우리는지지하고 열정적 인 연구 환경을 제공하기 위해 루벤스 타인 실험실의 현재와 전 회원을 감사드립니다. 우리는 프로토콜 최적화에 도움 라이언 T. 깁슨 감사합니다. 우리는 효모 균주 및 플라스미드에 대한 마크 Hochstrasser (예일 대학)과 디터 늑대 (Universität의 슈투트가르트) 감사합니다. 우리는이 원고의 선명도와 유틸리티 개선에 도움을 준 익명의 검토를 부탁드립니다. 이 작품은 SGW에 시그마 사이의 볼 주립 대학의 장에서 연구 수상에 의해 지원되었다, 볼 주립 대학에서 국민 건강 보조금 연구소 (R15 GM111713) EMR에, EMR에 볼 주립 대학 바램이 연구 상, 자금 사무장의 사무실과 생물학과.

단백질 분해에 결함이있는 후보 돌연변이를 확인하기 위해 1. 효모의 성장 분석 <ol><li> 리포터 대사 효소로, 프레임에서 불안정한 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드와 야생형과 돌연변이 효모 세포를 형질. </li><li> 플라스미드 분자를 보유하는 세포 합성을위한 선택적인 정의 (SD) 최소 배지 5ml에 형질 전환 체를 접종한다. 회전, 30 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 각 하룻밤 문화의 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도를 측정한다. 참고 : 하룻밤 배양 한 다음은, 문화의 세포 중 하나 로그 또는 고정 성장 단계에있을 수 있지만 최소한의 OD에게 0.2 (600)에 도달한다. 경험적으로 결정되는 매우 느리게 성장하는 효모 균주는 세포의 더 많은 수의 배양 시간보다 긴 밤, 또는 접종이 필요할 수 있습니다. </li><li> 세포에 희석을 시작으로 멸균 96 웰 플레이트에서 형질 전환 된 효모 세포의 6 배 희석액을 준비N OD 0.2 600. 96 웰 플레이트에 다른 행에 분석 할 각 효모 형질 전환 체를 놓습니다. <ol><li> 각 형질 전환 체의 경우, 200 μL의 최종 부피는 0.2 OD (600)에 셀을 희석 할 필요 밤새 배양의 체적을 계산한다. 200 μL에 볼륨을 가지고 멸균의 적절한 금액을 추가 열 1에 잘 대응에 하룻밤 문화의이 볼륨을 추가합니다. </li><li> 효모의 각 행에 대해, 열 2, 3 및 4에 웰 멸균 수 125 μL를 추가한다. 참고 : 개별 포장 멸균 96 웰 플레이트 멸균 뚜껑 포장 할 수있다. 뚜껑은이 단계에 분포 멸균 용 탱크로서 사용될 수있다. 이 멀티 채널 피펫으로 주어진 열의 모든 우물에 멸균을 동시에 전송할 수 있습니다. </li><li> 피펫 팅에 의해 멀티 채널 피펫과 아래 첫 번째 열 (OD 0.2 (600)로 희석 효모)의 내용을 섞는다. </li><li> TRANSF멀티 채널 피펫을 사용하여 열 2 열 1에서 효모의 25 μL, 어. 로 pipetting 아래로 섞는다. 전송 열 3 열이 25 μL, 그리고 3 열부터 4 열 25 μL (각 단계에서 잘 혼합). </li></ol></li><li> 멀티 채널 피펫으로 각 샘플을 섞는다. 가장 묽은에서 진행하는 것은 적어도 적절한 선택 배지를 포함하는 두 접시에 효모, 피펫 각 샘플의 4 μl를 열 희석한다. 플라스미드 선택 (이 판은 효모 안보 및 성장 제어 역할을) 유지 매체와 한 판을 사용합니다. 기자 효소에 융합 불안정한 단백질의 플라스미드 유지 보수 및 표현 선택 매체와 제 2 플레이트를 사용합니다. 효모가 빠르게 정착 때문에, 정기적으로 피펫 팅에 의해 아래로 세포를 혼합한다. 참고 : 건조기 판은 더 쉽게 새로 제조 한 판보다 액체 흡수하기 때문에 이러한 실험을 권장합니다. 댐프 플레이트 LO 실온에서 인큐베이션하여 건조 될 수있다층류 후드에 2 일 또는 짧은 배양 - 1 w 습도. 층류 공기 유동은 벤치에 평행 인 경우, 플레이트 불균일하게 건조 할 수있다. 템플릿을 사용하면 쉽게 일반 거리에서 효모 세포를 발견 할 수 있습니다. 두 샘플 템플릿은 그림 1에 나와 있습니다.이, 인쇄 잘라하고, 페트리 접시 뚜껑의 안쪽에 부착되어 있습니다. </li><li> 플레이트가 벤치 위에 건조하도록 허용합니다. </li><li> 2-6일 30 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 배양 후 각 판의 사진. