저자 그의 멘토링 및 토론에 대 한 로체스터의 대학에 박사 Abdellatif Benraiss 성인 수술과 신생아 기법 학습 관련 인정 하 고 싶습니다. 저자 또한 자신의 stereotaxic 장비 및 토론의 사용을 위한 UGA에서 박사 제임스 로더 데 일이이 기술에 대 한 방법론 및 연구 대학 과학자 (호) 재단 발전 관련을 인정 하 고 싶습니다 그들의 지원 및 우리의 NIH 지원 (NINDS 부여 R01NS096176-02, R01NS097231-01, & F99NS105187-01).

모든 동물 프로토콜 따라 대학 남부 캘리포니아와 조지아의 대학의 동물 관리 지침을 사용 합니다. 임신 댐 및 성인을 위한 안락사 방법을 승인 된 프로토콜에 따라 수행 됩니다: 이산화탄소 질 식, 뒤에 안락사를 위해 보조 방법으로 자 궁 경관 탈 구. 신생아 강아지 잘린 여 안락사 된다.
주의: 다음 프로토콜 병원 성 바이러스 처리 작업이 포함 됩니다. 바이러스를 처리 하는 동안 적절 한 예방 조치를 취해야 한다. 모든 프로토콜을 사용 하 여 적절 한 기관 위원회 사전에 의해 승인을 받아야 한다.
1. 배아 Intracerebral 접종 Zika 바이러스의
<ol><li>초과 임신 짝짓기, E0.5로 짝짓기 후 하루의 정오를 고려 하십시오. 하루의 끝에서 마우스를 연결 하 고 시간 짝짓기의 다양성을 줄이기 위해 이른 아침에 플러그를 확인 합니다.</li>
	<li>수술 전에 유리 바늘을 준비 합니다. 당겨 바늘의 길이 1/3에서 잘라 다음 50-70 µ m. 체크 바늘 팁 stereoscope 품질 및 파손에 대 한 아래에 기 공 크기가 될 때까지 물 똑으로 micropipette 분쇄기를 사용 하 여 45 ° 각도에서 선명 하 게 합니다.</li>
	<li>계속 바이러스 aliquot 얼음. 수술 직전 준비 유리 주입 바늘 ZIKV 주입 혼합 로드. 어셈블합니다 가스 꽉 주입 주사기 (50 µ L 볼륨), luer 잠금 첨부 파일 및 튜브, 고 미네랄 오일 배관 조립된 주사기를 포화. 일단 포화, 바늘, 연결 하 고 그릴 ~ 바늘에 6-7 µ L ZIKV (~ 1 µ L는 1.7 × 106 TCID50/mL).</li>
	<li>(Intracranial 주입)에 대 한 배아 하루 E14.5 배아와 케 타 민 염 산 염 (80-100 mg/kg)와 xylazine (5-10 mg/kg) 멸 균 생리 식 염 수에 희석 (자궁내 주입)에 대 한 E10.5 배아 임신 C57BL/6J 또는 129S1/SvImJ 쥐를 주사 어머니 마 취 유도를 intraperitoneally. 해당 되는 경우 또는 모니터링된 isoflurane isoflurane 폐기물 가스 청소와 흡입에 의해 제공으로 어머니 anesthetize. Buprenorphine-SR (0.5-1.0mg/kg) 무 통을 유발 하는 것을 피하 주사.</li>
	<li>꼬 집 음 시험 취 발가락 끝 또는 꼬리에 어머니 하 고에 그들을 하다 부정사 동물 승인 난방 패드 (100 x 200 2.5 m m의 열 패드). 발가락 핀치 집게 살 균 되지 않으며 수술에서 조직 처리에 사용 되지 않습니다. 또는, gloved 손 발가락 핀치 철수 반사를 테스트를 사용할 수 있습니다. 참고: 기본 수술 난방 방법에 대 한 기관 수의 직원을 참조 하십시오. 커버는이 난방 패드와 동물 사이 배치 했다.</li>
	<li>눈에 눈 연 고를 추가 합니다.</li>
	<li>복 부의 표면에 면도 하 고 세 번 요오드와 알코올 소독. 요오드와 알코올 잎사귀; 대체 수술 사이트에서 원형 모션 닦으십시오.</li>
