이 연구는 도이치 가운데 (DFG;에 의해 지원 되었다 SFB1118)입니다. 저자는 해 부의 대부분을 수행 하 고 유익 하 게이 지식을 전송에 대 한 악 셀 Erhardt와 박사 Volker 엑스 타인과 교류 cytometer의 기술적인 측면에 도움을 위한 감사 하 고 싶습니다.

야생-타입 C57BL/6 마우스 (남성, 10 ~ 12 주) 표준 12 h 명암 주기에서 유지 했다 그리고 표준 차 다이어트와 물에 대 한 무료 액세스를 제공 했다. 모든 동물 실험 지역 동물 관리 및 사용 위원회 관련 지침에 따라에서 실시 하 고 Karlsruhe, 독일 (G216/10)에 지역 권위에서 로컬 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1입니다. 마우스의 관류
<ol><li>희생 마우스 (C57BL/6; 남성; 10-12weeks) CO2 를 사용 하 여 지역 규정에 따라. 참고: EDTA 코팅 1.5 mL 튜브를 사용 하 여 제어 백혈구를 수행할 수 있습니다 복고 궤도 출혈. 이 방법은 출혈만 희생 직후 효율적입니다. 더, 복 막 구멍 게 (PCL) 융합 관류를 방해할 수 있습니다 혈액의 찬 들을 피하기 위해 37 ° C에서 미리가 열된 PBS를 사용 하 여 제어 세포를 얻기 위해 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>후 한 70 %v / v 에탄올과 모피는 복 부에 살포 하 고 반복적으로 코 튼 거 즈와 휴지로 닦아 하 여 마우스를 소독. 세로 절 개 하 여 복 부 피부 오픈 컷 무딘가 위를 사용 하 여.</li>
	<li>처음 만드는 곡선, 무딘가 위를 사용 하 여 및 다음 흉 곽의 전체 길이 따라 절 개를 확장 횡 경 막으로 절 개 하 여 흉 막 캐비티를 노출 합니다. 흉 골 떨어져 신중 하 게 해제를 수 때까지 contralateral 쪽에 비슷한 상처를 확인 합니다.</li>
	<li>심장과 주요 혈관의 명확한 전망, 삽입 나비 23¾ 계기 바늘, 50 mL 주사기에 연결 되어 심장의 왼쪽된 상공에 얼음 처럼 차가운 PBS, 가득 합니다.</li>
	<li>하강 대동맥 손상 없이 가능한 콘센트의 대형을 아이리스가 위를 사용 하 여 심장의 오른쪽 아 트리 움을 절 개 하 고 다음 주사기를 약을 부드럽게 우울 30 mL PBS의. exudate 분명 실행 되어야 합니다. 간 및 신장의 좋은 관류의 지시자로 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2입니다. 좌 골 신경 및 DRG의 해 부
참고: 좌 골 신경의 해 부에 대 한 gluteus 막시무스 제거 되 고 마우스는 피부 위의 위치 복 부 측 아래로 더 낮은 사지에 밖으로 기지개 하는 동안.
<ol><li>양측 위 지 허벅지에서 근육 조직을 구분 하 여 전체 좌 골 신경 해 부 고 신경 척추를 따라 따라. 잘라 신경 척추에서 및 즉시 다른 끝에서 무릎 위에 어디 종료 됩니다. 참고: 분쇄 또는 당기는 집게와 같은 신경의 과도 한 처리를 하지 마십시오.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 삭제 nerve(s), 신경, 얼음 처럼 차가운 PBS와 얼음가 게의 1 mL를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 약 2 cm 전송. 참고: 신경 얼음에 하룻밤 저장할 수 있습니다. 참고: DRG 절 개, 포 셉, 메스를 사용 하 여에 대 한 분리는 기본 부드러운 조직에서 피부 노출 자 궁 경부, 흉부, 요 추 척추 지역 나머지 다시 피부를 벗 겨 부드럽게 합니다. 무딘가 위의 쌍을 사용 하 여 두개골의 기지에서 절단 하 여 머리를 제거 합니다.</li>
	<li>척추의 앞쪽 측면에 연결 된 내장을 분리 하기 전에 갈비뼈를 병렬와 척추 양쪽에 가까이 잘라. 화관을 잘라 고는 화관의 수준에서 컷 통과 의해 척추 열을 제거 합니다. 아이리스가 위를 사용 하 여 모든 근육, 지방, 그리고 척추에서 다른 부드러운 조직 떨어져 잘라.</li>
	<li>등 쪽 면이 위로 향하도록 척추 열을 배치 하 고, 3 시 위치와 잘라 뼈에서 척추 운하로가 위의 1 개의 끝을 슬라이딩 하 여 꼬리 끝에서 시작. 9 시 위치에서 절차를 반복 합니다. 참고:는 DRG의 손상을 방지 하려면 센터에 정확 하 게 잘라 중요 하다.</li>
	<li>Rostral 끝에 도달 하 고 척수가 완전히 노출 될 때까지 사이드-투-사이드에서 절단을 반복 합니다. 해 부 현미경을 사용 하 여, 척추 신경, 척추 내 Drg를 찾는 데 사용 될 수 있는 노출 척수를 제거 합니다.</li>