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> 100 mm 한천 플레이트에 효모 세포에 얼룩을지게 그림 1. 템플릿. 이러한 템플릿은 멀티 채널 피펫과 정기적으로 거리에서 효모를 파악하고 용이하게 사용할 수있다. 템플릿은, 인쇄 잘라 및 페트리 접시 뚜껑의 안쪽에 부착 될 수있다. 성장 페트리 접시를 배치템플릿 매체 내부 뚜껑에 부착. 템플릿은 방향을 추적하기 위해 한 단계로 표시됩니다. 그것은 성장 분석에 사용되는 판 마찬가지로 방향을 추적하기 위해 한 단계로 표시하는 것이 좋습니다. 네 (A) 또는 오 (B) 효모 세포의 연속 희석이 제공됩니다 안보를위한 템플릿. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">100-mm 템플릿이 그림의 인쇄 가능한 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 효모의 성장 분석 2. 생화학 확인 <ol><li> 효모 세포 및 사후 알칼리성 단백질 추출의 성장 (31 수정) <ol><li> 불안정한 단백질을 코딩하는 플라스미드와 야생형과 돌연변이 효모 세포를 형질. </li><li> 플라스미드 분자를 보유하는 세포 선택성 SD 배지 5ml에 접종 형질. 회전, 30 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 각 하룻밤 CU의 OD 600을 측정lture. 참고 : 하룻밤 배양 한 다음, 셀 중 로그 또는 고정 성장 단계에있을 수 있지만, 0.2 ml의 10에 신선한 선택 배지 (단계 2.1.4)의 OD 600 희석을 허용하는 OD (600)에 도달한다. 경험적으로 결정되는 매우 느리게 성장하는 효모 균주는 세포의 더 많은 수의 배양 시간보다 긴 밤, 또는 접종이 필요할 수 있습니다. </li><li> 0.2 ml의 10에 신선한 선택 배지의 OD 600 효모 세포를 희석. </li><li> 문화가 (중간 로그 성장에 IE) 0.8과 1.2 사이의 OD 600에 도달 할 때까지, 회전 또는 떨고, 30 ° C에서 세포를 배양하기 위해 계속합니다. 참고 : 관심의 불안정한 단백질이 조절 가능한 프로모터의 통제하에있는 경우, 단백질 발현 및 세포 수확의 유도의 최적의 타이밍은 이전의 연구 또는 경험적 관찰에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 15 ml의 원뿔 곡선 (이차 곡선)에 문화의 2.5 OD 600 단위를 수집실온에서 5 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리하여 알루미늄 관. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. 주 : 600 부 1.0의 OD 600에서 배양액 1mL 효모 본의 양으로 정의된다 한 OD. V = 2.5 OD 600 단위 / 600 OD 측정 : 2.5 OD 600 단위 (V)을 수확하는 데 필요한 (ML)에서의 배양 부피는 다음 식을 사용하여 결정될 수있다 </li><li> 한 용액에 재현 탁 된 세포를 증류수. 마이크로 원심 튜브에 정지 세포를 전송합니다. </li><li> 실온에서 30 초 동안 6500 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. </li><li> 100 μL에 재현 탁 세포가 다운되거나 와동 피펫 팅에 의해 증류수, 100 ㎕의 0.2 M NaOH를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다. 실온에서 5 분간 샘플을 부화. </li><li> 18,000 X에서 원심 분리하여 (아직 단백질을 발표 여전히 가능한 아르하지 않은 대부분의) 펠렛 세포5 분 g. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. </li><li> 로 pipetting 아래로 또는 와동에 의해, 세포를 용해됩니다 100 μL 1X 램 믈리 샘플 버퍼, - 50에 재현 탁 펠렛. 