Gli autori riconoscono ricerca finanziamenti da una borsa di studio per la scoperta della NSERC (#05573) e la Fondazione canadese per l'innovazione (#222084) per il finanziamento in vivo micro-CT W.E. Ward è un Canada Research Chair in osso e lo sviluppo muscolare.

Questo studio è stato approvato dal animale cura Comitato di Brock University e condotto in conformità con le linee guida stabilite dal Consiglio canadese su Animal Care 21.
1. anestesia utilizzando Gas isoflurano
<ol><li>Pre-riempire la camera di incubazione di vetro acrilico con alta qualità O2 ad un flusso continuo di circa 1-2 L/min da una macchina dell'anestetico (complementare figura 1).</li>
	<li>Trasferimento di ratto per la coda di camera di incubazione prima e chiudere il coperchio della camera di incubazione per creare una chiusura ermetica.</li>
	<li>Iniziare a riempire la camera di incubazione con isoflurano veterinaria-grado a 3-4% v/v disciolto in O2 ad un flusso continuo di 1-2 L/min (complementare figura 1). Attenzione: Gas anestetici rifiuti possono influenzare negativamente i gestori. Un sistema di scavenger (cioè, un filtro al carbone o gas di scarico direttamente in una cappa aspirante) deve essere sempre a posto.</li>
	<li>Quando il topo non è più in grado di resistere, trasferimento il topo a una maschera facciale o cono di naso che ricevono 1-3% isoflurane disciolto in O2 ad una portata di 1-2 L/min ratti soprattutto respirare attraverso il naso e così, fino a quando il naso è coperto dalla maschera o naso cono, ci sarà sufficiente anestesia consegna.</li>
	<li>Applicare oftalmica lubrificazione per le membrane delicate degli occhi per proteggerli da eventuali gas Escape isoflurano. Nota: Assicurarsi che la lubrificazione oftalmica è senza Antibiotico, come questo può influenzare i risultati da un intervento.</li>
	<li>Misurare palpebrale (occhio lampeggiante risposta alla stimolazione delicata dell'apertura palpebrale) e pedale riflessi (ritiro di arti posteriori in risposta a pizzicare); con l'aumento della profondità dell'anestesia, riflesso palpebrale sarà essere assenti prima del pedale riflessi (complementare figura 2).</li>
	<li>Quando viene raggiunto un adeguato livello di anestesia e il ratto ha perso i riflessi palpebrali e a pedale, mantenere il topo su 0,5-2% isoflurane disciolto in O2 ad una portata di 1-2 L/min.</li>
	<li>Monitorare continuamente la frequenza respiratoria del ratto durante l'intera procedura mantenendo una costante visual il ratto direttamente con un sistema di monitoraggio interno o attraverso il live video feed (complementare figura 3).</li>
</ol>2. posizionamento e limitazione dell'arto posteriore del ratto
<ol><li>Posare il ratto in posizione supina sul piano dello scanner in fibra di carbonio (complementare figura 4).</li>
	<li>Trattenere il piede destro in un malleabile, tubo della gomma piuma, con le dita che si estende dall'estremità del tubo. Applicare la cera dentale per mantenere il piede saldamente all'interno della schiuma e il tubo ben chiuso con nastro adesivo. Assicurarsi che il diametro del tubo che tiene il piede sia abbastanza per adattarsi saldamente il tubo di plastica.</li>
	<li>Far scorrere il tubo di plastica nel piano dello scanner a raggi x (complementare figura 5).</li>
	<li>Estendere l'arto posteriore del ratto finché è tesa. Non sovra-estendere la gamba da arrecare alcun danno al ratto (complementare figura 5) come questo può indurre il movimento involontario degli arti a causa di respirazione affannoso.</li>
	<li>Tirare la gamba sinistra (non sottoposto alla ricerca dell'arto) insieme con la coda fuori del campo di vista scansione e verso il torso, dalla gamba estesa da sottoporre a scansione.</li>
	<li>Fissare la gamba sinistra (non sottoposto alla ricerca dell'arto) e la coda in posizione con nastro adesivo. Non usare qualcosa di più o meno appiccicoso (cioè, nastro adesivo o nastro pittore) come questi materiali o danneggia il ratto quando sono rimossi (nastro adesivo) o non forniscono una stretta abbastanza forte (nastro pittore) (complementare figura 6).</li>
	<li>Fissare il corpo del ratto in posizione presso i fianchi, spalle e testa con il nastro adesivo. Fissare la maschera o il cono di naso al ratto (complementare figura 6). Nota: Asciugare il lato adesivo del nastro adesivo per rimuovere la sua capacità di attaccare alla pelliccia del ratto. Non macchia le estremità del nastro adesivo, modo che può essere fissato saldamente per il piano di scansione.</li>