	<li>부드럽게 잡아 당 겼 지 루트 다음 클리핑 신경 및 결합 조직 아이리스가 위는 Drg를 제거 하는 척추 운하에는 DRG를에 의해 허리 Drg를 제거 합니다. 참고: 가능 하다 L4-L6 DRG 컬렉션을 제한 하는 좌 골 신경에 기여 하고있다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 약 1 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 1.5 mL 튜브에는 Drg를 전송 하 고 얼음에 저장 합니다. 참고: 신경 얼음에 하룻밤 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. 좌 골 신경 및 DRG의 소화
<ol><li>100 µ g/mL deoxyribonuclease, 그리고 얼음에 저장소의 보충 소화 미디어 (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1.6 mg/mL 콜라 유형 4)를 준비 합니다. 참고: 마우스 (좌 골 신경 + Drg) 당 필요한 소화 매체의 금액은 1 mL. 일단 준비, 소화 미디어의 aliquots-20 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>좌 골 신경 및 Drg 한 마우스에서 소화 미디어의 500 µ L을 포함 하는 별도 1.5 mL 튜브에 전송. 좌 골 신경에 대 한 소재 봄이 위를 사용 하 여 15 ~ 20 조각으로 절단 하 고 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 함께 20 분 동안 37 ° C에서 떨고 인큐베이터에서 조직 정지를 품 어.</li>
	<li>반복적으로 triturate 1000 µ L 피 펫 팁 어떤 불완전 소화 조직을 기계적으로 해리를 통해 세포 현 탁 액. 참고: 현 탁 액 적정 하기 어려운 경우 다음 잘라 피 펫 팁 만들 무뚝뚝한 끝을가 위로. 조직의 정지 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 20 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>1000 µ L 피 펫 팁을 통해 분쇄를 반복 하 고 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 함께 37 ° C에 추가 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>FACS 버퍼 PBS (보충 10 %FCS 및 1 mM EDTA)를 준비 하 고 얼음에 저장. 린스 하 고 60 x 15 mm 페 트리 접시에 얼음에에서 FACS 버퍼 140 µ m의 메쉬 크기 스테인리스 스틸 화면을 담근 다. 참고: nucleated 세포의 수율에 중대 한 손실을 리드 나일론 스크린 필터를 피해 야 한다.</li>
	<li>반복적으로 통과 조직 정지 140 µ m 스크린 필터로 그것은 얼음에 무딘 집게와 페 트리 접시에 개최 됩니다. 페 트리 접시에서 세포 현 탁 액을 수집 하 고 얼음에 저장 된 새로운 1.5 mL 튜브에 그것을 전송.</li>
	<li>1000 µ L 피 펫 팁 반복된 분쇄 하 여 통해 필터에 남아 있는 어떤 불완전 소화 조직을 밀어. FACS 버퍼의 500 µ L로 두 번 스크린 필터를 헹 구 고 단계 3.6에서에서 세포 현 탁 액 결합을 페 트리 접시에 결과 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 참고: 사용 하는 교류 cytometer 파편에 민감한 경우에, 단계의 3.7 세포 현 탁 액 수 통과 70 µ m 스크린 필터; 그러나,이 nucleated 세포의 수확량에 손실이 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 셀 정지 원심 삭제는 상쾌한 고 FACS 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 한 번이 세 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>150-350 µ L의 FACS 버퍼, 얼룩의 수에 따라 필요한 (150 µ L FACS 버퍼 얼룩 패널 당)는에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
</ol>4. Cytometry에 대 한 좌 골 신경 및 붙일 레이블된 항 체와 DRG의 얼룩