	<li>피부 절 개 및 악기의 오염을 피하기 위하여 메 마른 천으로 수술 사이트를 둘러싼 드러 워 진. 참고: 드 레이프 개방 하지 보다 커야 준비 외과 사이트; 머리카락은 드 레이프 오프닝에서 보여야 한다.</li>
	<li>집게와 그녀의 복 부에서 어머니의 피부를 꼬 집 그리고 아랫으로 중간 화살 줄에 1-1.5 cm 선 무 균 수술가 위. 이 피부에 상처 하 고 태아는 이제 노출 되도록 복 부 구멍으로 더. 참고: 수술가 위 incise 피부 및 복 막 층 하는 데 사용 됩니다. 무 균 악기와 장갑 각 수술에 사용 됩니다.</li>
	<li>작은 멸 균 거 즈에 중간에 슬릿을 절단 하 고 외과 여 위에 적용. 멸 균 식 염 수와 하이드 레이트. 4-5 개 이상 배아를 한 번에 한 자 궁 경적에 초점을 제거 하지 하 주의 무 균 거 즈에 슬릿을 통해 배아를 당겨.</li>
	<li>이전에, 그들은 밖으로 건조 하지 마십시오 있도록 접종을 통해 메 마른 염 분으로 배아 하이드 레이트. 추적할 어떤 태아 주입 하 고 자 궁 경적 내의 그들의 위치. 개별 배아 배아 utero에서개발 하는 동안 위치를 변경 하지 마십시오으로 별도 실험, 따라서 처리 됩니다. (1.15 자궁내 주입에 대 한 단계를 계속).</li>
	<li>부드럽게 태아의 머리 아래 주걱 장소. 머리와 두개골 봉합을 시각화 하는 램프와 잘 배아를 밝히는. 참고: 무 균 기술 뒤, 무 균 수술 장갑과 악기를 포함 하 여. 후 살 균 되지 않은 항목 (예: 램프) 조작, 장갑 살 균 악기와 영역을 처리 하기 전에 새로운 멸 균 장갑으로 대체 되어야 한다.</li>
	<li>위치는 태아의 머리까지 (뒤에 시정에 대 한 머리) 램프와 무료 손가락 배아를 조작 하 여 머리를 직접 자 궁 벽에 밀어 이며 비 지배적인 손을 가진 장소에서 개최. 참고: 중요 한 부분과 대부분 연습이 필요 기술 이다 태아 위치. 너무 많은 손가락 압력 치 사 율으로 이어지는 배아 세포 막을 손상 시킬 수 있습니다 그리고 충분 하지 않은 압력 주입을 어렵게 만들 수 있습니다.</li>
	<li>가이드로 두개골 봉합 따라 혈관을 사용 합니다. ZIKV 바이러스를 주입 (~ 1 µ L, 1.7 × 106 TCID50/mL 멕시코 격리 MEX1-44) 조립된 주사기와 바늘 E14.5 태아 두뇌의 측면 뇌 실에. 컨트롤 미디어를 사용 하 여 가짜 사출으로.</li>
	<li>임신의 유지 향상, 난소 옆 두 개의 배아와 위 질 (그림 1A) 옆에 있는 두 개의 배아의 바이러스 주입을 하지 마십시오. 전반적으로, 6 개 이상의 태아 수술 시간을 단축 하며 태아 손실을 방지 쓰레기 당 주입 됩니다.</li>
	<li>임신 댐에 다시 주입된 태아를 놓고와 함께 복 부 구멍 채우기 ~ 0.5 mL 메 마른 염 분. 종료, 먼저 두 복 부 복 막 근육을 봉합 하 고 둘째 4.0 살 균 봉합 외부 피부 층을 봉합. 중단된 봉합;를 사용 하는 것이 좋습니다. 경우 마우스 씹는 다 봉합 상처 dehiscence의 가능성이 있다.</li>
	<li>부분적으로 필요한 경우 탈출 비가 열 영역을 마우스 수 있도록 난방 패드에 휴식에 마우스를 놓습니다. 마 취에서 어머니 (1-2 h)를 복구 하는 동안 모니터링 합니다. 수술에 대 한 다양 한 개별 실험에 따라 시간 후 배아를 개발 합니다.</li>
	<li>
자궁내 주입
	<ol>
<li>한 자 궁 경적 및 노출 태아를 사용 하 여 1 mL 주사기와 27 G 바늘 주사 100 μ Zika 바이러스 (106 TCID50 단위 100 μ DMEM에), 또는 제어 매체, 자궁내 공간으로 또는 placental 조직으로. Note는 배아 배아 단계 해에 대 한 주입 되어 있다. 자세한 내용은18에 대 한 이전 게시 된 작업을 참조 하십시오.</li>