	<li>Avvolgere il ratto nella IFP-trasparente per limitare la perdita di calore (complementare figura 6). Nota: Quando si è sotto anestesia generale, ratti perdono calore rapidamente a causa della loro grande superficie a corpo peso rapporto 19,20.</li>
	<li>Monitorare continuamente la frequenza respiratoria del ratto durante l'intera procedura mantenendo una costante visual il ratto (o direttamente o attraverso un live-video feed). Nota: Qui messa a punto richiede 5 minuti, acquisizione di scansione è acquisizione impostazione-dipendente e tempo di recupero è 60 minuti.</li>
	<li>Procedere per acquisire le immagini µCT. Nota: Le specifiche esatte per l'acquisizione di scansione sono specifiche per ogni scanner tipo, software di sistema e la domanda di ricerche specifiche, tuttavia, diverse pubblicazioni metodologiche esistono in tutta la letteratura 1,2 , 9.</li>
</ol>3. il recupero dall'anestesia
<ol><li>Termine in vivo µCT scansione, fermare il flusso di isoflurane al ratto, ma mantenere un flusso di 1-2 L/min di O2.</li>
	<li>Quando il ratto riacquista il controllo del motore (1-2 min), rimuoverlo dal respiratore e consentirle di recuperare singolarmente in una gabbia collocata parzialmente su un rilievo di riscaldamento polivalente a basso calore. Ratti sono conosciuti per ridurre la loro temperatura corporea di 1 ° C quando sotto anestetico generale19. Non lasciare incustodito il ratto fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Nota: Le prove aneddotiche dal nostro gruppo di ricerca segnala che immediatamente successivo recupero dall'anestesia isoflurano, ratti cominciano a mangiare e quindi è importante avere loro cibo e acqua a loro disposizione durante il recupero. Anche se abbiamo osservato questo comportamento, ripetuto l'anestesia generale non causa un aumento significativo nel cibo assunzione o corpo peso 1,9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Longo, A. B., Sacco, S. M., Salmon, P. L., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+use+of+micro-computed+tomography+does+not+alter+microarchitecture+of+the+proximal+tibia+in+sham+or+ovariectomized+sprague-dawley+rats.">Longitudinal use of micro-computed tomography does not alter microarchitecture of the proximal tibia in sham or ovariectomized sprague-dawley rats.</a> Calcif Tissue Int. 98 (6), 631-641 (2016).</li><li>Sacco, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+irradiation+from+micro-computed+tomography+scanning+at+2,+4+and+6+months+of+age+does+not+induce+damage+to+tibial+bone+microstructure+in+male+and+female+CD-1+mice.">Repeated irradiation from micro-computed tomography scanning at 2, 4 and 6 months of age does not induce damage to tibial bone microstructure in male and female CD-1 mice.</a> Bonekey Rep. 6, 855 (2017).</li><li>Waarsing, J. H., Day, J. S., Verhaar, J. A., Ederveen, A. G., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+loss+dynamics+result+in+trabecular+alignment+in+aging+and+ovariectomized+rats.">Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats.</a> J Orthop Res. 24 (5), 926-935 (2006).</li><li>Klinck, R. J., Campbell, G. M., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+effects+on+bone+architecture+in+mice+and+rats+resulting+from+in+vivo+micro-computed+tomography+scanning.">Radiation effects on bone architecture in mice and rats resulting from in vivo micro-computed tomography scanning.</a> Med Eng Phys. 30 (7), 888-895 (2008).</li><li>Laperre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+micro-CT+protocols+for+in+vivo+follow-up+of+mouse+bone+architecture+without+major+radiation+side+effects.">Development of micro-CT protocols for in vivo follow-up of mouse bone architecture without major radiation side effects.</a> Bone. 49 (4), 613-622 (2011).</li><li>Brouwers, J. E., van Rietbergen, B., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+effects+of+in+vivo+micro-CT+radiation+on+structural+parameters+and+bone+marrow+cells+in+proximal+tibia+of+wistar+rats+detected+after+eight+weekly+scans.">No effects of in vivo micro-CT radiation on structural parameters and bone marrow cells in proximal tibia of wistar rats detected after eight weekly scans.</a> J Orthop Res. 25 (10), 1325-1332 (2007).