<ol><li>얼음에 V 96 잘 접시에 모양으로 좌 골 신경 또는 DRG 세포 현 탁 액의 100 µ L를 전송. 참고: 단일 스테인드 셀은 그들은 광 전 증폭 관 관 (PMT) 전압 이득 및 보상, cytometry 구별에서 특정 도움말 설정 하기 위한 필요한 컨트롤을 제공 합니다 사용 하는 모든 항 체에 필요한 일반적인 바인딩입니다. 좌 골 신경 및 Drg에서 사용할 수 있는 제한 된 자료로 인해 혈액 백혈구 및 PCL (1.1-1.2 단계)에서 대 식 세포는 얼룩이 지는 단일 스테인드 컨트롤으로 사용할 수 있습니다 하는 좌 골의 얼룩과 병렬로 수행 해야에 대 한 신경 및 Drg 있습니다.</li>
	<li>수영장 나머지 정지 (약 50 µ L 샘플 당) 좌 골 신경 또는 흠 없는 컨트롤 역할을 DRG 샘플에서 세포.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심 위에 빈 접시를 반전 하는 손목의 날카로운 영화를 적용 하 여는 상쾌한을 삭제 하 고 부드럽게 건조 종이 타월에 누릅니다.</li>
	<li>표면 얼룩에 대 한 관심 (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5, MHC 클래스 II-Biotin)의 항 체를 포함 하는 FACS 버퍼의 20 µ L에서 각 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 품 어, 30 분 동안 얼음에 빛 으로부터 보호. 참고: (1) 최적 항 체 희석 결정된 전에 제조 업체의 제품 정보; 희석 시리즈를 수행 하 여 사용 해야 합니다. (2) 일반적인 stainings; 제조업체의 지침에 따라이 단계에서 Fc-블록 외피에 의해 감소 될 수 있다 그리고 (3) Isotype 제어 stainings는 일반적으로 필요 하지 않습니다는 fluorophore와 또는 관심의 antigen(s) 고유 인구 생산에 직접 활용 된 1 차 항 체를 사용 하는 경우.</li>
	<li>각 우물에 FACS 버퍼의 130 µ L을 추가 하 고 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 이전 (4.3 단계)에 설명한 FACS 버퍼의 150 µ L로 두 번 셀 펠 릿을 세척으로 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 결합형된 기본 항 체 또는 비타민 b 복합체에 활용 된 1 차적인 항 체를 사용 하는 경우는 적절 한 보조 시 약, fluorophore에 활용 된이 시점에서 추가 될 수 있다 그리고 단계 4.4-4.5 반복 됩니다. 이 프로토콜의 경우 streptavidin-PE/Cy7 또는 Streptavidin PerCP MHC 종류 II 또는 CD68 APC와 함께 F4/80-PE/Cy7, CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5와 함께에서 각각 검출 하기 위하여 사용 되었다.</li>
	<li>마지막 세척 단계 후 고정을 위한 PBS (pH 7.4)에 4 %paraformaldehyde 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 10 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어와 다음 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 앞에서 설명한 (4.3 단계)으로 상쾌한을 삭제 하 고 FACS 버퍼의 150 µ L 한번 셀 펠 릿을 세척. 주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호 장갑과 안경, 등등을 착용 하십시오. 참고: FACS 버퍼와 최대 2 일 동안 4 ° C에서 빛 으로부터 보호 저장소의 150 µ L에서 셀 펠 릿을 Resuspend. 세포내 얼룩이 지 하는 것이 필요한 경우 다음 단계로 진행 4.11 centrifuging 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 플레이트 후</li>
	<li>세포내 얼룩, FACS buffer+0.5% 세제, 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 15 분 분리기 400 x g에서 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 빛에서 보호 하는 실 온에서 품 어 앞에서 설명한 (4.3 단계)으로 상쾌한 삭제 하 고 150 µ L FACS 버퍼 + 0.5% 세제로 한 번 셀 펠 릿을 세척. FACS buffer+0.5% 세제 (CD68-APC, CD206 PE)의 항 체를 포함 하는 20 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 품 어, 30 분 동안 실내 온도에 빛 으로부터 보호.</li>