		<li>임신 댐에 다시 주입된 태아를 놓고와 함께 복 부 구멍을 채우기 ~ 0.5 mL 메 마른 염 분. 닫습니다, 먼저 복 부 복 막 근육을 봉합 하 고 둘째 4.0 살 균 봉합 외부 피부 층을 봉합 합니다. 중단된 봉합;를 사용 하는 것이 좋습니다. 경우 마우스 씹는 다 봉합 상처 dehiscence의 가능성이 있다.</li>
		<li>부분적으로 필요한 경우 탈출 비가 열 영역을 마우스 수 있도록 난방 패드에 휴식에 마우스를 놓습니다. 마 취에서 어머니 (1-2 h)를 복구 하는 동안 모니터링 합니다. 수술에 대 한 다양 한 개별 실험에 따라 시간 후 배아를 개발 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 신생아 Intracerebral 접종 Zika 바이러스의: P0/P1
<ol><li>가스 꽉 주입 주사기 (10 µ L 볼륨) 및 바늘 하지 막혀 있는지 확인 합니다. 청소 하 고 26-게이지 바늘 3 20 mL 일회용 주사기를 로드 하 여 테스트: 한 식 염 수, 70% 에탄올, 및 공기 솔루션을 취소. 이전 바이러스 주입에 사용 하는 경우에 10% 표 백제로 소독.</li>
	<li>얼음에 바이러스를 유지. 주사기는 주사기에 죽은 볼륨을 줄이기 위해 염 분으로 작성 하 여 로드 하 고 염 분 해결책 주입 물질에서 분리 하는 공기의 0.75 µ L를 그립니다.</li>
	<li>주입 된 강아지는 따뜻하게 습도 복구 챔버를 설정 합니다. 열 블록을 사용 하 여, 멸 균 거 즈와 closeable 컨테이너 (예: 빈 팁 상자) 놓고 식 염 수와 축이다. 주사를 시작 하기 전에 그것을 예 열.</li>
	<li>펌프 및 컨트롤러를 포함 하 여 microinjector를 설정 합니다. 장치 유형 코드 특정 주사기에 대 한 결정 (즉, 10 µ L 주사기, 장치 종류에 대 한 "D"는 이다). 사출 속도 결정 합니다.</li>
	<li>수술 설치 근처 출생 후 하루 0 또는 1 강아지 (P0/P1)를 수집 합니다. 바이러스 주입 주사기를 로드 합니다. 70%와 강아지 머리 산 소독 EtOH.</li>
	<li>거 즈의 얇은 층에 새끼를 포장 하 고는 마 취 상태를 달성 하기 위해 얼음에서 그들을 완전히 묻어. 강아지는 5 분은 새끼는 충분히 마 취 주입에 대 한 응답 없이 꼬리/발가락 핀치를 수행 하 여 확인에 대 한 cryoanesthetized. 이 대략 15 분의 마 취 상태 생성합니다.</li>
	<li>강아지에 머리 산, 요오드, 에탄올 머리의 표면에 소독 (세 번) 놓고 다음 살 균 삭제 기능으로 닦아 건조 (소 프로 파 놀 또는 70 %EtOH).</li>
	<li>람다 블랙 마커를 표시 하 고 람다 stereotaxic 악기를 사용 하 여 좌표를 기록 합니다. 눈와 람다 stereotaxic 좌표에서 가장자리에 람다에서 거리 측정 람다 (두 반구 둘 다를 주입 하는 경우)에 대 한 눈의 2/5 거리를 계산 합니다.</li>
	<li>다시 마 취 깊이 주사 사이트에 대 한 구멍을 만들기 전에 확인 합니다. 26-게이지 바늘을 사용 하 여 신중 하 고 피상적으로 두 피와 두개골 (두개골은 매우 부드러운 신생아에) 주입 위치에 주사 바늘에 대 한 개방을 만들려고 펑크.</li>
	<li>주사 바늘 구멍이 위치에 낮은 고 바늘은 그냥 피부 위반, 일단 stereotaxic 악기를 사용 하 여 사출 사이트 (측면 심)에 대 한 1 mm 깊이 계산.</li>
	<li>일단 바늘 주입 깊이를 낮 췄 다, 프로그램 삽입 microinjector: 1 µ L 10 nL/s, 1.5 분 이상 약 1 µ L 주입의 속도에서 바이러스의 (~ 1 μ 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV).</li>