</li><li>Francisco, J. I., Yu, Y., Oliver, R. A., Walsh, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+age,+skeletal+site,+and+time+post-ovariectomy+on+bone+mineral+and+trabecular+microarchitecture+in+rats.">Relationship between age, skeletal site, and time post-ovariectomy on bone mineral and trabecular microarchitecture in rats.</a> J Orthop Res. 29 (2), 189-196 (2011).</li><li>Altman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+skeletal+growth,+modeling,+and+remodeling+by+in+vivo+micro+computed+tomography.">Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro computed tomography.</a> Bone. 81, 370-379 (2015).</li><li>Longo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+intake+of+flaxseed+or+menhaden+oil+to+provide+varying+n-6+to+n-3+PUFA+ratios+modulate+bone+microarchitecture+during+growth,+but+not+after+OVX+in+Sprague-Dawley+rats.">Lifelong intake of flaxseed or menhaden oil to provide varying n-6 to n-3 PUFA ratios modulate bone microarchitecture during growth, but not after OVX in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Nutr Food Res. 61 (8), (2017).</li><li>Sacco, S. M., Saint, C., LeBlanc, P. J., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+consumption+of+hesperidin+and+naringin+flavanones+exerts+transient+effects+to+tibia+bone+structure+in+female+CD-1+offspring.">Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring.</a> Nutrients. 9 (3), 250 (2017).</li><li>Campbell, G. M., Buie, H. R., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+irreversible+architectural+changes+occur+early+in+the+development+of+experimental+osteoporosis+as+assessed+by+in+vivo+micro-CT.">Signs of irreversible architectural changes occur early in the development of experimental osteoporosis as assessed by in vivo micro-CT.</a> Osteoporos Int. 19 (10), 1409-1419 (2008).</li><li>De Schaepdrijver, L., Delille, P., Geys, H., Boehringer-Shahidi, C., Vanhove, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+longitudinal+micro-CT+study+of+bent+long+limb+bones+in+rat+offspring.">In vivo longitudinal micro-CT study of bent long limb bones in rat offspring.</a> Reprod Toxicol. 46, 91-97 (2014).</li><li>Perilli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+early+bone+changes+using+in+vivo+micro-CT+in+ovariectomized,+zoledronic+acid-treated,+and+sham-operated+rats.">Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized, zoledronic acid-treated, and sham-operated rats.</a> Osteoporos Int. 21 (8), 1371-1382 (2010).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>Li, H., Zhang, H., Tang, Z., Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-computed+tomography+for+small+animal+imaging:+Technological+details.">Micro-computed tomography for small animal imaging: Technological details.</a> Progress in Natural Science. 18 (5), 513-521 (2008).</li><li>Campbell, G. M., Sophocleous, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+bone+and+soft+tissue+by+micro-computed+tomography:+applications+to+ex+vivo+and+in+vivo+studies.">Quantitative analysis of bone and soft tissue by micro-computed tomography: applications to ex vivo and in vivo studies.</a> Bonekey Rep. 3, 564 (2014).</li><li>Meganck, J. A., Kozloff, K. M., Thornton, M. M., Broski, S. M., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+hardening+artifacts+in+micro-computed+tomography+scanning+can+be+reduced+by+X-ray+beam+filtration+and+the+resulting+images+can+be+used+to+accurately+measure+BMD.">Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD.</a> Bone. 45 (6), 1104-1116 (2009).</li><li>Vazquez, C. M., Molina, M. T., Ilundain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+rat+large+intestine+in+reducing+diarrhea+after+50%+or+80%+distal+small+bowel+resection.">Role of rat large intestine in reducing diarrhea after 50% or 80% distal small bowel resection.</a> Dig Dis Sci. 34 (11), 1713-1719 (1989).</li><li>Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+isoflurane,+ketamine-xylazine+and+a+combination+of+medetomidine,+midazolam+and+fentanyl+on+physiological+variables+continuously+measured+by+telemetry+in+Wistar+rats.">Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats.</a> BMC Vet Res. 10, 198 (2014).