	<li>각 우물에 FACS buffer+0.5% 세제의 130 µ L을 추가 하 고 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 이전 (4.3 단계)에 설명한 FACS 버퍼 + 0.5% 세제의 150 µ L로 두 번 셀 펠 릿을 세척으로 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 결합형된 기본 항 체 또는 비타민 b 복합체에 활용 된 1 차적인 항 체를 사용 하 여 다음에 fluorophore를 활용 한 적절 한 보조 시 추가할 수 있습니다이 시점에서 그리고 단계 4.9-4.10 반복.</li>
	<li>최대 2 일 동안 4 ° C에서 빛 으로부터 보호 FACS 버퍼 + 0.5% 세제와 저장소, 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>Resuspend 셀 알 약 150 µ L FACS 버퍼 + 0.5% 세제 5 µ g/mL DAPI 보충 하 고 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 5 분 동안 품 어. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심 앞에서 설명한 상쾌한 (4.3 단계)를 삭제 합니다.</li>
	<li>PBS 및 레이블이 표시 된 FACs 튜브에 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 분석에 대 한 준비까지, 빛에서 보호 하는 실내 온도에 상점. 참고: PBS에 물의 resuspension, 후 셀 분석 되어야 합니다 시간, 이후는 DAPI 신호에서 손실에 지도 하는 DNA에서 해리 천천히 것입니다.</li>
</ol>5. 설치 Cytometry 및 샘플의 실행의
<ol><li>교류 cytometer는 적절 한 레이저를 갖추고 또는 필터 fluorophores 셀 얼룩에 사용을 측정 하기 위해 설정 확인 하십시오. 이 시스템에 기본 cytometer 구성에서 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 셀 흐름 cytometer 3 레이저 장비를 사용 하 여 분석 했다 (405 nm, 488 nm와 633 nm) 5 fluorophores ≤의 검출에 대 한 허용.</li>
	<li>관심의 fluorophores의 검출에 대 한 적절 한 채널을 선택 합니다. 모든 형광 신호 로그 증폭 검색 잘 됩니다.</li>
	<li>샘플에 대 한 적절 한 유량을 선택 합니다. 이 매개 변수 사용 하는 시스템에 따라 다를 수 있습니다 그리고 실험적으로 결정 되어야 한다. 이 프로토콜의 경우 클럽 메 드-하-안녕 (35-60 µ L/min)의 흐름 속도 바늘의 막힘을 방지 하기 위해 사용 되었다.</li>
	<li>샘플 당 수집 될 이벤트/셀의 총 수를 선택 합니다. 최소 이벤트 수 1000000 이어야 한다입니다.</li>
	<li>점도의 SSC-대 전역 워크시트에서 만들 뿐 각 fluorophore FCS-. 대 관심의에 대 한 FSC-A 이벤트 및 선택한 fluorophores에 의미 한 형광 강도 (MFI)의 수를 표시 하는 통계 보기를 만듭니다.</li>
	<li>작은 셀 맞는 점도의 더 낮은 왼쪽된 10%에는 FSC와 SSC-A 채널의 전압을 설정 합니다. 결정 배경 형광 및 좌 골 신경 또는 Drg. 결정 부모 (P1) 게이트는 분산형 기반에서 흠 없는 컨트롤에서 최소 샘플 형광 DAPI 전용에서 플롯 컨트롤 얼룩. 참고:이 아니다 컬렉션 게이트 인해 부분적으로, 인구의 DAPI + PNS에서 이기종 자연.</li>
	<li>관심의 fluorophores의 각 플롯 FSC 분산형을 사용 하 여, 그들의 각각 점도 낮은 분기 속하는 흠 없는 컨트롤의 셀 전압을 조정 합니다. 빌 게이츠 다음 각각 마커/fluorophores의 각각에 대 한 긍정적인 그 셀을 정의 하기 위해이 지역 위에 만들어집니다. 게이트의 위치는 단일 스테인드 컨트롤 (단계 4.1)의 실행에 의해 확인 된다. 참고: 중복 방출 스펙트럼에 대 한 보상이 시점에서 수행 하거나 적절 한 분석 소프트웨어를 사용 하 여 소급 적용 될 수 있습니다.</li>
	<li>교류 cytometer 설정 되었습니다, 설명 된 대로, 일단 샘플을 실행할 수 있습니다.</li>
	<li>실행 후 나머지 샘플 자료를 삭제 될 수 있습니다 하 고 FCS 파일 추가 분석을 위해 내보낼 수 있습니다.</li>
</ol>