	<li>때 주입 완료, 대기 30 s, 바늘을 철회 하 고 (dorsally) 나사를 회전 하 여 0.5 m m 단위로, 대기 30 각 증가 후 s. 참고:이 주입 된 바이러스의 누설을 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>일단 제거 하거나 신속 하 게 로드 바늘과 주사기 더 많은 바이러스 (다른 바이러스 또는 모의 컨트롤 로드 해야 별도 주사기/바늘에) 미리 데워 진된 습도 챔버에 머리 산에서 강아지를 제거 하거나. 몇 분 마다 복구를 측정 하는 강아지를 모니터링 합니다. 그 쓰레기 새끼를 바꿉니다.</li>
</ol>3. 성인 Intracerebral 접종 Zika 바이러스의
<ol><li>주사 마 취를 유도 하기 위해 멸 균 식 염 수에 희석 하는 케 타 민 염 산 염 (80-100 mg/kg)와 xylazine (5-10 mg/kg) intraperitoneally 성인 쥐. Buprenorphine-SR (0.5-1.0mg/kg) 무 통을 유발 하는 것을 피하 주사. 발가락/꼬리의 마 취 상태를 확인 하 고 그 후 마운트 (생리대)와 stereotaxic 악기에 수술 하는 동안 머리를 고정 마우스를 꼬집어.</li>
	<li>마우스의 눈 수술 하는 동안 밖으로 건조 하지 않도록 눈 안과 연 고를 추가 합니다. 귀 앞에 눈 뒤에 시작 하는 두 피를 면도. 요오드와 70% 노출 된 피부를 소독 EtOH 3 번. 요오드와 알코올 잎사귀; 대체 수술 사이트에서 원형 모션 닦으십시오.</li>
	<li>다시 피부를 incising 전에 마 취 깊이 확인 합니다. 메스를 사용 하 여, 확인 머리의 화살 중간 라인을 따라 0.5 c m 절 개 소독된 위치에 bregma 노출 합니다. 솜 밀고 주걱으로 롤링 모션을 사용 하 여, 사출 사이트에서 피부를 동시에 추진 하는 동안 meningeal 조직, 두개골의 표면 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>수술 드릴 비트 정렬 bregma에서 시작, 및 다음 좌표를 사용 하 여 사출 사이트 식별: AP-0.5 m m, ML: ± 1.5 m m. 제어 발 페달을 사용 하 여, 천천히만 구멍 바늘에 대 한 삭제 되었습니다 때까지 뼈를 드릴로 두개골을 드릴.</li>
	<li>Microinjector 펌프와 가스 꽉 주사기 (10 µ L 볼륨)에 stereotaxic 드릴을 교체 합니다. 무승부는 생리 식 염 수와 바이러스 사이 작은 기포를 떠나 ~ 바이러스의 µ L 4-5. 특정 주사기 볼륨 (즉, 10 μ 볼륨 주사기에 대 한 D)에 대 한 장치 유형 코드를 확인 합니다. DV 바늘 낮은:-1.5 m m 뇌 표면에서. 바이러스의 1 µ L를 투입, 10 nL/s, 1.5 분 이상 약 1 µ L 주입의 프로그램.</li>
	<li>때 주입 완료, 대기 30의 30을 기다리고 0.5 m m 단위로 바늘을 제거 하 고 각 턴 후 s. 이 역류와 주입 된 바이러스의 유출을 감소 시킨다.</li>
	<li>injection(s) 끝나면는 집게를 사용 하 여 피부를 느슨하게 노출된 두개골을 복구. 봉합 사 두 피 4.0 봉합을 사용 하 여 함께 다시 고 stereotaxic 악기에서 마우스를 제거 마 취에서 필요한 경우 비가 열 영역을 탈출 하 고 그들은 (1-2 h)을 복구 하는 동안 모니터 마우스를 수 있도록 장소 부분적으로 난방 패드에 휴식에 마우스.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