</li><li>Schmitz, S., Tacke, S., Guth, B., Henke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+physiological+parameters+and+anaesthesia+specific+observations+during+isoflurane,+ketamine-xylazine+or+medetomidine-midazolam-fentanyl+anaesthesia+in+male+guinea+pigs.">Comparison of physiological parameters and anaesthesia specific observations during isoflurane, ketamine-xylazine or medetomidine-midazolam-fentanyl anaesthesia in male guinea pigs.</a> PLoS One. 11 (9), e0161258 (2016).</li><li>Stevens, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+toxicities+of+halothane,+isoflurane,+and+diethyl+ether+at+subanesthetic+concentrations+in+laboratory+animals.">Comparative toxicities of halothane, isoflurane, and diethyl ether at subanesthetic concentrations in laboratory animals.</a> Anesthesiology. 42 (4), 408-419 (1975).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo fornisce gli spettatori con la prima guida di riferimento dettagliata per l'anestesia adeguata, il posizionamento e la moderazione del ratto in vivo µCT scansione dell'arto posteriore. Queste linee guida consentono agli utenti di in vivo µCT sistemi di scansione per ottenere alta risoluzione e immagini di alta qualità della tibia che può essere elaborato per la quantificazione della microarchitettura ossea 3-dimensionale. Fasi critiche nel protocollo necessario per garantire il corretto posizionamento e trattenuta coinvolgono l'anestesia adeguata di ratto, nonché estendere l'arto lontano da tutte le altre strutture critiche fino a quando è tesa, ma non in una posizione innaturale. Per i risultati ottimali di imaging, è imperativo che il ratto anestetizzati ad un livello di completo relax, e che i riflessi palpebrali e pedali vengono persi. Inoltre, la scansione gamba dovrebbe essere estesa e il tutto il piede e la caviglia deve essere trattenuti in schiuma. I metodi descritti sopra per ottenere un posizionamento ottimale della scansione gamba farà in modo che: 1) degli arti posteriori dei ratti all'interno di uno studio sono costantemente orientati nella stessa direzione, permettendo così il fascio di raggi x per passare attraverso la stessa area di ciascuna gamba durante la rotazione intorno al campione; 2) sia volontaria che involontaria movimento dell'arto posteriore non si verificherà, riducendo così al minimo il potenziale per artefatti di movimento di interferire con la qualità delle immagini acquisite; 3) ostruzioni da oggetti (vale a dire, la coda) sono evitati, riducendo così al minimo il potenziale per gli effetti di volume parziale a produrre misurazioni imprecise di BMD e TMD. Queste linee guida possono essere modificate per ogni ratto individuo, come il tasso di metabolismo isoflurano e posizionamento può variare a seconda del ceppo e corpo formato 22. Le più comuni in vivo scansione macchine sono progettati per piccoli modelli animali (cioè, topi, ratti, conigli, porcellini d'India) e avrà tappe animale intercambiabili per consentire la scansione di diverse dimensioni degli animali. Di conseguenza, possono ospitare una vasta gamma di pesi corporei.
Anche se in vivo µCT scansione permessi per il topo a essere riposizionato e rianalizzati se le immagini acquisite dalla scansione iniziale sono di scarsa qualità, ripetuta scansione esporrà il topo a dosi aggiuntive di radiazione e isoflurano anestesia per un periodo prolungato di tempo. Esposizione a radiazioni ripetute mensile di 600 mGy focalizzata alla tibia del ratto più di quattro mesi non causa effetti negativi alle ossa micro-architettura rispetto alla controlaterale dell'arto posteriore 1, ma questo non accertare la sicurezza di due scansioni ripetute in successione immediata. Ulteriori limitazioni della tecnica descritti includono la necessità di estendere l'arto teso con le forze applicate ad esso per tenerlo ancora, che possono richiamare alcuni cambiamenti nella struttura ossea. Mentre la severità di limitazione della dell'arto durante la scansione dipenderà ogni obiettivo di ricerca, ricerche precedenti dal nostro laboratorio che coinvolgono mensile ripetute in vivo imaging di µCT di un arto è provocato da una differenza nella corticale micro-architettura parametro, eccentricità, rispetto per l'arto controlaterale che non subissero estensione ripetuti, stabilizzazione e scansione 1. L'eccentricità è una misura della forma ellittica dell'osso corticale e cambiamenti in risposta a alterato carico-cuscinetto. Pertanto, quando usando questo metodo di posizionamento e trattenente dell'arto posteriore per ripetuto µCT in vivo imaging, considerazione va fatta quando valutare e interpretare modifiche ai parametri di micro-architettura portante.
