이 연구의 부분을 친절 하 게 도이치 가운데 (SFB 1027, A6)에서 교부 금에 의해 지원 했다.

참고: 일반 실험 작업 과정에 대 한 개요는 그림 1에 묘사 된다.
주의: RTA 인 간에 대 한 매우 독성이 있다. 안전 연구소 권한 S2 (biosafety 수준 2에 해당)이 필요 합니다. 전체 실험 동안 장갑을 착용 합니다.
1. 분리 표현의 대장균 에서 RTA의 태그
<ol>
	<li>대장균 세포 식 플라스 미드 pET24-RTA(그의) 6 또는 표준 electroporation 프로토콜9,10를 사용 하 여 빈 벡터 pET24a(+) 로 변환 합니다. 셀 빈 플라스 미드를 포함 하는 부정적인 컨트롤 역할을 합니다.</li>
	<li>대 포함 (µ g/100ml) 파운드 플레이트에 긍정적인 클론의 선택, RTA 식 플라스 미드 또는 5 mL 파운드칸 매체 (파운드 매체 대의 100 µ g/mL와 함께)에 빈 벡터를 포함 하는 세포를 접종 하 고 37 ° C와 24 h에 대 한 220 rpm에서 품 어.</li>
	<li>5 mL 사전 문화 1 L 파운드칸 매체를 보충 하 고 셀에는 0.8-1.0 (대략 3-4 h)의 OD600 에 도달 했습니다 때까지 37 ° C 그리고 220 rpm에서 세포를 품 어. 그 후, 문화 온도 28 ° C를 줄이고 1 M H2o. 이소프로필-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 재고 솔루션의 준비</li>
	<li>1 m m의 최종 농도에 IPTG을 추가 하 여 대장균 의 RTA 식 유도.</li>
	<li>3.5 h 28 ° C 그리고 220 rpm 10000 x g와 10 분, 4 ° C에서 원심 분리 하 여 수확 셀 후 씻어 두 번 바인딩 버퍼 (500 mM NaCl, 10mm 이미, 및 20 m m KH2포4 의 5 mL와 펠 릿 pH = 7.4) 10000 x g와 10 분, 및 5 mL 바인딩 버퍼 펠 릿 resuspend 4 ° C에서. 참고: 프로토콜이이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다 고 셀 몇 일 동안 80 ° C에 저장 될 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 정화 친화성 크로마토그래피를 통해 그의 태그 RTA의
<ol>
	<li>얼음 다음 프로토콜을 사용 하 여 셀 sonicate: 15 s 펄스 (20 미크론), 30 s 일시 중지. 5 번이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>세포 lysate 21000 x g와 15 분 동안 4 ° C에서 원심 고 상쾌한 멸 균 주사기 필터 시스템 (0.2 µ m 기 공 크기)를 사용 하 여 필터링 합니다. 참고: 성공적으로 sonicated 샘플의 펠 릿 셀 투명 한 테두리를 표시합니다.</li>
	<li>Ni2 +5 mL를 갖춘 자동된 정화 시스템을 사용 하 여-는 살 균 필터링 대장균 표면에 뜨는에서 그의 태그 RTA 분수 정화 선호도 열을 기반으로. 일반적으로, 1 mL/min의 속도 차입 사용 하 고 효율적인 비 독 소 바인딩 및 독 소 활동의 손실을 방지 하기 위해 전체 정화 시스템을 냉각. 참고: 효율적인 RTA 정화에 대 한 매개 변수는 표 1에 나열 됩니다. 베 커 외를 참조 하십시오. 대 한 자세한 내용은9.<ol>
		<li>간단히, 바인딩 버퍼 저장소 버퍼 제거의 20 mL와 선호도 열 equilibrate. 주사기를 사용 하 여 선호도 열에 상쾌한 살 균 필터링을 적용 합니다.</li>
		<li>열 바인딩 버퍼 열에서 언바운드 단백질 제거 하의 25-35 mL 씻으십시오. 세척 단계를 수행 하는 280에서 UV 흡 광도까지 nm 초기 UV 값은.</li>
		<li>20-35 ml 차입 버퍼의 바운드 RTA 분수 elute (이미 500 m m, 500 m m NaCl, 20mm KH2포4, pH = 7.2) 얼음 (그림 2A , 그림 2B)에 샘플을 계속 하 고. 참고: RTA 분수의 차입 증가 UV 흡수에 의해 표시 된다. 일반적인 바인딩 단백질 오염을 방지 하기 위해이 분수를 독점적으로 수집을 note 하십시오.</li>
		<li>Eluted 샘플 20 µ L를 사용 하 여 수행 Coomassie 파란 얼룩이11 또는 서쪽 오 점 분석12,13 (선택 사항). 사용 하 여 기본 반 그의 항 체 (1:1, 000) 보조 안티-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) RTA를 감지 하 여 샘플 순도 (그림 3)를 확인 합니다.</li>
		<li>5 mL 염 열에 eluted RTA 분수 desalt 고 0.8 M 톨에 샘플을 equilibrate.<ol>
			<li>염 열에 의해 정화 시스템의 선호도 열을 장착 하 고 처음 0.8 M sorbitol의 20 mL와 함께 열을 equilibrate.</li>