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저자는이 연구에 관한 관심의 없습니다 충돌 있다.

좌 골 신경 축 삭 주위 myelin의 콘텐츠로 인해 콜레스테롤 같은 지질의 큰 비율을 포함합니다. 온도와 지질의 속성 변경, 다른 온도에 다른 결과 얻을 수 있습니다. 셀 보존 되도록 소화 후이 프로토콜의 모든 단계는 얼음에 수행 했다. 일관성 결과의 재현성을 위해서 권장 하는 동안 그것은 3.6, 3.7 실 온에서 단계를 수행 하 여 수율을 높일 수 수 있습니다. 3.8 단계에서 신경 충분히 소화 하지 해야 ?...

면역 세포는 순환에서 PNS를 입력 CD45 그리고 CD11b의 식에 의해 정의 된 대로 재생 및 변성1에서 두 역할을 신경의 무결성을 유지 도움이. 대 식 세포 (그들의 표현의 CD68 마우스에 의해 정의 된) 더 MHC를 표현 하는 염증 성 표현 형을 향해 왜곡 수 있습니다 클래스 II 및 CD86 (M1), 그들의 표면에 또는 항 염증 제 표현 형으로 표현 더 많은 세포내 CD206 (M2)2 . 대 식 세포 표현 형의 기울이기 Akt 신호3, 반사 체 (M1)에 대 한 방어에 대 식 세포 및 조직 재생 (M2)에서 역할의 다양 한 작업을 통해 규제 하는 역동적인 과정 이다. 손상 된 신경의 재생 먼저 신경4,5, 및 항 염증 세포 myelin 파편 식 균 작용 해야 (CD68+CD206+) M2 세포 축 삭 파생물에 홍보 보였다는 PNS6. PNS, 채용 또는 대 식 세포 감소 또는 먹어서 장애인된 능력 장애인된 재생 및 신경 무결성의 유지 관리 될 수 있습니다. 염증 성 m 1 대 식 세포, MHC 종류 II, 표현 M2 세포 보다 덜 먹어서 수 있으며 신경 염증은 여러 가지 신경 퇴행 성 질병7의 병 인에 연루.
신경 거주 면역 체계 손상 때문에 발생 하는 변화는 양적, CD45의 손실에 명시 수 있습니다+ 백혈구 (CD45의 침투를 증가 또는+ 경우 염증에 백혈구), 또는과 같은 질적 m 1 형 m 2에서 대 식 세포 표현 형의를 변경 합니다. PNS의 면역 세포는 전통적으로 냉동된 섹션 또는 파라핀 끼워 넣어진 소재8를 사용 하 여 IF를 사용 하 여 분석 되었습니다. 만약 관심의 세포의 지역화를 결정 하는 데 필요한. 그러나, 부 량 사용 하는 경우 종종 불안정 하 고 취약 선택 바이어스에 정량화를 만드는 조직의 좁은 부분에 셀의 상대적으로 작은 수를 계산에 의존 합니다. 면역 세포의 특정 하위 집합의 식별을 위해 세포 외 또는 세포내 표식의 동시 검출이 필요, 대 식 세포 표현 형의 결정은 적어도 두 개 이상 표시, 특히 CD206와 MHC를 필요 합니다 하는 동안 클래스 Ii입니다. 가장 일반적으로 사용 가능한 현미경 fluorescein isothiocyanate (FITC) 등 phycoerythrin (PE), 적어도 2 색상 채널에 제한 됩니다 경우 면역 세포의 특정 하위 집합의 특성 수 제한 하 고, 불완전 한 요구 얼룩이 고 병렬로 분석 필요 여러 슬라이드는 동일한 지역에서 파생. 이 시간이 많이 걸리는 측면은 따라서 하지 않습니다 필요한 큰 샘플 세트의 분석에 빌려. 또한, 관심의 표시의 대부분은 세포 외, 중 파라핀 또는 cryoconserved에 포함 되어, 조직에서 검출 수 막 무결성의 파괴와 epitopes, 마스킹의 손실 때문에 문제 아세톤과 메탄올9같은 용 매를 사용 하 여 관심의 항 원.
대조적으로, cytometry, 광학 측정 흐름 고 형광 특성에에서 단일 셀의 빛의 광선을 통과 제공 합니다 셀 인구의 분석을 위해 더 실용적이 고 포괄적인 의미. 셀의 상대적인 크기와 앞으로 분산형 (FSC), 복잡 한 단위/내부로 반사 인덱스를 포함 하는 매개 변수 설정된의 자동화 된 정량화를 제공 하는 조직의 디지털 이미지를 생산 하는 것 보다는 cytometry, 또는 측면 살포 (SSC), 그리고 상대 형광 강도 제공 하는 셀 활용 된 항 체와 같은 적절 한 fluorophore와 분류 되었습니다. 전형적인 교류 cytometer 이루어져 있다 2, 공 냉 식된 레이저; 488에서 푸른 빛을 생산 하는 아르곤 레이저 및 헬륨-네온 레이저 생산 633에 빛 nm. 이 조합은 최소 5 목표 표면에 또는 세포내 구획 내에서 동시에, 탐지 및 측정, 대 한 수 있습니다. 고급 흐름 cytometers 허용 한 번에 최대 8 개의 다른 형광의 탐지를 위해 선택 된 형광의 피크 방출 파장 크게 중복 되지 않도록 제공 하는 여러 레이저 구성할 수 있습니다.
Cytometry 분석, 대 한 관심의 조직 해야 합니다 먼저 수 효소 소화, 일반적으로 단일 세포 현 탁 액을 생성 하기 위해 콜라와 함께. 분석 murine 좌 골 신경의 이전 조직의 각 마우스에서 얻은 작은 금액으로 인해 어려운 되었습니다. 또한, 축 삭 주위 myelin의 고 지방 내용 셀 복구를 저해 하며 많은 양의 파편을 생성 합니다. 좌 골 신경 준비 및 소화에 대 한 여기에 설명 된 메서드 외. 여 자용 머리 핀 Schwann 세포 격리 프로토콜에서 적응 시켰다 7, 그리고 쥐 간의 편차를 줄이기 위해 충분 한 흐름 cytometry 분석에 대 한 개별 쥐의 신경 세포를 분리 하는 것을 목표로. DAPI를 사용 하 여 원시 조직 다이제스트에서 단일 세포의 식별에 대 한 축 삭 파편, 일반적으로 셀 손실에 이르게 제거할 필요가 circumvents. 셀의 출시에 세제-풍부한 버퍼 에이즈로 여러 번 세척 수확량 증가 지방 파편 안에서 갇혀. 이 프로토콜에 따라 단일 마우스에서 두 길이 좌 골 신경의 소화 ≥30, 000 단일 nucleated 이벤트를 생성 하 고 3 배 이상 그 숫자는 DRG에서 검색. CD45 비율+ 백혈구는 총 셀 내용 좌 골 신경 다이제스트 및 약의 약 5% DRG 다이제스트에서 5-10%. 대부분은 CD45의+ 좌 골 신경에 있는 세포 대 식 세포 마커, CD68 및 CD206을 표현.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mouse</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>C57BL/6NCrl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>31885023</td>
			<td>The source of this material is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp., US</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td>Clone M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against MHC class II, biotinylated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107603</td>
			<td>Clone M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD45-A647</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107603</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD68-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137007</td>
			<td>Clone FA/11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD206-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141706</td>
			<td>Clone C068C2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against F4/80-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123113</td>
			<td>Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405206</td>
			<td>Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-PerCP</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405213</td>
			<td>Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Dilute in PBS to a 50x and store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation sieve - tissue grinder kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped, 96-well plates</td>
			<td>Greiner/Sigma</td>
			<td>M8185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15mm petri dish</td>
			<td>Greiner/Sigma</td>
			<td>Z643084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of immune cells in single sciatic nerves and dorsal root ganglion from a single mouse using flow cytometry