여기서 설명 하는 것은 두뇌 개발에 ZIKV 유도 손해의 조사에 대 한 미 발달, 신생아, 및 성인 단계에는 ZIKV의 intracerebral 접종에 대 한 방법이입니다. 동안 간단, 조사 연구의 품질 및 그 참여의 안전을 보장 하기 위해 취해야 하는 몇 가지 고려 사항이 있다.
DENV는 flavivirus 속에 ZIKV 밀접 하 게 관련 있다. DENV 하지 원인이 인 간에 있는 소아 뇌 장애와 연결 되어있다. DENV2 수 있습니...

Microcephaly 결함이 두뇌 개발 신생아에서 평균 머리 크기 보다 작은 특징에서 유래 하는 조건입니다. Microcephaly 어린이 발달 지연, 발작, 지적 장애, 난청, 시력 문제, 그리고 운동 및 균형, 다른 가운데, 질병의 심각도 따라 문제를 포함할 수 있는 증상의 범위를 전시 하 고 원인1,2,3. 이 상태는 자연, 유전적, 전염 성 에이전트와 일으키는 microcephaly4,,56,,78에 연결 하는 환경 요인에 multifactorial 9. ZIKV 2015-2016 발발 전에 10000 출생에서 8 어린이 microcephaly10CDC 따르면 미국에서 진단 했다. 에 2 월 1일 2016 년 세계 보건 기구 선언 Zika 바이러스 microcephaly 진단 어머니11, ZIKV 감염과 관련 된 놀라운 증가로 인해 국제 관심사의 공중 보건 비상 사태 12. 미국에서 ZIKV 경우에 CDC에서 최근 연구 개발 microcephaly 미국에서 감염 되지 않은 개인, 및 ZIKV 감염 어머니의 4%에 비해 자녀에 대 한 위험을 증가 20-fold에 모성 ZIKV 감염 결과 귀착되 었 제안 microcephaly11아이 들. 브라질의 ZIKV 감염에서 임신 중 microcephaly 관련 된 출생 결함의 비율 최대 17% 라틴 아메리카에 있는 다른 요인 위험 증가에 기여 수 있습니다 나타내는 감염 된 어머니에 아기의 영향을 보고 되었습니다. 13. 우리는 ZIKV은 신경 조상 세포 (NPC) 인구7,,814는 microcephaly pathogenesis 발생할 수 있습니다 알고, 하는 동안 개발에 ZIKV의 완전 한 병 인 뇌 애매 하 게 남아 있다. 그것은 더 ZIKV 감염과 관련 된 뇌 이상이 기본 질병 메커니즘을 조사 하기 위해 동물 모델을 개발 하는 것이 중요입니다.
직접 효과 ZIKV는 두뇌 개발에 연구, 우리는 먼저 ZIKV7배아 일 14.5 (E14.5) 두뇌의 intracerebral 접종을 사용 하 여 마우스 모델을 개발 했다. 이 단계는 인간의 임신14첫 번째 임신의 끝의 대표자 이라고 여겨진다으로 선정 되었다. 새끼는 출생 후 하루 5 (P5)이 배아 intracerebral 주입 방법으로 살아남을 수 (~ 106 조직 문화 감염 복용량 (TCID50/mL) x 1.7의 1 µ L). 이러한 산 후 새끼 고기 마찬가지로 확대 심, 신경 손실, axonal 희박, astrogliosis, 및 microglial 활성화12,15를 포함 하 여 감염 된 인간 유아에서 관찰의 범위를 전시 한다. 신생아 쥐의 뇌 중간 임신16, 인간 두뇌의 발달 단계에 가깝다 상대적으로 성숙 이며 마우스 두뇌 개발 주요 출생 후 구성 요소를 포함 합니다. 공부 하 고 나중에 임신 단계 감염, 출생 후 감염에 대 한 방법은 또한 설명 합니다. 신생아 감염 p 1에서 ZIKV 13 일 후 주입에 살아남을 수 있습니다. 혈액 태어난 성인 무대 감염 마우스 이전17 만 사용 해야 합니다에 설명 하 고 인터페론 (IFN) 규정 요인 (IRF) 녹음 방송 요인 IRF-3,-5,-7 트리플 녹아웃 스트레인. 이 프로토콜 murine 모델은 성인에서의 항 바이러스 반응 억제를 회피 하는 intraventricularly ZIKV를 접종 하는 방법을 설명 합니다. 동안이 circumvents murine 면역 시스템, 주입의이 경로 감염의 전형적인 경로 모방 직접 않습니다. 이러한 불일치를 해결 하기 위해 직접는 실험 intracranial 경로 대신 ZIKV의 자궁내 감염을 수행할 수 있습니다. 이전 작업18채택, 우리 간단히이 배아 감염 프로토콜에서이 기법을 설명 했습니다.
이 기술로 구현 Zika 바이러스 변종 멕시코 격리 MEX1-447,19 와 아프리카 씨-766 194720에 고립 된 분리 있습니다. Zika MEX1-44 감염된 Aedes aegypti 에서 2016 년 1 월에에서 치아 파스, 멕시코에서 분리 되었습니다 모기. 우리는 텍사스 대학 의료 지점 Galveston (UTMB)에서 통해 권한이 있는이 바이러스를 얻었다. 또한, 뎅기열 바이러스 serotype 2 (DENV2)이이 기법을 사용 하 여 비교 연구에 주사 했다. DENV2, 스트레인 S16803 (시퀀스 은행 GU289914), 1974 년에 태국에서 환자 샘플 로부터 격리 했다 및 C6/36 셀에 passaged. 바이러스는 passaged Vero 세포에 (서) 두번 세계 참조 센터 신흥 바이러스 및 Arboviruses (WRCEVA)에 대 한 마우스 주사 하기 전에. 이이 기술을 동일 하 게 작동 하는 방법을 보여 줍니다 ZIKV 및 두뇌 발달에 영향을 미칠 수 있는 다른 flaviviruses의 다양 한 변종에 대 한 잘.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39416001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stereotax</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>04557R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro4 Microsyringe Pump Controller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP3 UltraMicroPump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modulamp</td>
			<td>Schott</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock tubing (19-gauge)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>90619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melting Point Capillary</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>34500-99</td>
			<td>Glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R25</td>
			<td>No dilution; Use for practice injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, Model 1701 LT SYR</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80001</td>
			<td>for embryonic inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80030</td>
			<td>for neonate/adult</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Ethilon Nylon Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fastgreen FCF Dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7252</td>
			<td>inject with 0.5% Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flavivirus group antigen antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td>ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6</td>
			<td>DBHB</td>
			<td>Pax6-s</td>
			<td>ms IgG1 1:20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing mouse models for zika virus-induced neurological disorders using intracerebral injection strategies: embryonic, neonatal, and adult

