Parti di questo studio sono state gentilmente sostenuta da una sovvenzione del Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).

Nota: Una panoramica del flusso di lavoro sperimentale generale è raffigurata nella Figura 1.
Attenzione: RTA è altamente tossico per gli esseri umani. È necessaria l'autorizzazione del laboratorio di sicurezza S2 (livello di biosicurezza 2 equivalente). Si prega di indossare guanti durante l'intero esperimento.
1. eterologhi di sua etichetta RTA in Escherichia coli
<ol>
	<li>Trasformare le cellule di Escherichia coli con l'espressione del plasmide pET24-RTA(sua) 6 o il vettore vuoto pET24a(+) utilizzando protocolli standard elettroporazione9,10. Celle contenenti il plasmide vuoto servono come controllo negativo.</li>
	<li>Dopo la selezione dei cloni positivi sulle piastre di LB (100 µ g/mL) contenenti kanamicina, inoculare le cellule contenenti il plasmide di espressione di RTA o il vettore vuoto nel mezzo di 5ml LBkan (LB medium con 100 µ g/mL di kanamicina) e incubare a 37 ° C e 220 giri/min per 24 h.</li>
	<li>Supplemento 1 L LBkan medio con la pre-cultura 5ml e incubare le cellule a 37 ° C e 220 giri/min fino a quando le cellule hanno raggiunto un OD600 di 0.8-1.0 (circa 3-4 h). Da allora in poi, ridurre la temperatura di cultura a 28 ° C e preparare un 1m della soluzione di riserva (IPTG) isopropilico-β-D-1-thiogalactopyranoside in H2O.</li>
	<li>Inducono l'espressione di RTA di e. coli con l'aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM.</li>
	<li>Dopo 3,5 h a 28 ° C e 220 giri/min, raccolto cellule mediante centrifugazione a 10.000 x g e 4 ° C per 10 minuti, lavare la pallina due volte con 5 mL di tampone di associazione (500 mM NaCl, imidazolo di 10 mM e 20 mM KH2PO4 pH = 7,4) a 10.000 x g e a 4 ° C per 10 min e risospendere il pellet in 5 mL di tampone di associazione. Nota: Il protocollo può essere sospesa in questa fase e le cellule possono essere memorizzate a 80 ° C per diversi giorni.</li>
</ol>
2. la purificazione della sua etichetta RTA tramite cromatografia di affinità
<ol>
	<li>Sottoporre ad ultrasuoni cellule sul ghiaccio con il seguente protocollo: 15 s pulse (20 micron), 30 s pausa. Ripetere questo passaggio cinque volte.</li>
	<li>Centrifugare a 21.000 x g e a 4 ° C per 15 min lysate delle cellule e filtrare il surnatante utilizzando un sistema di filtri siringa sterile (dimensione dei pori di 0,2 µm). Nota: Il pellet cellulare dei campioni lisati con successo mediante mostrano bordi trasparenti.</li>
	<li>Utilizzare un sistema di purificazione automatizzata con 5ml Ni2 +-base colonna di affinità per purificare la frazione di His-Tag RTA dalla sterile filtrata e. coli surnatante. In generale, utilizzare una velocità di eluizione di 1 mL/min e raffreddare il sistema di purificazione di tutto per prevenire la perdita di attività di tossina e associazione tossina non efficiente. Nota: I parametri per purificazione efficiente RTA sono elencati nella tabella 1. Vedi anche Becker et al. Per ulteriori informazioni9.<ol>
		<li>Brevemente, equilibrare la colonna di affinità con 20 mL di buffer obbligatorio rimuovere il buffer di memoria. Applicare il surnatante filtrato sterile sulla colonna di affinità usando una siringa.</li>
		<li>Lavare la colonna con 25-35 mL di buffer di associazione per rimuovere le proteine non associate dalla colonna. Eseguire la fase di lavaggio fino a capacità di assorbimento UV a 280 nm è vicino al valore iniziale di UV.</li>
		<li>Eluire la frazione legata RTA in 20-35 mL di tampone di eluizione (imidazolo di 500 mM, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7.2) e tenere il campione sul ghiaccio (Figura 2A e 2B di figura). Nota: Eluizione della frazione RTA è contrassegnata da un aumento nell'assorbimento di UV. Si prega di notare per raccogliere esclusivamente questa frazione per evitare la contaminazione con proteine rilegate non specifici.</li>
		<li>Utilizzare 20 µ l di campioni eluiti per eseguire Blue di Coomassie macchiatura11 o Western blot analisi12,13 (facoltativo). Utilizzare primario anti-sua anticorpi (1:1, 000) e secondario anti-mouse-IgG-HRP (01:10, 000) per rilevare RTA e verificare la purezza del campione (Figura 3).</li>
		<li>Desalificare eluiti frazione RTA su una colonna di dissalazione 5ml ed equilibrare il campione in sorbitolo di 0,8 M.<ol>
			<li>Sostituire la colonna di affinità del sistema di purificazione dalla colonna dissalazione ed equilibrare in primo luogo la colonna con 20 mL di sorbitolo di 0,8 M.</li>
			<li>Applicare la frazione di RTA eluita alla colonna tramite una siringa. Lavare la colonna con 100 mL di sorbitolo 0,8 M ed eluire la frazione di RTA dissalata in una provetta da 15 mL, non appena l'assorbimento di UV inizia ad aumentare (Figura 2).</li>