말 초 신 경계 (PNS) 신경 상주 면역 세포는 건강 한 신경에 신경 원 완전성을 유지 하기 위해 필수적입니다. PNS의 면역 세포는 상해 및 질병, 신경 기능 재생 능력에 영향을 미치는 영향을. 신경 면역 세포 면역 형광 검사 (면)에 의해 일반적으로 분석 된다. 경우 경우 신경에 면역 세포의 위치를 결정 하기 위한 에센셜만 반 정량적 이며 방법은 동시에 분석할 수 있는 마커 수와 표면 식의도로 제한 하는 동안. 이 연구에서 cytometry 좌 골 신경이 나 개별 쥐의 지 루트 절 (Drg)에 백혈구 침투의 정량 분석을 위해 사용 되었다. 단일 세포 분석 DAPI를 사용 하 여 수행 하 고 여러 가지 단백질 동시에 표면 또는 세포내 식에 대 한 분석 했다. 이 프로토콜에 따라 치료 한 마우스에서 두 좌 골 신경 ≥ 30000 단일 nucleated 이벤트 생성. 좌 골 신경, CD45의 식에 의해 결정에 백혈구의 비율이 전체 셀 내용 좌 골 신경에서의 5%와 대략 5-10%는 DRG에 약 했다. 하지만이 프로토콜 PNS 내 면역 세포 인구에 주로 초점을 맞추고, cytometry 마커 수를 동시에 측정 하의 유연성 즉 신경, Schwann 세포, pericytes 등 내의 다른 세포 인구 섬유 아 세포와 내 피 세포, 또한 분석 될 수 있다이 방법을 사용 하 여. 따라서이 메서드는 PNS, neurotoxicology 등 신경 병 또는 당뇨병 같은 만성 질환에서 유전자 모델에 조직의 효과 공부에 대 한 새로운 의미를 제공 합니다.

