우리 몸은 매일 1~100억 개의 세포세포를 생성합니다. 이러한 세포의 효율적인 클리어런스는 세포 이물질을 제거하고 재고를 유지하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 많은 다른 식세포 유형에 의한 세포 결합 및 섭취를 특성화하기 위해 많은 응용 분야에서 사용될 수 있다.
이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 수석 기술자 인 Yuxuan Zhen이 될 것입니다. 티모사이클을 수확하려면, 순진한 C57 블랙 6 마우스의 가슴 구멍을 연 후, 구겨진 미세 팁 집게를 사용하여 흉선을 뽑아냅니다. 기관기를 RPMI 1640 배지의 10 밀리리터를 포함하는 조직 배양 접시에 넣습니다.
두 현미경 슬라이드의 서리가 내린 끝에 대한 전체 흉구를 갈기와 50 밀리리터 튜브로 70 마이크로 미터 세포 여과기를 통해 결과 조직 현탁액을 필터링합니다. 원심분리로 티모사이클을 수집하고 40 밀리리터로 펠릿을 재보종하십시오. 계산 후, 원심 분리하고 50 밀리리터 튜브 당 신선한 PBS의 20 밀리리터에서 8 세포에 최대 2 회 10 을 다시 일시 중단합니다.
튜브 당 PBS의 20 밀리리터에 5 개의 마이크로 몰러 CFSE로 세포를 라벨. 튜브를 2~3번 반전한 후 빛으로부터 보호되는 실온에서 2분 이상 티모사이클을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 열 불활성화 말 혈청의 10 밀리리터와 반응을 중지하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.
계산 및 원심 분리를 위해 40 밀리리터의 신선한 PBS에서 표지된 세포를 다시 중단하고 40 밀리리터의 중간 체정제를 추가로 세척합니다. 중간 세척 후, 티모세포를 조직 배양 배지 농도의 밀리리터당 6개 세포로 7배 10회 로 재보중단하고 세포를 100mm 조직 배양 접시에 종자한다. 그런 다음 1개의 마이크로몰라 최종 농도에서 세포 배양에 staurosporine를 추가하고 4시간 동안 조직 배양 배양인에 판을 놓습니다.
복막 대식절 절연의 경우, 5일째복리토네움을 방해하지 않고 복부 피부를 열기 전에 0일 0시에 3%의 밀리리터 1밀리리터로 C57 블랙 6 마우스 를 주체적으로 주입한다. 복막 구멍을 플러시하려면 18 게이지 바늘이 장착된 10 밀리리터 주사기를 사용하여 10 밀리리터의 세척 버퍼를 캐비티에 빠르게 밀어 넣은 후 수집을 위한 세척 버퍼를 50 밀리리터 튜브로 천천히 흡입합니다. PBS로 두 번 간 간수 암싸이를 씻으시면 됩니다.
회막 대식세포는 조직 배양 배지 농도의 밀리리터당 6개의 세포로 2회 10회에서 재연한다. 다음 씨앗 500 대식세포의 마이크로 리터 는 24 우물 플레이트의 각 우물에 2 시간 동안 조직 배양 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 인큐베이션의 끝에서, 부동 세포를 제거하고 각 우물에 조직 배양 배지의 500 마이크로 리터를 추가하는 슈퍼 나티컬을 흡인.
즉시 배양의 각 웰에 배지의 500 마이크로 리터에 6 개의 티모사이클에 0 ~ 12 회 10 을 추가하고 4 시간 동안 조직 배양 배양에 접시를 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 신선한 PBS로 각각 두 번 잘 씻고 무료 부유식 세포를 제거하고 염색 버퍼로 단일 세척을 합니다. 다음으로 플레이트 바운드 대식세포에 200 마이크로리터의 염색 버퍼를 잘 하여 적절한 안티 CD11b 항체로 보충하고 플레이트를 섭씨 4도에서 20분 동안 배치합니다.
이 대표적인 실험에서, 최대 30%의 티오글리콜레이트가 자극된 복막 대식세포는 CFSE 채널에서 이러한 phagocytes가 CFSE 표지된 세포세포를 섭취했음을 나타내는 긍정적인 신호를 입증하였다. 세포 세포의 대식세포 침몰의 현미경 관찰은 CFSE 양성 대식세포가 개별 대식세포 내의 세포 수가 다르다는 것을 나타내는 다른 강도로 인해 오른쪽 하단사분면에 퍼지기 때문에 세포 세포가 세포 세포를 섭취하는 대식세포의 용량을 조사하는 데 필수적이다. 대식세포에 대한 세포 세포의 비율이 높을뿐만 아니라 세포 세포 섭취를 하는 대식세포의 수가 증가할 뿐만 아니라 대식세포가 더 많은 세포 세포를 섭취하는 능력을 향상시킵니다.
실험의 또 다른 세트에서, 대식세포의 대략 15%는 CFSE가 세포세포가 phagocytic 대식세포이었다는 것을 나타내는 4 시간 동안 대식세포 배양에 추가될 때 CFSE 양성이 되었다. 메르 항체블록대식 세포세포는 투여의존적 방식으로, 전체적인 막힘은 현재 설정에서 약 30%의 효능 효율을 차지할 수 있다. 또한, 새로 승인된 TAM 수용체 억제제는 약 100 나노몰러 농도까지 투여 의존성 방식으로 대식세포증을 감쇠시한다.
이 숫자는 직접 efferocytosis의 효율성에 영향을 미치기 때문에 항상 세포 세포의 백분율을 확인하는 것을 기억하십시오. phagocytic 대식세포는 침몰 과정에 의해 통제되는 신호 분자를 조사하고 삼키는 의 역학을 연구하기 위하여 현미경 검사법에 의해 서양 얼룩에 의해 추가 분석될 수 있습니다.