			<li>Memorizzare la frazione eluita RTA a 4 ° C. Nota: Interrompere direttamente campionamento frazione RTA quando aumenta la conduttanza per evitare contaminazione salina. Parametri per la procedura di dissalazione sono elencati nella tabella 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eluite frazione RTA a 10.000 x g e a 4 ° C per 30-180 min utilizzando una colonna di spin 10 kDa cut-off ad un volume finale di 1-2 mL di concentrato e conservare il campione a 4 ° C per 3-4 settimane. Attenzione: Non congelare il campione dal congelamento conduce ad una perdita completa di attività di RTA.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di proteina mediante un kit di determinazione della proteina convenzionali. Concentrazione nella proteina dovrebbe essere nel range di 1-1.5 mg/mL. Nota: RTA tende a precipitare se la concentrazione nella proteina è troppo alta (&#62; 5 mg/mL).</li>
</ol>
3. trasformazione e rimozione della parete cellulare del lievito
<ol>
	<li>Trasformare mutanti di delezione di lievito wild-type o selezionato con la GFP reporter plasmide pRS315-K28SP- GFP6 utilizzando standard litio acetato trasformazione metodi14. Incubare le cellule su leucina abbandono (d/o) piastre di glucosio (glucosio 2%, 1,5% agar, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% lievito azoto Base (YNB) e 0,087% d/o mix senza leucina) a 30 ° C per 2-3 giorni per selezione clonale positivo.</li>
	<li>Scegli 3 cloni di lievito diverso da ogni piatto e inoculare i cloni in 100 mL di leucina d/o raffinosio medio (2% raffinosio, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% YNB e mescolare senza leucina 0,087% dallavalle) a 220 giri/min e 30 ° C a OD600 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 cellule/mL). Nota: La crescita delle cellule i diverso l'eliminazione di ceppi di lievito è diverso. Monitor OD600 tramite uno spettrofotometro.</li>
	<li>Per calcolare i valori di OD600 , diluire i campioni a OD600 = 0.1-0.3 (1:5 a 01:10 diluizioni) e misurare OD600 con uno spettrofotometro. Come riferimento, utilizzare H2O completato con la corrispondente quantità di leucina d/o raffionose mezzo di.</li></ol>Infine, risospendere OD600 = 125 in 5 mL di acqua sterile (5 x 108 cellule/mL).
	<li>Centrifugare le cellule a 25 ° C per 5 min a 10.000 x g, lavare le cellule due volte con 5 mL di acqua sterile e risospendere le cellule in 50 mL di tampone spheroplasting (sorbitolo 0,8 M, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM CaCl2, 2mm ditiotreitolo (DTT) e degli enzimi litici di 200 µ g/mL).</li>
	<li>Incubare la coltura di 50 mL a 100 giri/min e 30 ° C per 90 min. facoltativo: monitorare la formazione dello spheroplast ogni 15 min da microscopia di contrasto di fase. Al microscopio, le cellule dovrebbero avere un colore grigio scuro traslucido. Cellule di Bright (refractile) sono insufficientemente digerite, mentre fantasmi (cellule grigio pallido con poco, se del caso, struttura interna) sono sovra-digerito.</li>
	<li>Verificare l'efficacia di preparazione dello spheroplast per ciascun campione.
	<ol>
		<li>Dopo finitura passo 3.5, mescolare 4 µ l della cultura spheroplasted 50ml con 496 µ l di tampone di spheroplasting (circa 2 × 106 Sferoplasti) e centrifugare per 10 min a 400 x g.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 10 mL di H2O distillata, campione di vortice per 30 s e piastra fuori 10 µ l del campione su piastre di glucosio di d/o di leucina (2% di glucosio, agar 1,5%, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% YNB e 0,087% d/o mix senza leucina).</li>
		<li>Incubare le cellule per 3 giorni a 30 ° C. Contare il numero totale delle colonie delle cellule coltivate sulla piastra. Per la valutazione dei dati, utilizzare solo i campioni con efficienza supera al 98% (totale numero di Colonia di cellule &#60; 40 colonie/piastra).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centrifugare le cellule da passo 3.5 a 400 x g e a 4 ° C per 10 min e lavare le cellule due volte con 5 mL stabilizzato leucina d/o raffinosio medio (0,8 M sorbitolo, raffinosio 2%, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% YNB e 0,087% drop-out mix senza leucina). Risospendere le cellule in 5ml stabilizzato leucina d/o raffinosio medium (1 x 108 cellule/mL) e utilizzare direttamente le cellule per le misurazioni di dosaggio di reporter GFP (sezione 4).</li>

4. GFP Reporter Assay misura in piastre da 96 pozzetti
<ol>
	<li>Seme fuori gli sferoplasti di cellule di lievito ottenute al passaggio 3,7 in piastre da 96 pozzetti (200 µ l/pozzetto).</li>