			<li>주사기를 통해 열에 eluted RTA 분수를 적용 합니다. 0.8 M sorbitol의 100 mL와 열 세척 하 고 즉시 UV 흡수 증가 (그림 2C)를 시작으로 15 mL 튜브에 desalted RTA 분수 elute.</li>
			<li>4 ° c.에 eluted RTA 분수를 저장 참고: 직접 전도도 증가 소금 오염을 피하기 위하여 때 RTA 분수 샘플링을 중지 합니다. 염 절차에 대 한 매개 변수는 표 1에 나열 됩니다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10000 x g와 4 ° C 10 kDa 컷오프 스핀 열 1-2 mL의 최종 볼륨을 사용 하 여 30-180 분 eluted RTA 분수를 집중 하 고 3-4 주 4 ° C에서 샘플을 저장할. 주의: RTA 활동의 완전 한 손실에 대 한 단서를 동결 이후 샘플을 동결 하지 않습니다.</li>
	<li>단백질 농도 기존의 단백질 결정 키트를 사용 하 여 결정 합니다. 단백질 농도 1-1.5 mg/mL의 범위에 있어야 합니다. 참고: RTA 단백질 농도가 너무 높은 경우를 침전 하는 경향이 있다 (&#62; 5 mg/mL).</li>
</ol>
3. 효 모 세포 벽 제거 및 변환
<ol>
	<li>야생-타입 또는 선택 된 효 모 삭제 돌연변이는 GFP 기자 플라스 미드 pRS315-K28SP-GFP6 표준 리튬 아세테이트 변환 방법14를 사용 하 여 변환. 셀 신 드롭 아웃 (d/o)를 품 어 긍정적인 클론 선택에 대 한 2-3 일 동안 30 ° C에서 포도 당 플레이트 (2% 포도 당, 한 천 1.5%, 0.5% 염화 황산 염, 0.17% 효 모 질소 기지 (YNB), 및 0.087 %d / o 혼합 신 없이).</li>
	<li>각 접시에서 3 다른 효 모 클론을 선택 하 고 220 rpm 및 30 ° C OD600 ~ 신 d/o 유 매체 (2% 유, 황산 암모늄 0.5%, 0.17 %YNB, 0.087 %d / o 신 없이 혼합) 100 mL에 클론을 접종 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 셀/mL)입니다. 참고: 다른 효 모 삭제 긴장의 세포 성장이 다르다. 모니터 세600 는 분 광 광도 계를 통해입니다.</li>
	<li>OD600 값을 계산 하려면 OD600 샘플 희석 0.1-0.3 = (1:5 1:10 희석) OD600 는 분 광 광도 계에서 측정. 참고로, H2O 신 d/o raffionose 매체의 해당 금액으로 보완을 사용 합니다.</li></ol>마지막으로, resuspend OD600 = 살 균 물 (5 x 108 셀/mL) 5 mL에 125.
	<li>10000 x g에 5 분 동안 25 ° C에서 세포를 원심, 세척, 살 균 물 5 mL로 두 번 셀 및 셀 50 mL spheroplasting 버퍼에 resuspend (0.8 M sorbitol, 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 10 m m CaCl2, 2 m m dithiothreitol (DTT), 그리고 200 µ g/mL 용균성 효소).</li>
	<li>50 mL 문화 100 rpm 및 90 분 선택 사항에 대 한 30 ° C를 품 어: 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 spheroplast 형성 15 분 마다 모니터링. 현미경, 어두운 반투명 회색 셀에 있어야 합니다. 브라이트 (refractile) 세포는 충분히 소화 하지, 반면 귀신 (창백한 회색, 있으면, 내부 구조와 셀) 소화 이상.</li>
	<li>각 샘플에 대 한 spheroplast 준비 효능을 확인 하십시오.
	<ol>
		<li>마무리 단계 3.5, 496 µ L spheroplasting 버퍼 (약 2 × 106 spheroplasts) spheroplasted 50ml 문화 4 µ L를 혼합 하 고 400 x g에서 10 분 원심 후.</li>
		<li>Resuspend 펠 릿 10 mL H2O에서에서 증 류, 소용돌이 샘플 30 s, 및 10 µ L 신 d/o 포도 접시 (2% 포도 당, 한 천 1.5%, 0.5% 염화 황산, 0.17 %YNB, 및 신 없이 0.087 %d / o 혼합)에 샘플의 밖으로 접시.</li>
		<li>30 ° c.에 3 일에 대 한 셀을 품 어 접시에 성장된 셀 식민지의 총 수를 계산 합니다. 데이터 평가 사용 하 여 샘플만 효율 98% 이상 (총 셀 식민지 수 &#60; 40 식민지/접시).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>원심 분리기 안정화 단계 400 g x 5 mL로 두 번 10 분 및 세척 셀 4 ° C에서 3.5에서에서 셀 신 d/o 유 미디어 (0.8 M sorbitol, 2% 유, 황산 암모늄 0.5%, 0.17 %YNB과 신 없이 0.087% 탈락 믹스). 5 mL 안정된 신 d/o 유 매체 (1 x 108 셀/mL)에 셀 resuspend 고 직접 GFP 기자 분석 결과 측정 (제 4)에 대 한 셀을 사용 합니다.</li>