Mentre le suddette linee guida sono state fornite per l'imaging e l'analisi del tessuto osseo, lievi modifiche al protocollo devono essere effettuati quando la formazione immagine dei tessuti molli degli arti posteriori. In particolare, il modo in cui l'arto viene esteso dal torso e trattenuto deve tener conto, come l'attuale procedura misshapes l'orientamento dei tessuti molli (muscoli, tessuto adiposo) in posizionamento anormale per tutta la durata della scansione. Pertanto, quando estrapolando questo modello per l'uso nella formazione immagine del tessuto molle dell'arto posteriore, alcuni aggiustamenti dovrebbero essere fatto per la tecnica di contenimento per ridurre o eliminare le modifiche nel posizionamento dei tessuti in relazione l'uno con l'altro.
Inoltre, le linee guida sono state scritte specificamente basato sulle esperienze del nostro gruppo di ricerca, tuttavia, possono essere modificati per ospitare altri scanner µCT disponibili in commercio in vivo . Altri metodi suggeriti per posizionare e frenare l'arto posteriore potrebbero essere disponibili dal produttore del µCT in vivo sistema di scansione. Più commercialmente disponibili in vivo unità µCT riportate in polipropilene polistirene espanso, e tubi di plastica con cera dentaria per tenere una sporgente del piede come accettabile materiali e metodi per immobilizzare la gamba di scansione. Tuttavia, il metodo presentato in questo protocollo fornire più controllata e coerente posizionamento e moderazione della gamba digitalizzata e costantemente produce immagini di alta qualità. Le linee guida presentate nel presente metodo richiedono attrezzature specializzate necessarie per l'anestesia del ratto, come un vaporizzatore, tubi, maschere, alloggiamenti di induzione e ossigeno. Anche se l'attrezzatura è associato un costo leggermente superiore rispetto agli anestetici iniettabili, permette i ricercatori la possibilità di rapidamente e precisamente inducono anestesia a specifiche profondità della coscienza, che fornisce un vantaggio su alternativa metodi.
Utilizzando le linee guida delineate nel presente metodo video, i ricercatori che utilizzano tecnologie di alta risoluzione in vivo µCT a studiare il loro intervento di interesse sarà in grado di correttamente e costantemente orientare e trattenere dell'arto posteriore del ratto per alta imaging a raggi x di qualità. Questo fornirà un continuum nel campo dell'acquisizione di immagini in vivo µCT e servire come un passo verso l'ottimizzazione la coerenza e la precisione nell'ambito degli studi e abilitare i confronti tra gli studi nella letteratura. Allo stesso modo, questi protocolli e metodi possono essere espansa per l'uso in altre specie di roditori, tra cui topi, anche se alcune modifiche sarà richiesto 2,10. Ad esempio, il sistema di ritenuta del piede nel tubo della gomma piuma può includere la caviglia per minimizzare la possibilità di movimento delle gambe durante la scansione. Inoltre, il piede completo si inserisce nella schiuma titolare. Così, le dita non si estendono fuori dalla fine del titolare come fanno quando si fissa il piede di un ratto. Inoltre, il corpo del mouse non richiede la stessa moderazione con nastro come il ratto. Un cono di naso più piccolo può essere utilizzato per mantenere l'anestesia in topi durante la scansione. Se un più piccolo cono di naso non è disponibile, si può garantire un guanto di nitrile sopra il cono di naso disponibile e fare una piccola incisione nel guanto di fornire uno spazio che può andare bene il naso del mouse per fornire anestesia mantenendo una guarnizione intorno al naso.
Mentre la tibia prossimale è il principale sito di indagine delle modifiche alle ossa micro-struttura nel ratto, linee guida per il posizionamento corretto e coerente di altri siti scheletrici come il femore e le vertebre lombari dovrebbero essere studiate e stabilite per coerenza nella letteratura. Tuttavia, quando si intraprende la ricerca futura che coinvolgono l'imaging delle vertebre lombari, considerazioni vanno fatte come formazione immagine della spina dorsale fornisce esposizione alle radiazioni di organi circostanti e i tessuti.