Zika 바이러스 (ZIKV) 북쪽, 중앙, 그리고 남아메리카에 현재 발병 flavivirus는 이다. 이제는 ZIKV microcephaly 및 추가 뇌 이상이 발생할 수 있습니다 설치 된다. 그러나, 발전 두뇌에 있는 ZIKV의 병 인을 기본 메커니즘 불분명 남아 있습니다. Intracerebral 수술 방법은 자주 주소 질문 정상과 비정상적인 두뇌 개발 및 뇌 기능에 대 한 신경 과학 연구에 사용 됩니다. 이 프로토콜 클래식 수술 기법을 활용 하 고 마우스 신경 시스템에서 하나의 모델 ZIKV 연관 된 인간의 신경 질환을 허용 하는 방법에 설명 합니다. 직접 뇌 접종 바이러스 전송의 정상 모드를 모델링 하지 않습니다, 하는 동안 메서드를 사용 하면 개발 두뇌의 ZIKV 감염 후 결과 관한 대상 질문을 조사 수 있습니다. 이 프로토콜의 ZIKV intraventricular 접종의 미 발달, 신생아, 및 성인 단계를 설명합니다. 일단 마스터,이 방법만 수행 하는 몇 시간을 소요 하는 간단 하 고 재현성 기술 될 수 있다.