4. GFP 96 잘 접시에 기자 시험 측정
<ol>
	<li>효 모 세포 spheroplasts 96 잘 접시 (200 µ L/잘)로 3.7 단계에서 얻은 개 씨.</li>
	<li>70 µ L 안정된 신 d/o 유 매체 부정적인 컨트롤 포함을 추가 (eluate의 Ni2 +-선호도 순화 된 세포 lysate 빈 벡터 표현 IPTG 유발 대장균 세포에서) 또는 5 µ M (최종 RTA 농도에 RTA를 정화 RTA 160 g/l에 해당)에 각 잘.</li>
	<li>30 µ L 안정 갈 락 토스 솔루션 (30% 갈 락 토스, 0.8 M sorbitol) GFP 식 유도 이후에 측정을 시작 하는 즉시 추가 합니다. 참고: 실험 당 적어도 3 기술 복제를 수행 하 고 효 모 스트레인 당 3 생물 복제 합니다.</li>
	<li>마무리 샘플 준비 (단계 4.1 4.3), 후 형광 판독기에 96 잘 접시를 넣어 하 고 측정을 시작 합니다. GFP 형광 검출에 필요한 설정 475/509 nm 필터를 사용 합니다. 30 ° C, 120 rpm에서 20 h (10 분 간격으로 측정)의 시간 창에 1mm의 동요 직경 측정을 수행 합니다. 참고: GFP 필터 집합은 일반적으로 모든 리더 시스템에서 사용할 수 있는. 온도, 시간 창, 간격, 및 RTA 농도 측정 자신의 필요를 위해 조정할 수 있습니다. 대표 결과 그림 4에 나와 있습니다.</li>
	<li>선택 사항: 측정에 추가 내부 컨트롤을 사용 하 여 품질 관리에 대 한. 30% 갈 락 토스 (GFP 유도 없음) 대신 30 µ L 안정된 신 d/o 유 매체를 추가 하 여 부정적인 제어를 준비 합니다. 또한, 0.8 M sorbitol 안정 G418 솔루션 (300 µ g/mL)의 70 µ L를 추가 합니다. 그것은 효 모에 GFP 식 방지 단백질 번역 억제제 G418 단백질 억제에 대 한 긍정적인 제어로 제공 합니다.</li>
	<li>다음 방정식에 따르면 h는 20 시간 포인트에 대 한 % 상대 GFP 형광 계산 ( 그림 4A참조): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56588/56588eq1.jpg"> 어디 NC는 부정적인 컨트롤
	<ol>
		<li>각 측정 지점에 대 한 상대적인 GFP 형광 또는 결정 (이 경우 10 분에서 참고 단계 4.4) 위의 수식을 사용 하 여. 그림 4B같이 시간 (x 축)에 GFP 형광 강렬 (y 축)를 blotting으로 그래프를 만듭니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum.">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li><li>Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. 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저자는 공개 없다.