L'uso di in vivo micro-tomografia computerizzata (µCT) è un potente strumento che coinvolge l'imaging non-distruttivo delle strutture interne alle alte risoluzioni utilizzando modelli del roditore. La natura non-distruttivo di in vivo µCT permette per ripetute di imaging del roditore stesso nel tempo. Questa caratteristica non solo riduce il numero totale dei roditori necessaria in un disegno sperimentale e quindi riduce la variazione inter-soggetta che possa sorgere, ma permette anche ai ricercatori di capire le risposte a lungo termine ad un intervento. Con l'uso di ripetute in vivo µCT, esperimenti su topi e ratti hanno delucidato cambiamenti inerenti allo sviluppo per osso micro-architettura e densità minerale ossea (BMD durante periodi di durata della vita 1,2,3) ,4,5,6,7,8 , così come la risposta di salute dell'osso agli interventi come dieta 9,10, l'ovariectomia 7,11 e agenti farmacologici 8,12,13. BMD e microarchitettura ossea a specifici siti scheletrici, vale a dire la tibia prossimale, femore e vertebre lombari, sono indicativi di salute generale dell'osso e del rischio di sostenimento della frattura e così sono le misure primarie nel quantificare le risposte a un intervento.
Acquisizione di immagini in vivo µCT coinvolge bidimensionale proiezioni di raggi x viene acquisite ad angoli diversi, come la sorgente di raggi x e rivelatore ruotano attorno l'animale sotto inchiesta 14,15. La qualità dell'immagine risultante è dipendente da molti fattori tra cui, ma non limitato a: selezionati parametri di acquisizione (cioè, risoluzione spaziale, tensione dei raggi x, amperaggio, passo di rotazione, filtro applicato, tempo di esposizione), limitazioni della µCT scanner (cioè, gli elementi basati su scanner come anello artefatti o polvere che causano effetti di volume parziale o striature) e corretto posizionamento e contenimento dell'animale. I primi due di questi fattori possono essere manipolati in una certa misura da parte dell'utente, a seconda della macchina di scansione specifica, obiettivi di studio e le correzioni che sono necessarie per ottimizzano la funzione dello scanner o l'elaborazione delle immagini acquisite. Quest'ultimo di questi fattori, il corretto posizionamento del roditore prima della scansione, può essere raggiunto indipendentemente le limitazioni basate su scanner o dei parametri di acquisizione sono selezionati per raggiungere un obiettivo di studio specifico. Mentre molte pubblicazioni che coinvolgono in vivo imaging sono apparse nella letteratura 14,15,16,17, stile classico del manoscritto è tale che dettagliate "how to" informazioni non possono essere inclusi. Pertanto, lo scopo di questo articolo e video guida è di riempire questo vuoto. Qui ci proponiamo di indicare agli utenti di in vivo scanner µCT come anestetizzare un ratto e posizionare e frenare l'arto per produrre immagini di alta qualità che possono essere analizzate per quantificare con maggiore precisione i risultati di micro-architettura dell'osso.
Prevenire ostruzioni del fascio dei raggi x attraverso oggetti diversi dalla dell'arto sono imperativi per quantificare il BMD più accurate e valori di micro-architettura dell'osso. Come i raggi x passano attraverso oggetti e tessuti di spessore e densità variabili, alcuni dei raggi x sono assorbiti (cioè attenuato) dai materiali che passano attraverso. Poiché la densità di massa misurata di un campione è influenzata dal suo spessore e la presenza e spessori dei tessuti circostanti, è imperativo che i fantasmi di calibrazione utilizzati per determinare la BMD vengano analizzati nello stesso modo. Pertanto, se il fascio di raggi x è quello di passare attraverso gli oggetti (vale a dire, la coda) prima o dopo il passaggio attraverso la regione di interesse, tali oggetti in grado di assorbire alcune delle energie dei raggi x e interferiscano con la trasmissione immagine acquisita. Inoltre, queste scansioni sarebbe molto difficile da simulare quando si acquisiscono i fantasmi che devono assomigliare esempio scansioni. Di conseguenza, tali differenze di attenuazione portano ad inesattezza nella valutazione delle misure del BMD dell'osso. Così, per facilità e precisione, si consiglia di limitare il numero di ostacoli tra la sorgente di raggi x, regione di rivelatore di raggi x e di interesse.
Valutazione longitudinale della struttura dell'osso da un intervento in modelli pre-clinici coinvolgono l'anestesia ripetuta dell'animale per limitare il loro movimento durante l'analisi di protocolli. Esistono diversi metodi di anestesia generale per sottomettere gli animali sottoposti a una scansione µCT, tra cui iniettabili e inhalant anestesia 1,2,4,5,6, 12. a differenza di anestetici inalatori come isoflurano, ripetuta anestesia generale utilizzando anestetici iniettabili causa una riduzione di peso corporeo, tolleranza chirurgica e cambiamenti significativi di altri parametri fisiologici in roditori, in particolare ratti e cavie, suggerendo significative controindicazioni per ripetuto uso 18,19,20. Mentre isoflurane è altamente volatile e consente la rapida induzione e recupero, agenti anestetici iniettabili producono diversi livelli di anestesia e tempo sotto anestesia dipende il ceppo, il sesso, composizione corporea, uno stato di digiuno e ciclo circadiano della animale. Anestetici iniettabili pongono anche ulteriori ostacoli al loro uso in quanto sono altamente regolamentati dagli organi nazionali. L'anestesia per inalazione, tuttavia, comporta la consegna diretta nel sistema respiratorio; Questo metodo consente più velocemente induzione e recupero tempo e più facile controllare la lunghezza e la profondità di anestesia19,20. Limitazioni per il metodo di anestesia per inalazione coinvolgono relativo requisito per attrezzature specializzate di vaporizzazione e alcuni cambiamenti di frequenza cardiaca e pressione sanguigna durante l'induzione, mantenimento e recupero 18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi Animal Health</td>
			<td>108737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td>990-1091-3SINEWA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scavengers/Charcoal Filters</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td>985-1005-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-CT Scanner</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SkyScan 1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Kerr Dental Laboratory</td>
			<td>623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam (Backer Rod)</td>
			<td>Rona</td>
			<td>CF12086</td>
			<td>1&#8221;x10&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SP-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-fiber bed</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SP-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Wrap/Bandage</td>
			<td>Dura-Tech</td>
			<td>17473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Gel</td>
			<td>OptixCare</td>
			<td>006CLC-4256</td>
			<td>Antibiotic-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>000731-500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proper positioning and restraint of a rat hind limb for focused high resolution imaging of bone micro-architecture using in vivo micro-computed tomography

