륨의 재건을 진행할 수 있습니다. 재건 사용되는 소프트웨어와 예측의 수에 따라 10 분 2 시간 사이에 걸립니다. 다시 말하지만, 3D 이미지의 최종 품질은 원하는 해상도와 하나 보내고 싶어 시간과 결과 파일의 크기 사이의 타협이다. </li></ol> 6. 이미지 스케일 교정 재건축 이미지 픽셀 수준 (값)은 그 이미지에 대해 고유합니다. 서로 다른 두 가지 이미지를 비교하기 위해 고유의 강도 규모는 각 이미지에 부과되어야한다. 이를 위해 <ol><li> 샘플과 동일한 실험 조건을 사용하여 표준 팬텀과 tomography를 실행 </li><li> 팬텀에 대해 얻은 값을 사용하여 샘​​플 이미지를 재조정. 가장 일반적인 규모 브라 (또는 CT) 규모이다. 4X 확대를위한 15,000의 배경 값은 (물 또는 PBS)을 0으로 대체되었으며 뼈에 35000의 최대 값은 3000의 표준 브라 가치로 대체되었습니다. 기타 픽셀 값을 그 한계에 따라 선형 보간이나 추정의 결과. </li></ol> 7. 이미지 프로세싱 및 분석 고해상도 이미지를 얻기 후에, 하나는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관련 정보를 추출한다. 사용하는 소프트웨어 패키지는 매우 큰 파일 (최대 20GB까지)와 함께 작동하도록 설계되어야합니다. 8. 대표 결과 배아 일 18.5 (E18.5)에 C57/Bl6 마우스에서 대퇴골의 표현 - 포 일 mineralization 프로세스의 개시 이후는 그림 3에 표시됩니다. 부드러운 조직이 준비에서 보이지 않는 동안 미네랄 레이어 (흰색) 명확하게 볼 수 있습니다. 우리는 4X의 선형 배율로 1,000 투영 이미지를했습니다. 최종 해상도는 8 미크론입니다. Fig.1에 표시된 볼륨 렌더링의주의 분석, 뼈 부피 분율 (mineralized 조직에 의해 점유되는 뼈 볼륨의 분율)가 0.18임을 보여줍니다, 그리고 뼈 미네랄 밀도는 723 MG / cm 3. 그 가치는 우리 개발의 다른 단계에 뼈를이 구조를 비교할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 마우스 대퇴골의 배아의 3D 이미지의 다른 표현. 횡단하는 (단면)는 (A), sagital (메디오 - 측면)과 (B)와 볼륨 렌더링 (C)의 스냅샷이 표시됩니다. 그림 4는 비 작은 세포 폐 암종 (NSCLC) NCI - H460과 함께 orthotopically 이식 12 주 된 여성 누드 쥐 (RNU)의 폐의 3D 이미지를 보여줍니다. 2,500 프로젝션 이미지 16 미크론의 최종 해상도를 확보, 0.5x의 선형 배율로 촬영했다. 이미지가 Microfil 스테인드 혈관 (아래 20 미크론의 직경)를 보여줍니다. 이미지 분석 사주 주입 후 여러 암 nodules가 형성되는 것을 보여줍니다. 그들은 폐 볼륨 (17 %)의 상당 부분을 덮고있다. 폐동맥 얼룩의 대부분은 종양의 주변 지역에서 발견되었다. 크게로 그림 4B와 같이, 여러 혈관들은 볼륨의 일부 3% 예비 분석에 따르면, 덮고, nodules 안에도 존재하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 암 nodules의 3D 이미지가 쥐를에서 성장폐. 볼륨 렌더링 (A)와 볼륨 (B)를 통해 섹션의 스냅샷이 표시됩니다. 암 nodules는 화살표로 표시됩니다. 영화 1. 그림 1에서 마우스 대퇴골의 볼륨 렌더링. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 영화 2. 그림 2에서 쥐의 폐의 볼륨 렌더링. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 영화 3. 호흡을 통해 시리얼 섹션. nodules은 조각의 대부분의 회색 영역으로 표시됩니다. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">동영상을 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol>
	<li>Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+micro-CT+in+small+animal+imaging.">Application of micro-CT in small animal imaging.</a> Methods. 50, 2-13 (2010).</li><li>Bauer, J. S., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoporosis+imaging.">Advances in osteoporosis imaging.</a> Eur J Radiol. 71, 440-449 (2009).</li><li>Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+insight+bone+measurements+by+histomorphometry+and+microCT.">Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT.</a> J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).</li><li>Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+human+bone+biopsies:+a+quantitative+structural+comparison+of+histological+sections+and+micro-computed+tomography.">Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography.</a> Bone. 23, 59-66 (1998).</li><li>Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Aliased+3D+Cone-Beam+Reconstruction+Of+Low-Contrast+Objects+With+Algebraic+Methods.">Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).</li><li>Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+single-slice+rebinning+in+cone-beam+spiral+CT.">Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT.</a> Med Phys. 27, 754-772 (2000).</li><li>Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination-weighted+Feldkamp-based+reconstruction+algorithm+for+cone-beam+CT.">A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT.</a> Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).</li><li>Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging.">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med Phys. 31, 305-313 (2004).</li><li>Plourabou&#233;, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+high-resolution+vascular+network+imaging.">X-ray high-resolution vascular network imaging.</a> J Microsc. 215, 139-148 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