위의 프로토콜을 수행할 때 실험의 성공적인 결과 달성 하기 위해 다음 제안 사항을 권장 합니다.
분리 단백질 식, 1 mM의 IPTG 농도 초과 하지 중요 하다. IPTG 농도 &#62; 1mm 억제 발기인 유도 RTA 표현과 독 수익률 낮은 리드. 또한, 셀 수 없습니다 재배 포함 체 형성, 비효율적인 폴딩, 및 독 소 비활성화를 방지 하기 위해 28 ° C 보다 높은 온도에서. RTA 식 (예를 들어, 20-28 ° C)...

독 소를 생산 하는 박테리아에 의해 감염에서 고통 받는 환자 효율적인 치료 치료는 여전히 크게 실종 이후 특히 각 사회 의료 시스템에 대 한 심각한 의료 및 금융 부담을 나타냅니다. 새로운 치료 전략, 의학 관련 A의 복잡 한 중독 메커니즘 개발 / B 독 소 콜레라 독 소, 시가 독 소, 또는 리 등 완벽 하 게 구현할 수 있는 새로운 강력한 분석 실험에 따라 분자 수준에서 이해 될 필요가.
최근 몇 년 동안 여러 연구 A를 분석 하려고 / 효 모 및 방사성 독 소 같은 시간이 소요 되 고 비용 집약적인 메서드를 사용 하 여 포유류 세포에서 B 독 소 운송 라벨 siRNA 기반 심사로1,2 3을접근 한다. 경우에 따라 독 소 매매 시각 있다 vivo에서 형광 현미경 검사 법에 의해 fluorophores, 양자 점, 또는 형광 단백질4,5소 단위 개별 독 소의 화학 그리고/또한 유전 결합 후. 불행히도, 이러한 수정 종종 비활성 또는 변경 된 독 소의 자연 속성으로 이어질. 다양 한 과학적인 질문에 직접 답변을 또 다른 우아한 방법은 이다 lacZ, luciferase 등 형광 단백질 효소에 따라 기자 시스템의 사용 (예: GFP 또는 Discosoma sp. 빨간 형광 성 단백질 ( dsRed))입니다.
이 원고는 S. cerevisiae에 extracellularly 적용된 RTA의 세포내 수송에 필요한 세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 프로토콜 설명 합니다. 따라서, GFP 뒤 응급실 가져오기 N 맨끝 신호를 포함 하는 형광 기자 플라스 미드 GFP 형광 방출 후에 vivo에서 RTA 중재 단백질 번역 억제를 직접적으로 측정 하는 단백질 생 합성 센서 역 번역6. 경우는 RTA endocytosis 및 세포내 매매 부정적인 (또는 긍정적인) 영향을 야생-타입에 비해 특정 효 모 삭제 돌연변이에이 GFP 형광 방출6증가 (또는 감소)를 통해 감지할 수 있습니다.
지금까지, 모든 방법을 분석 하는 효 모 세포에서 RTA 전송 RTA의 응급실 cytosol 복고풍 전 프로세스에 제한 되었습니다. 이러한 인공 시스템에서 RTA는 응급실 가져오기 신호를 포함 하는 자살 형1,7에 결과 유도할 수 있는 발기인에서 표현 된다. 셀 리의 B 소 단위 바인딩 마찬가지로이 원고에 설명 된 실험 설정에서 누락 된 고, 따라서, 완전히 나타내지 않는 신은 holotoxin 중독8의 자연 상황, 독 소 전송 플라즈마에서 응급실에 Golgi 기구 통해 막이 소설 분석 결과와 밀접 하 게 유사 될 수 있습니다. 흥미롭게도, 파일럿 연구에서 얻은 예비 결과 RTA에서 사용 하는 밀매 경로 신은 holotoxin의 중독 경로와 눈에 띄는 유사성을 공개를 나타냅니다.
요약, 설명된 방법 RTA endocytosis에 선택한 세포 단백질 및 효 모에 인신 매매의 특정 역할을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한,이 실험적인 체제 생산과 다양 한 효 모와 세균 종 zymocin 또는 시가 독 소를 분 비 하는 독 소를 비활성화 다른 리보솜에 쉽게 적응 될 수도 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial and yeast strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 DE3(Gold)</td><td>Aligent Technologies</td><td>230130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; BY4742</td><td>Euroscarf</td><td>Y10000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; BY4742 deletion mutants</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1054</td><td>whole collection</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids used in this protocol&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24a&lt;sup&gt;(+) &lt;/sup&gt;(Novagen)</td><td>Millipore</td><td>69772-3</td><td></td></tr><tr><td>pET-RTA&lt;sub&gt;(His6)&lt;/sub&gt;</td><td>Becker &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (2016)&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td>USBio</td><td>Z1000.250</td><td>lytic enzyme for cell wall removal</td></tr><tr><td>LB broth medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>10855021</td><td>15 g agar was added for plate production</td></tr><tr><td>YNB</td><td>Thermo Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Yeast drop-out mix supplemts without leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1376-20G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>D-raffinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750-10MG</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Thermo Scientific</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>3899.1</td><td></td></tr><tr><td>PAGE ruler prestained</td><td>Fermentas</td><td>26616</td><td>protein ladder used for Western analysis</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Material for RTA purification, desalting and reader measurements&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro</td><td>Amersham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>old model, other models available</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210470</td><td>old model, not available anymore</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTAPurifier</td><td>Thermo Scientific</td><td>28406266</td><td>Product is discontinued and replaced</td></tr><tr><td>HisTRAP HP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>HiTRAP desalting column</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0003-29</td><td></td></tr><tr><td>Midisart sterile filter</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>0.2 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>660 nm assay kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies (optional)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tetra-His</td><td>Qiagen</td><td>34670</td><td>primary antibody; 1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Anti-mouse-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9044-2ML</td><td>secondary antibody, 1:10,000 dilution</td></tr></tbody></table>

