신경 염증은 다양한 신경 장애의 핵심 요소입니다. 따라서 병리학 적 발달 연구를 촉진하기 위해 대체 생체 내 신경 염증 모델을 연구하고 개발하는 것이 큰 관심사입니다. 여기에 설명 된 기술은 생체 내 영상을 통해 뇌의 병리학 적 변화를 더 잘 이해하고 가능한 항 신경 염증 약물을 빠르고 효율적으로 평가할 수있는 훌륭한 도구입니다.
유리 모세관 당김을 위한 5단계 프로토콜에 따라 마이크로피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 당겨 주사를 준비합니다. 집게를 사용하여 바늘 끝을 적절한 크기로 엽니 다. 거품이 없는지 확인하기 위해 바늘에 0.1ml의 미네랄 오일을 채 웁니다.
미세 주입 장치의 강철 바늘의 나사 캡을 제거합니다. 유리 바늘 구멍을 강철 바늘에 맞춘 다음 나사 캡을 조입니다. 적재 된 바늘 미세 주입 장치를 미세 조작기에 장착하십시오.
미세 조작기가 현미경으로 장치를 유연하게 움직일 수 있도록 미세 주입 장치의 위치를 조정하십시오. 강철 바늘이 모세관 유리관에 들어가도록 하는 데 필요한 적절한 양의 파라핀 오일을 배출합니다. PBS 또는 리포폴리사카라이드로 구성된 주사액을 70%에탄올로 멸균된 유리 슬라이드에 떨어뜨리고 팁이 액적물에 삽입되도록 미세주입장치를 조절한다.
약 2 마이크로 리터의 주사액을 바늘에 넣습니다. 미세 주입 장치의 바늘 끝이 고배율의 유충과 동일한 시야에 있도록 미세 조작기를 설치하십시오. 마이크로파를 사용하여 이중 증류수에 2%아가로스 용액을 녹입니다.
녹은 아가 로스를 플라스틱 접시에 붓습니다. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 마취된 유충을 2%아가로스 코팅 플라스틱 접시의 중앙으로 운반합니다. 장착 된 유충이 바늘에 접근 할 수 있도록 뇌면이 위로 향하도록 향하게하십시오.
제브라 피쉬의 뇌실 구조가 시야에 명확하게 표시되도록 현미경의 배율을 조정하십시오. 바늘을 뇌 텍텀 위에 조심스럽게 놓습니다. 70 % 에탄올로 뇌 부위를 청소하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘 끝으로 제브라 피쉬 뇌의 피부를 천천히 뚫습니다.
풋 페달을 밟아 1나노리터의 1X PBS 또는 다른 농도의 지질 다당류를 배출합니다. 주사 직후 유충을 깨끗한 E3 배지로 옮깁니다. 24 시간 후, 현미경 영상, 기관차 행동 분석 및 기타 지표의 결정을 위해 유충을 수집합니다.
E3 배지에 1.5% 저용융 아가로스 용액을 준비하고 전자레인지로 가열하여 투명한 액체를 형성합니다. 깨끗한 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 유충을 유리 슬라이드로 옮기고 가능한 한 많은 물을 제거하십시오. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 유충에 1.5%저용융 아가로스 한 방울을 추가합니다.
1 밀리리터 주사기 바늘을 사용하여 유충의 방향을 잡으십시오. 이미징을 시작하기 전에 아가로스가 식고 응고 될 때까지 기다리십시오. 지질 다당류 뇌실 주사 후 24 시간에, 유전자 발현 마커 결정을 진행한다.
두 개의 1 밀리리터 주사기를 사용하여 눈과 난황낭 영역이없는 유충의 머리 부분을 분리하십시오. 조직 분쇄기를 사용하여 200 마이크로 리터의 RNA 추출 시약으로 헤드 부분을 분당 11, 000 회전으로 5 초 동안 균질화 한 다음 클로로포름 이소프로판올 방법을 사용하여 RNA 추출을 수행하십시오. RNA 펠릿을 5분에서 10분 동안 자연 건조시킨 다음 RNAse가 없는 물 30마이크로리터를 추가하여 RNA 펠릿을 용해시킵니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 무작위 프라이머와 함께 역전사효소를 사용하여 cDNA를 합성합니다. 다음으로, 시판되는 RT-qPCR 키트를 이용하여 qPCR 시스템에서 실시간 PCR을 수행하여 표적 유전자의 발현을 확인한다. 지질 다당류 뇌실 주사 후 24 시간에, 제브라 피쉬 유충을 96 웰 사각형 마이크로 플레이트의 웰로 개별적으로 옮깁니다.
각 웰에 300마이크로리터의 E3 배지를 추가한 다음 유충을 4시간 동안 배양하여 테스트 플레이트에 적응시킵니다. 유충이 로딩된 마이크로플레이트를 제브라피쉬 추적 상자로 옮깁니다. 광원을 켜고 환경에 적응하기 위해 테스트 상자에서 유충을 30 분 동안 배양하십시오.
자동 비디오 추적 시스템을 사용하여 제브라 피쉬 행동을 모니터링하고 기록합니다. 개별 제브라 피쉬 유충에 대해 각각 5 분씩 12 세션을 기록하고 텍스트 원고에 설명 된대로 총 거리를 정의하십시오. 24 시간 동안 치료 한 후, 리포 폴리 사카 라이드 심실 뇌 주사 밀리리터 당 1-5 밀리그램은 대조군 및 가짜 그룹에 비해 TgEtvmat2 : GFP 유충 제브라 피쉬의 뇌에서 RA 뉴런의 상당한 손실을 유도했습니다.
트랜스제닉 라인 elavl3:mCherry zebrafish는 밀리리터당 2.5-5밀리그램의 리포폴리사카라이드를 주사했을 때 유충 뇌 뉴런의 형광 통합 밀도에 상당한 변화가 있는 반면, 밀리리터당 1밀리그램의 리포폴리사카라이드 주사는 효과가 없었습니다. 또한, 밀리리터당 5밀리그램의 지질 다당류는 운동 결핍을 유발하고 60분의 추적 기간 동안 제브라피쉬의 총 이동 거리를 감소시켰습니다. 제브라피쉬 유충의 머리에서 전염증성 사이토카인의 아산화질소 생산 및 mRNA 발현은 대조군 및 가짜 군에서의 발현에 비해 밀리리터당 2.5 내지 5 밀리그램 리포폴리사카라이드 처리에서 증가하였다.
밀리리터당 1-5밀리그램의 리포폴리사카라이드를 주입한 결과 애벌레 제브라피쉬 뇌에 호중구가 동원되어 Tgmpo:eGFP 제브라피쉬 뇌 영역에서 호중구 수가 크게 증가했습니다. 바늘의 개방 크기와 미세 주입을위한 주입력의 양과 함께 제브라 피쉬의 눈과 몸에서 머리 분리가이 절차에 중요합니다.