전체 길이 좌 골 신경 및 모든 주요 DRG에서 셀 정지 했다 6 건강 한 C57BL/6 마우스에서 프로토콜에 따라 준비 하 고 얼룩에 대 한 3 개의 동등한 aliquots로 분할. DAPI, DNA, 얼룩과 얼룩 카운터 단일 셀 인구 (그림 1A-B, 상단 패널)의 검출에 대 한 수 있습니다. DAPI cytometry, 분석 이전에 밖으로 세척 단일 nucleated 이벤트 또는 singlets의 FS...

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Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

정량 분석 murine 좌 골 신경 내에서 셀 내용의 조직의 부족으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜 조직 소화와 개별 쥐의 신경에서 면역 세포 인구의 흐름 cytometry 분석에 대 한 충분 한 세포를 제공 하는 준비 하는 방법을 설명 합니다.

단일 좌 골 신경 및 Cytometry 사용 하 여 단일 마우스에서 지 루트 신경 절에 면역 세포의 분석

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

analysis-immune-cells-single-sciatic-nerves-dorsal-root-ganglion-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K 조회수.  University Hospital of Heidelberg. 정량 분석 murine 좌 골 신경 내에서 셀 내용의 조직의 부족으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜 조직 소화와 개별 쥐의 신경에서 면역 세포 인구의 흐름 cytometry 분석에 대 한 충분 한 세포를 제공 하는 준비 하는 방법을 설명 합니다.

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Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

분리 LacZ를 표현 유동세포계측법를 사용하여 마우스 내이 (内耳) 조직의 세포를

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

연구

신경과학

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

먹이 찾아 돌아다 행동에 대한 단일 비행 분석에<em&gt; 초파리</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

마우스 좌골 신경에 생체 전기 생리 측정에서

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

등쪽 뿌리 신경절 모델 : 암성 신경 침략의 생체 외 모델링에서

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomy 허리 지 루트 신경 절의 액세스 및 돼지에 주입

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...