a simple fluorescence-based reporter assay to identify cellular components required for ricin toxin a chain (rta) trafficking in yeast

박테리아 및 식물 A B 독 소는 cytosol에서 그들의 세포내 별로 도달 하 고 궁극적으로 죽 진 핵 세포에서 자연 밀매 경로 악용 /. 이러한 A / B 독 소는 효소 활성의 Asubunit (예를 들어, 신은 독 소 (RTA)) 및 하나 이상의 셀 바인딩 Bsubunit(s) 독 소에 특정 바인딩 세포 표면 수용 체에 대 한 책임은 일반적으로 구성. 어떻게 우리의 현재 지식 A / B 독 소 효율적으로 endocytosis 및 세포내 단백질 높은 진 핵 세포에서 정렬 같은 기본적인 세포질 기계 장치를 이해 하기 도움이 셀 과학자를 취하게 할 수 있다. 의료의 관점에서 그것은 마찬가지로 환자에 대 한 적절 한 치료 솔루션을 찾을 수 또는 결국 암 치료에 대 한 치료 독 소-기반 응용 프로그램 개발에 주요 독 소 밀매 경로 식별 하는 것이 중요.
A의 게놈 넓은 분석 이후 / B 독 소 포유류 세포에서 인신 매매는, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비싼, A에 여러 연구 / B 독 소 전송 효 모 모델 유기 체 Saccharomyces cerevisiae에서 수행 되었습니다. 효 모와 더 높은 진 핵 세포에서 덜 복잡 하 고, 기본적인 세포질 과정 임에도 불구 하 고 비슷한과 효 모에 얻은 결과 매우 자주 포유류 상황에 전송할 수 있습니다.
여기, 우리 누 룩에서 RTA의 세포내 매매 분석을 신속 하 고 사용 하기 쉬운 기자 분석 결과 설명 합니다. 새로운 분석 결과의 필수적인 이점을 cytosol에 뿐만 아니라 RTA 복고풍-전 바인딩과 그물 (응급실)에서 조사를 기회 이지만 오히려 endocytosis 퇴행 성 독 소 수송 원형질 막에서 응급실에. 분석 결과 vivo에서 번역 후 녹색 형광 단백질 (GFP)의 형광 방출 통해 RTA 독성의 간접 측정을 허용 하는 기자 플라스 미드의 사용. RTA 28S rRNA depurination에 의해 효율적으로 단백질 생 합성의 개시를 방지, 이후이 분석 결과에서 수 있습니다 호스트 세포 단백질의 식별을 변경의 검색을 통해 세포내 RTA 전송에 관련 된 형광 방출.