L'uso di in vivo micro-tomografia computerizzata (µCT) è un potente strumento che coinvolge l'imaging non-distruttivo delle strutture interne alle alte risoluzioni in modelli animali dal vivo. Questo consente per formazione immagine ripetuta del roditore stesso nel tempo. Questa caratteristica non solo riduce il numero totale dei roditori necessaria in un disegno sperimentale e quindi riduce la variazione inter-soggetta che possa sorgere, ma permette anche ai ricercatori di valutare le risposte longitudinale o tutta la vita ad un intervento. Per acquisire immagini di alta qualità che possono essere elaborate e analizzate per quantificare con maggiore precisione i risultati di micro-architettura dell'osso, gli utenti di in vivo scanner µCT correttamente devono anestetizzare il ratto e posizionare e frenare l'arto. Per effettuare questa operazione, è imperativo che il ratto anestetizzati ad un livello di rilassamento completo, e che pedali riflessi vengono persi. Queste linee guida possono essere modificate per ogni ratto individuo, come il tasso di metabolismo isoflurano può variare a seconda della dimensione del ceppo e del corpo. La tecnica adeguata per acquisizione di immagini in vivo µCT consente la misurazione accurata e coerenza di micro-architettura dell'osso all'interno e attraverso gli studi.

Questo metodo di anestesia per il ratto e il posizionamento e la limitazione dell'arto posteriore per in vivo imaging µCT agevola l'acquisizione di alta qualità immagini appropriato per l'analisi di tibia micro-architettura. Corretto posizionamento dell'arto posteriore del ratto coinvolge la gamba completamente esteso e intero piede e caviglia, trattenuto in schiuma (Figura 1A) risultante in un'immagine acquisita di qualità sufficiente per l'analisi della (micro-architettura trabecolare e corticale Figura 1B). Posizionamento insufficiente e limitazione dell'arto posteriore (Figura 1) può produrre immagini con artefatti di movimento (Figura 1), mentre una coda che non viene completamente rimosso dalla scansione di campo (Figura 1E) interferirà con i raggi x attenuazione di campioni digitalizzati (Figura 1F) e alterare la BMD e tessuto misure di densità minerale (TMD). Uno di questi errori di posizionamento si tradurrà in una scansione di scarsa qualità che non dovrebbe essere ulteriormente analizzata. Raggiungimento immagini di scarsa qualità altereranno la quantificazione della rete trabecolare bene e struttura corticale dell'arto posteriore e produrranno dati inappropriati o inconcludenti14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56346/56346fig1.jpg"> Figura 1. Immagini rappresentative di posizionamento dell'arto posteriore del ratto e corrispondenti immagini acquisite della tibia prossimale in sezione trasversale. (A) il corretto posizionamento della dell'arto posteriore del ratto con la caviglia completamente trattenuta in schiuma, gamba estesa e coda staccò la tibia fornisce sufficiente qualità delle immagini in sezione trasversale (B) della tibia e trabecular e corticale micro-architettura. (C) posizionamento non corretto dell'arto posteriore del ratto con la gamba non completamente esteso e caviglia non completamente trattenuta in schiuma può causare artefatti di movimento (D), visti come striature in sezione trasversale. Oggetti (E) interferire con il campo di vista, come la coda non staccò la tibia (F) interferisce con attenuazione di raggi x dalla tibia e può portare a BMD alterata e TMD misure, sebbene non visivamente evidente. Nell'angolo inferiore sinistro nel pannello F Mostra una parte della coda nel campo visivo, che ha interferito con il fascio di raggi x che successivamente passò attraverso la tibia. Linee rosse tratteggiate nei pannelli a sinistra indicano la sezione trasversale presentata sui pannelli di destro. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/56346fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Complementare figura 1. Isoflurano anestetico unità Isoflurano anestetico unità istituito per fornire 3-4% isoflurane disciolta in O2 ad una portata continua di 1-2 L/min per l'induzione dell'anestesia generale. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_1.jpg">Per favore clicca qui per scaricare questa figura.</a>
Complementare nella figura 2. Garantire la profondità dell'anestesia. Riflessi pedali misura pizzicando le dita dei piedi del ratto che ricevono continue inalato anestetico attraverso una maschera facciale o cono di naso. La risposta al dolore è più evidente quando la gamba è leggermente estesa. Molto forte pizzichi o l'uso di forcipe o morsetti può indurre danni ai tessuti e pertanto non deve essere usato. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_2.jpg">Per favore clicca qui per scaricare questa figura.</a>
Complementare nella figura 3. Schermo cattura di vista di fotocamera monitoraggio fisiologico feed live. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_3.jpg">Per favore clicca qui per scaricare questa figura.</a>
Complementare figura 4. Ratto che pone in posizione supina sul piano dello scanner in fibra di carbonio. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_4.jpg">Per favore clicca qui per scaricare questa figura.</a>
Complementare nella figura 5. Piede del ratto trattenuto in un tubo di gomma piuma malleabile destro. Piede destro del ratto è trattenuto in un tubo di gomma piuma malleabile con le dita che si estende fuori dal tubo (non in foto qui). Il tubo di gomma piuma è trattenuto in un supporto di plastica (fare riferimento alla Tabella di specifici materiali/attrezzature per informazioni più dettagliate). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_5.jpg">Per favore clicca qui per scaricare questa figura.</a>
Complementare nella figura 6. Ratto fissato in posizione con la gamba destra estesa dritto. Il piede sinistro e coda è registrato dalla gamba destra (verso il torso), i fianchi sono protetti e il torso di ratto è avvolto in vet-wrap (blu) per limitare le perdite di calore. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_6.jpg">Per favore clicca qui per scaricare questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography at 