주 : 원심 램 믈리 시료 완충액 세포의 후속 재 부유 다음 알칼리 상등액 제거는 글리신 러닝 버퍼 시스템과 웨스턴 블롯을 사용하여 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)와 호환 pH에서 단백질을 추출한다. </li><li> 완전 단백질 변성, 5 분 동안 95 ° C에서 배양 한 해물. 참고 : 95 ° C에서 배양 할 때 집계가 발생하기 쉬운 단백질 (여러 횡단 세그먼트 예를 들면 단백질) 불용성 될 수 있습니다. 따라서 해물 낮은 온도에서 배양한다 (예를 들면 37 ° C - 70 ° C) 10 - 30 분, 같은 단백질의 경험적 분석, 결정 하였다. </li><li> 5 분 동안 얼음 상에 배치하여 냉각 용 해물. </li><li> 실온에서 1 분 18,000 XG에 원심 분리기 해물을 불용성 물질을 펠렛. 이전 이후의 웨스턴 블롯 분석 (2.2 절)을​​ SDS-PAGE에 의해 상층 액 (용해 추출 된 단백질)를 분리합니다. 또한, -20 ° C에서 저장 용 해물. </li></ol></li><li> 대표 웨스턴 블로 팅 프로토콜 <ol><li> SDS-PAGE 젤에 해물의 경험적으로 결정 볼륨을로드합니다. </li><li> 염료 앞까지 200 V에서 젤을 실행 겔의 바닥에 도달했습니다. </li><li> 4 ℃에서 90 분 - 60 20 V 젖은 송금 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인 겔에서 단백질을 전송합니다. </li><li> 4 ℃에서 하룻밤 동안 실온에서 1 시간 동안, 흔들거나, TBS 버퍼 (TBS)에서 5 % 탈지 우유에서 배양함으로써 차단 막. </li><li> 차단 솔루션 가만히 따르다. </li><li> 방 테에서 1 시간 동안 0.1 % 트윈 20 (TBS / T)와 TBS에서 1 % 탈지 우유 (또는 에피토프 태그) 가장 큰 관심의 단백질에 특이적인 항체와 멤브레인을 품어mperature, 락. </li><li> 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다. </li><li> 락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지유 적절한 형광 공역 이차 항체와 함께 막을 인큐베이션. 참고 : 형광 물질이 빛에 민감한 때문에, 형광 접합 된 항체의 희석이 어둠 속에서 준비를해야합니다. 또한, 형광 - 복합 항체의 존재 막 부화는 차광 용기에 발생한다. 이 알루미늄 포일 인큐베이션 트레이를 배치함으로써 달성 될 수있다. </li><li> 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다. </li><li> 제조업체의 권장 사항에 따라, 리튬 고전 오디세이 (CLx)에서는을 사용하여 막과 이미지 스튜디오 소프트웨어 (또는 비교 영상 장비 및 소프트웨어)의 이미지를 획득. </li><li> 멤브레인을 묘화 한 후, 부하에 특이 차 항체와 함께 막을 인큐베이션락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지 우유 단백질을 제어 보내고. </li><li> 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다. </li><li> 락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지유 적절한 형광 공역 이차 항체와 함께 막을 인큐베이션. </li><li> 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다. </li><li> 제조업체의 권장 사항에 따라, 리튬 고전 오디세이 (CLx)에서는을 사용하여 막과 이미지 스튜디오 소프트웨어 (또는 비교 영상 장비 및 소프트웨어)의 이미지를 획득. </li></ol></li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기에 제시된 방법론은 빠른 결정과 효모 세포에서 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항의 생화학 적 확인을 할 수 있습니다. 이 실험은 () (예 : 41 ~ 44을, 처리, 저장 및 효모 세포 조작을위한 프로토콜의 효모 생물학의 여러 우수 리뷰 및 컴파일 유기체에 새로운 연구자에 사용할 수있는) 유틸리티 및 전원 효모의 모델 진핵 생물 유기체 등을 강조 표시합니다. 기술은 용이하게 ?...