배아 일 18.5 (E18.5)에서 C57/Bl6 마우스 나흘 mineralization 프로세스의 개시 이후입니다. 개발이 단계에서, 미래의 뼈가 명확하게 그림 3에서 볼, mineralized osteoids 여러 레이어로 만들어진 것입니다. 이 시점에서, 하나는 mineralized 조직이 적은 시료 처리를 필요로 다른 악기와 낮은 해상도로 시각 수 있습니다 강조해야한다. 높은 해상도를 제공하는 외에 현재 프로토콜 (및 마이크로 중부 표준시 악기가 사용)은 측정을위한 최고의 기하학적 매개 변수를 선택하는 사용자에 대한 높은 유연성을 제공합니다. 그림 4 결과 orthotopic 폐암 동물 모델에서 인간이 아닌 작은 세포 폐암이 혈관과 neovascularization 모집을 일으킬 수 보여줍니다. 우리는 폐 조직이 둘 다 이동하지라고 생각하거나 그 모양은 측정하는 동안 변경되었습니다. 사용자는 tomography 동안 이러한 변화를 피하기 위해 특별한주의 정도 소요됩니다. 일부 샘플, 특히 부드럽고 조직을 위해, 하나는 측정하는 동안 완벽하게 샘플을 고정 특별한 개최 장치를 구축해야한다. 불행히도 종양의 주변에 대비 요원의 높은 leakages의 존재는 말초 혈관의 신뢰성 부량하지 못했습니다. 결과적으로 이미지가 명확 영화 2, 3에 존재하는, 특히 가장자리에서 일부 얼룩 에이전트에 의해 오염됩니다. 우리는이 누설을 막을 수는 있겠지만, 그들의 크기, 모양 및 내부 혈관의 존재를 포함하여 암 nodules에 대한 유용한 정보는 영향을받지되었습니다. 우리는 분명히 적어도 이곳에서 공부했던 기관지 순환, 말초 혈액 공급이 종양 내부의 일부 재관류로, 종양 재관류에 현재 참여하고 결론 수 있습니다.

이미지 수집을 위해 우리는 Xradia, 콩코드, 미국에 의해 생산된 마이크로 XCT - 400 microfocussed X - 선 단층 시스템을 사용하고 있습니다. 이미지 처리 및 ImageJ (NIH, 미국), Avizo (VSG, 프랑스)와 MicroView (제너럴 일렉트릭, 미국) 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석했다. 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어는 대신 사용할 수 있습니다

high resolution 3d imaging of ex-vivo biological samples by micro ct

비 - 파괴적인 볼륨 시각화는 가장 효율이 X - 선 마이크로 컴퓨터 tomography (μCT) 어떤의 단층 기술에 의해 형성될 수 있습니다. 고해상도 μCT 전직 생체내 생물 학적 샘플이 1, 2의 3D 심사 매우 다양한 아직 정확한 (해상도 1-2 미크론) 기술입니다. 마찬가지로 전자 tomography 반대, μCT 최대 4cm 두께의 샘플로의 시험을 수 있습니다. 조직학에 주에 비해이 기술은 측정에만 몇 시간이 필요합니다. 또한, μCT은 2D stereologic 모델에 의존하지 않습니다 따라서 그것은 보완 수 있으며 어떤 경우에는 심지어 두 시간을 소비하고 파괴 아르 histological 방법 3, 4를 바꿀 수 있습니다. μCT에서 샘플 컨디셔닝 및 위치는 간단하고 부정적인 구조에 영향을 미칠 수있는 고진공 또는 저온을 필요하지 않습니다. 샘플 위치 및 180 ° 또는 2 차원 이미지 촬영 각 각도 들어 신틸레이터하고 정확한 CCD 카메라를 포​​함 microfocused X - 선 소스와 검출기 사이에 360 °를 회전하고 전체 볼륨이 하나를 사용하여 복원입니다 다른 사용 가능한 알고리즘 5-7. 3D 해상도는 회전 단계의 감소와 함께 증가합니다. 현재 비디오 프로토콜 준비, 고정 및 높은 해상도에서 이미지 다음 샘플의 위치의 주요 단계를 보여줍니다.

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT at JoVE.com

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

비 - 파괴적인 볼륨 시각화는 가장 효율이 X - 선 마이크로 컴퓨터 tomography (CT) 어떤의 단층 기술에 의해 형성될 수 있습니다.

고해상도 3D 영상의 전 VIVO</em마이크로 중부 표준시로> 생물 학적 샘플

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

high-resolution-3d-imaging-of-ex-vivo-biological-samples-by-micro-ct

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

18.6K 조회수.  Weizmann Institute of Science. 비 - 파괴적인 볼륨 시각화는 가장 효율이 X - 선 마이크로 컴퓨터 tomography (CT) 어떤의 단층 기술에 의해 형성될 수 있습니다.

비디오: High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

연구

생체공학

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

마이크로 혈액 흐름의 속도 분포 측정을위한 마이크로 입자 이미지 유속계

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

탈착 전기 분무 이온화 질량 분석에 의한 생물 조직의 이미지

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

적절 한 위치와 뼈 마이크로 아키텍처를 사용 하 여 생체 내에서 마이크로-단층의 집중된 고해상도 이미징 쥐 뒷 다리의 구속

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

고해상도 3D 영상의 전 VIVO 생물 학적 샘플