미 발달 두뇌의 ZIKV 접종에 대 한 우리의 주입 방법의 대표 이미지 intracerebral 주사 (그림 1A)를 묘사 하는 다이어그램에 표시 됩니다 및 자궁내 intraplacental 주사 (그림 1B), 설명 하 고는 방법은 임신 댐과 배아에 볼와 수술 (배아 접종 프로토콜)에 대 한 지향 있어야 합니다. 그림 2A 전시 E18.5 대뇌 피 질에서 ZI...

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Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Zika 바이러스 유도 신경 장애 Intracerebral 주입 전략을 사용 하 여 마우스 모델을 수립: 배아, 신생아, 및 성인

여기는 마우스에서 바이러스 유도 microcephaly Zika의 모델을 설정 하는 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 Zika 바이러스의 미 발달, 신생아, 그리고 성인 무대 intracerebral 접종에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

establishing-mouse-models-for-zika-virus-induced-neurological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K 조회수.  University of Georgia. 여기는 마우스에서 바이러스 유도 microcephaly Zika의 모델을 설정 하는 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 Zika 바이러스의 미 발달, 신생아, 그리고 성인 무대 intracerebral 접종에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

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Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most commonly used procedure for human tumor xenograft establishment consisted of the collection of cells from culture flasks, followed by the subcutaneous injection of the collected cells in immunocompromised mice. Whereas this approach still sees frequent use in many laboratories, there has been a significant shift in emphasis over the past decade towards orthotopic xenograft establishment, which, in the instance of brain tumors, requires tumor cell injection into appropriate neuroanatomical structures. Because intracranial xenograft establishment eliminates the ability to monitor tumor growth through direct measurement, such as by use of calipers, the shift in emphasis towards orthotopic brain tumor xenograft models has necessitated the utilization of non-invasive imaging for assessing tumor burden in host animals. Of the currently available imaging methods, bioluminescence monitoring is generally considered to offer the best combination of sensitivity, expediency, and cost. Here, we will demonstrate procedures for orthotopic brain tumor establishment, and for monitoring tumor growth and response to treatment when testing experimental therapies.