선택적 단백질 분해 진핵 생명에 필수적이며, 변화된 단백질 분해는 여러 종류의 암, 퇴행성 신경 질환, 심혈관 질환, 낭포 성 섬유증을 포함하는 의료 1-5 조건의 수에 기여한다. 선택적인 단백질 분해를 촉매하는 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)는, 이러한 조건에 대한 6-10 새로운 치료 표적이다. 유비퀴틴 리가 제는 공유 결합 단백질 11 (76) - 아미노산 유비퀴틴의 폴리머를 연결합니다. polyubiquitin 체인으로 표시 한 단백질은 인정 ~ 2.5 megadalton 26S에 의해 12 프로 테아 proteolyzed 있습니다. 모델 진핵 생물 사카로 미세스 세 레비 시아 (신진 효모)에 시작된 연구는 진핵 세포에서 단백질 분해 메커니즘의 해명에 기초가되고있다. UPS의 첫 번째 시연 생리 기판은 MATα2 13 효모 전사 억제 자했다, UPS의 (14), 및 고도로 보존 된 많은 구성 요소가 처음 확인 된 또는 (예 15-26) 효모 특징으로하는 방법. 이 다목적 유전자 다루기 쉬운 모델 생물에서 만든 발견은 유비퀴틴 중재 저하의 보존 메커니즘에 중요한 통찰력을 지속적으로 제공 할 가능성이 높다. 대부분의 UPS 기판의 인식과 저하는 여러 단백질의 공동 작업이 필요합니다. 따라서, 주어진 불안정한 단백질의 조절 된 분해를 특징 짓는 중요한 목적은 단백질 분해에 대한 유전 적 요건을 결정하는 것이다. 효모 또는 포유 동물 세포에서 단백질 분해를 모니터링하기위한 고전 접근법 (예를 들어 펄스 - 체이스 및 사이클로 헥시 - 체이스 실험 27) 힘들고 시간 소모적이다. 이러한 유형의 방법은 단백질 분해를 검출하는 고감도 방법을 제공하지만, 이들은 단백질 분해 또는 대규모 screeni의 신속한 분석에 적합하지 않다단백질 분해를 방지 ng를 돌연변이. 여기에, 불안정한 단백질의 분해에 대한 유전 적 요구 사항의 신속한 식별을위한 효모의 성장 기반 분석은 제공됩니다. 단백질 분해,이자 (또는 저하 신호)의 불안정한 단백질을 분석하는 효모의 성장 기반 방법에서는 특정 상황에서 효모의 성장에 필요한 단백질, 프레임, 융합된다. 결과는 관심 불안정한 단백질의 단백질 분해의 유전 적 요구 사항을 결정하는 강력한 도구로서 작용할 수 인공 기판이다. 편리하게는, 가장 일반적으로 사용되는 실험실 효모 균주 특정 아미노산 또는 질소 함유 염기 (예 20,28-30)의 생합성에 관여하는 대사 효소를 코딩하는 유전자의 돌연변이 패널 항구. 이 효소는 합성 효소에 참여 외생 제공 대사의 부재하에 세포 증식에​​ 필수적이다. 이러한불안정한 단백질의 분해를위한 성장 기반 기자가 이들이 융합로서 대사 효소에 따라서 기능을 할 수있다. 단백질 분해를 방지 돌연변이가 저하 기자를 숨겨 세포가 선택적 조건에서 성장할 수 있도록하기 때문에 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항을 용이하게 설명 될 수있다. 성장 장점은 특정 돌연변이 관심 단백질 풍부 증가 간접 지표이다. 그러나 직접 생화학 적 분석은 돌연변이가 아니라 간접적 또는 인공적인 원인을 통해보다 증가 된 단백질 수준을 통해 성장을 허용하는지 확인해야합니다. 풍부한 단백질에 돌연변이의 효과는 않으며 특정 돌연변이를 정박하지 않는 세포에서의 정상 상태의 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인 될 수있다. 적합한 형태 효모 단백질의 신속하고 효율적인 추출 (수산화 나트륨 및 샘플 완충액으로 효모 세포의 연속 배양) 미국 방법웨스턴 블롯 분석을 위해도 (31)를 제시한다. 함께, 이러한 실험은 단백질 분해의 후보 레귤레이터의 신속한 식별을 용이하게한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#39;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#39;s laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1H-1,2,4-triazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC264571000</td>
			<td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088726001</td>
			<td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-32</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>51028068</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-0450</td>
			<td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14403</td>
			<td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14401</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate imaging system (e.g. 
			Gel Doc XR+ System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8195</td>
			<td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364120</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Dri-Bath Heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1172011AQ</td>
			<td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>459250</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