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Corretto posizionamento e trattenuta di un ratto dell'arto per l'Imaging mirato ad alta risoluzione dell'osso utilizzando Micro-architettura In Vivo Micro-tomografia computerizzata

Questa carta indica agli utenti di in vivo scanner micro-tomografia (µCT) come anestetizzare, posizionare correttamente e trattenere l'arto posteriore di un topo per un movimento minimo durante imaging ad alta risoluzione della tibia. Il risultato è immagini di alta qualità che possono essere elaborate per quantificare con precisione micro-architettura dell'osso.

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

proper-positioning-restraint-rat-hind-limb-for-focused-high

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

9.8K Views.  Brock University. Questa carta indica agli utenti di in vivo scanner micro-tomografia (µCT) come anestetizzare, posizionare correttamente e trattenere l'arto posteriore di un topo per un movimento minimo durante imaging ad alta risoluzione della tibia. Il risultato è immagini di alta qualità che possono essere elaborate per quantificare con precisione micro-architettura dell'osso.

Video: Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Ricerca

Bioingegneria

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanoparticelle virali per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Tumore

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

Monitoraggio in tempo reale di alta intensità ultrasuoni focalizzati (HIFU) Ablazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Livers Uso Harmonic Imaging Movimento per Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitativa valutazione della struttura del miocardio, la funzione, la perfusione e sostenibilità Utilizzando cardiaca micro-tomografia computerizzata

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

In vivo small-animal imaging has an important role to play in preclinical studies. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging hybrid imaging modality that shows great potential for both preclinical and clinical applications. Conventional optical parametric oscillator-based PAT (OPO-PAT) systems are bulky and expensive and cannot provide high-speed imaging. Recently, pulsed-laser diodes (PLDs) have been successfully demonstrated as an alternative excitation source for PAT. Pulsed-laser diode PAT (PLD-PAT) has been successfully demonstrated for high-speed imaging on photoacoustic phantoms and biological tissues. This work provides a visualized experimental protocol for in vivo brain imaging using PLD-PAT. The protocol includes the compact PLD-PAT system configuration and its description, animal preparation for brain imaging, and a typical experimental procedure for 2D cross-sectional rat brain imaging. The PLD-PAT system is compact and cost-effective and can provide high-speed, high-quality imaging. Brain images collected in vivo at various scan speeds are presented.

A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

A compact pulsed-laser diode-based photoacoustic tomography (PLD-PAT) system for high-speed in vivo brain imaging in small animals is demonstrated.

Un sistema compatto di Tomografia Photoacoustico ad alte prestazioni per<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging cerebrale di piccole dimensioni

In vivo small-animal imaging has an important role to play in preclinical studies. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging hybrid imaging modality ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Corretto posizionamento e trattenuta di un ratto dell'arto per l'Imaging mirato ad alta risoluzione dell'osso utilizzando Micro-architettura In Vivo Micro-tomografia computerizzata

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