Luciferase-modified human brain tumor xenografts can be established intracranially in athymic mice, with subsequent monitoring of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. In combination with survival analysis, bioluminescence monitoring is an essential research tool for pre-clinical testing of therapies being considered for treating brain tumors.

Bioluminescence 이미징을 사용하여 종양 성장과 치료에 반응 이후 분석 Intracranial 뇌종양의 Xenografts 구축

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

연구

신경과학

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

3D 이미징 및 형태학의 분석을위한 성인 마우스 뇌혈관 캐스팅

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

성인 마우스 Utricle 및 아데노 바이러스 - 매개 지원하는 세포 감염의 해부

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. Generally, the dyes are applied as solid crystals or by local pressure injection using glass pipettes. However, this can result in dilution of the dye and reduced labeling intensity, particularly when several hours are required for dye diffusion. Here we demonstrate a simple and low-cost technique for introducing fluorescent and ion-sensitive dyes into neurons using a polyethylene suction pipette filled with the dye solution. This method offers a reliable way for maintaining a high concentration of the dye in contact with axons throughout the loading procedure.

We describe a simple and low cost technique for introducing high concentration of fluorescent and calcium-sensitive dyes into neurons or any neuronal tract using a polyethylene suction pipette.

신경, 책자, 그리고 형광 염료와 척수 뿌리 역행로드

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell lineage development. In vitro expansion of neural progenitors from fetal CNS tissue has been well characterized. Despite the identification and isolation of glial progenitors from adult human sub-cortical white matter and development of various culture conditions to direct differentiation of fetal neural progenitors into myelin producing oligodendrocytes, acquiring sufficient human oligodendrocytes for in vitro experimentation remains difficult. Differentiation of galactocerebroside+ (GalC) and O4+ oligodendrocyte precursor or progenitor cells (OPC) from neural precursor cells has been reported using second trimester fetal brain. However, these cells do not proliferate in the absence of support cells including astrocytes and neurons, and are lost quickly over time in culture. The need remains for a culture system to produce cells of the oligodendrocyte lineage suitable for in vitro experimentation.
Culture of primary human oligodendrocytes could, for example, be a useful model to study the pathogenesis of neurotropic infectious agents like the human polyomavirus, JCV, that in vivo infects those cells. These cultured cells could also provide models of other demyelinating diseases of the central nervous system (CNS). Primary, human fetal brain-derived, multipotential neural progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons (progenitor-derived neurons, PDN) and astrocytes (progenitor-derived astrocytes, PDA) This study shows that neural progenitors can be induced to differentiate through many of the stages of oligodendrocytic lineage development (progenitor-derived oligodendrocytes, PDO). We culture neural progenitor cells in DMEM-F12 serum-free media supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrophic factor 3 (NT-3), N-2 and triiodothyronine (T3). The cultured cells are passaged at 2.5e6 cells per 75cm flasks approximately every seven days. Using these conditions, the majority of the cells in culture maintain a morphology characterized by few processes and express markers of pre-oligodendrocyte cells, such as A2B5 and O-4. When we remove the four growth factors (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) and add conditioned media from PDN, the cells start to acquire more processes and express markers specific of oligodendrocyte differentiation, such as GalC and myelin basic protein (MBP). We performed phenotypic characterization using multicolor flow cytometry to identify unique markers of oligodendrocyte.

Primary, human fetal brain-derived, multipotential progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons and astrocytes. This work shows that neural progenitors can be induced to differentiate through stages of the oligodendrocytic lineage by conditioning with select growth factors.

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...