규제 단백질 분해는 거의 모든 세포의 기능에 매우 중요합니다. 분자 메커니즘 및 진핵 세포 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항에 대해 알려진 대부분은 처음 사카로 미세스 세 레비 시아 년에 설립되었습니다. 단백질 분해의 고전 분석은 생화학 펄스 추적 및 사이클로 헥 - 추적 방법에 의존했다. 이들 기술은 단백질 분해에 대한 민감성을 관찰하는 수단을 제공하지만, 이들은 힘들고, 시간 소모, 및 낮은 처리량이다. 이러한 접근 방법은 단백질 분해를 방지 또는 돌연변이 신속한 대규모 스크리닝 의무가 없다. 여기에서, 단백질 분해에 대한 유전 적 요건 용이 한 식별을위한 효모의 성장 기반 분석법을 설명한다. 이 분석에서, 특정 조건 하에서 선택적 성장에 필요한 리포터 효소 불안정한 단백질에 융합된다. 내생 세포를 리포터 효소가 결여되지만 융합 단백질이 실리 하에서 성장할 수있는 발현융합 단백질 안정화 만 뽑은 상태 (즉, 단백질 분해가 노출되어있는 경우). 여기에 설명 된 성장 분석에서, 야생형 및 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 돌연변이 효모 세포의 연속 희석이 선택적 및 비 선택적 매체에 발견된다. 선택적 성장 조건 하에서 주어진 돌연변이 열화 손상과 일치한다. 증가 된 단백질 풍부 생화학 적으로 확인해야합니다. 전기 영동 및 웨스턴 블 랏팅을위한 적합한 형태로 효모 단백질의 신속한 추출 방법도 설명된다. 생화학 적 분석을위한 단백질 추출을위한 간단한 프로토콜과 결합 단백질 안정성 성장 기반 판독, 단백질 분해에 대한 유전 적 요건의 신속한 식별을 용이하게한다. 이러한 기술들은 단명 다양한 단백질의 열화를 모니터링하도록 구성 될 수있다. 제시된 예에서, 히스티딘 생합성에 필요한 효소는 HIS3, 융합시켰다이 비정상적으로 소포체의 translocon을 종사 한 후 Deg1에 -Sec62. Deg1 -Sec62은 분해의 대상이된다. Deg1 -Sec62-HIS3 은닉 세포 단백질을 안정화시킨 때 선택적 조건 하에서 성장할 수 있었다.

이 방법을 설명하기 위해, HIS3 효소가 모델 소포체 (ER) -associated 저하의 카르복시 말단에 융합 된 (ERAD) 기판, Deg1 -Sec62 (그림 2A) Deg1 -Sec62-HIS3를 만들 수 있습니다 (그림 3) . Deg1 -Sec62는 translocon와 지속, 비정상적인 관계를 다음 타겟으로 ERAD 기판의 새로운 클래스의 창립 멤버이고, ER 막 32-34에서 단백질을 이동 주로 담당하는 채널입니다. 이러한 ?...

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Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.6K 조회수.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

연구

생물학

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

에서 지방 질량의 생화학 및 높은 처리량 미세 평가<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

로 표현 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 규칙 단백질의 정제<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.