이 원고에 설명 된 프로토콜의 일반적인 워크플로 그림 1, 대략 성공적인 RTA 정화 및 후속 GFP 기자 분석 결과 실험에 대 한 단일 단계 요약에 나와 있습니다. 각 개별 단계에 대 한 더 자세한 설명은 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. 그림 2 는 친화성 크로마토그래피 (그림 2A)와 빈 벡터 제어 (<strong class="xfig"...

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A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (RTA) 효 모에 인신 매매

원고, 우리는 밀매에 관여 하 고 식물 독 소 리 (RTA)의 소 단위는 세포 독성의 프로세스를 죽이고 세포 구성 요소를 식별 하는 효 모 기반 형광 기자 분석 결과 사용 하 여를 설명 합니다.

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

a-simple-fluorescence-based-reporter-assay-to-identify-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

7.9K 조회수.  Saarland University. 원고, 우리는 밀매에 관여 하 고 식물 독 소 리 (RTA)의 소 단위는 세포 독성의 프로세스를 죽이고 세포 구성 요소를 식별 하는 효 모 기반 형광 기자 분석 결과 사용 하 여를 설명 합니다.

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

라이브 고정화 효모 세포의 시각화에 대한 신속한 기술

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

연구

생물학

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is particularly relevant for survival in fluctuating environments such as those found in beer fermentation. However, sugar transitions are an environmental variable that is challenging to predict and detect, impacting the outcome of beer fermentations. This protocol describes an in vivo system to monitor transcriptional activation associated with the glucose-to-maltose metabolic shift in Saccharomyces eubayanus that applies to different wild Saccharomyces yeast strains. 
The system employs an episomal bioluminescent transcriptional reporter for maltose metabolism, focusing on MAL32, since it provides a good readout for metabolic shifts, as studied in S. cerevisiae. For this, yeast strains were transformed with plasmids containing the MAL32 regulatory region from S. eubayanus, controlling the expression of a gene encoding for a destabilized version of firefly luciferase1, and a hygromycin resistance gene used exclusively during transformation to ensure plasmid acquisition. Following selection, transformed yeast cells can be cultured under non-selective conditions, as the episomal plasmid remains stable in culture conditions for up to 7 days. 
This system was validated under a complex sugar environment in microfermentation assays, confirming the effectiveness of the luciferase reporter in informing metabolic transitions. Samples were collected regularly and analyzed with a luminometer, providing continuous insights into yeast responses. While broadly applicable, this protocol is particularly valuable for assessing yeast performance under fermentation conditions, where metabolic changes pose a significant challenge. Additionally, this methodology can be adapted by selecting alternative promoters to explore a broader range of responses to environmental changes, allowing characterization as well as optimization of wild yeast strains for diverse industrial applications.

This protocol employs a bioluminescent reporter, allowing measurements of transcriptional activity in Saccharomyces eubayanus to monitor the glucose-to-maltose transition, enabling real-time analysis of metabolic adaptations and supporting strain optimization for industrial fermentation under diverse conditions.

생체 내 Monitoring of transcriptional activity during metabolic transition using a bioluminescent reporter in yeast(효모의 생물발광 리포터를 사용한 대사 전이 중 전사 활동 모니터링)

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

유전학

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

면역학 및 감염병학

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (RTA) 효 모에 인신 매매

요약

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