	<li>Aggiungere 70 µ l leucina stabilizzato d/o raffinosio terreno contenente il controllo negativo (eluato di una Ni2 +-affinità purificato lysate delle cellule dalle cellule di IPTG-indotta e. coli che esprimono il vettore vuoto) o purificata RTA a una concentrazione finale di RTA di 5 µM ( corrispondenti a 160 g/L RTA) in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Immediatamente aggiungere 30 µ l stabilizzato galattosio soluzione (30% galattosio, sorbitolo 0,8 M) per indurre l'espressione di GFP e successivamente avviare la misurazione. Nota: Eseguire la tecniche almeno 3 ripetizioni per esperimento e 3 biologici replica al ceppo di lievito.</li>
	<li>Dopo aver completato la preparazione del campione (punti 4.1-4.3), mettere la piastra a 96 pozzetti in un lettore di fluorescenza e avvia la misurazione. Utilizzare il 475/509 nm set di filtri necessari per la rilevazione della fluorescenza di GFP. Eseguire misurazioni a 30 ° C, 120 giri/min e con un diametro d'agitazione di 1 mm sopra una finestra di tempo di 20 h (gli intervalli di 10 min di misurazione). Nota: Il set di filtri GFP è normalmente disponibile in tutti i sistemi di lettore. Temperatura, intervallo di tempo, misurare intervalli e RTA concentrazione può essere regolata per le proprie esigenze. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 4.</li>
	<li>Facoltativo: Utilizzare ulteriori controlli interni nella misura per il controllo qualità. Preparare un controllo negativo aggiungendo 30 µ l leucina stabilizzato d/o raffinosio medium invece 30% galattosio (nessuna induzione di GFP). Inoltre, aggiungere 70 µ l di soluzione di 0,8 M sorbitolo stabilizzato G418 (300 µ g/mL). L'inibitore di traduzione proteica G418 serve come controllo positivo per l'inibizione della proteina impedisce espressione di GFP in lievito.</li>
	<li>Calcolare in per cento per il punto di tempo di 20 h secondo la seguente equazione relativa fluorescenza GFP (Vedi Figura 4A): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56588/56588eq1.jpg"> dove NC è il controllo negativo
	<ol>
		<li>In alternativa, determinare la fluorescenza di GFP relativa per ciascun punto di misura (in questo caso 10 min, vedi anche punto 4.4) utilizzando l'equazione di cui sopra. Come mostrato in Figura 4B, è possibile creare un grafico di macchiare le intensità di fluorescenza di GFP (asse y) nel corso del tempo (asse x).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quando si esegue il protocollo di cui sopra, si consiglia i seguenti suggerimenti per ottenere un risultato di successo dell'esperimento.
Per l'espressione della proteina eterologa, è importante non superare la concentrazione di IPTG di 1 mM. Concentrazioni di IPTG &#62; 1 mM inibire indotta da promotore espressione di RTA e piombo per abbassare i rendimenti di tossina. Inoltre, le cellule non vanno coltivate a temperature superiori a 28 ° C per impedire la formazione del corpo di inclusione...

Pazienti affetti da infezioni da batteri che producono la tossina rappresentano un grave onere medico e finanziario per ogni sistema di assistenza sanitaria sociale, in particolare quanto efficaci trattamenti terapeutici sono ancora in gran parte mancante. Per sviluppare nuove strategie terapeutiche, i meccanismi complessi intossicazione della medicamente relativi A / tossine B come la tossina del colera, produttore della tossina Shiga o ricina ha bisogno di essere compresa a livello molecolare, basato sul romanzo saggi potente che devono essere implementati.
Negli ultimi anni, diversi studi ha tentato di analizzare A / trasporto di tossina B in lievito e cellule di mammifero usando metodi che richiede tempo e costosa come tossina radioattivo etichettatura1,2 , nonché a screening basato su siRNA si avvicina a3. In alcuni casi, traffico di tossina è stata visualizzata in vivo mediante microscopia a fluorescenza dopo accoppiamento chimico e/o genetico delle subunità di tossina individuali con fluorofori, punti quantici o proteine fluorescenti4,5. Purtroppo, tali modifiche spesso portano a inattivo e/o alterata proprietà naturali delle tossine. Un altro modo elegante per rispondere indirettamente a una vasta gamma di domande scientifiche è l'uso di sistemi reporter basato sugli enzimi come lacZ, luciferasi, o proteine fluorescenti (ad es. GFP o Discosoma sp. (proteina fluorescente rosso dsRed)).
In questo manoscritto, un semplice protocollo è descritto che identifica i componenti cellulari necessari per il trasporto intracellulare di RTA extracellularly applicata in S. cerevisiae. In tal modo, un plasmide di fluorescenza-reporter contenente un segnale N-terminale ER-importazione seguito da GFP agisce come un sensore di biosintesi della proteina, che misura indirettamente l'inibizione di traduzione di RTA-mediato della proteina GFP emissione di fluorescenza dopo in vivo traduzione6. Nel caso che endocitosi RTA e/o traffico intracellulare è influenzata negativamente (o positivamente) in un mutante di delezione di lievito particolare rispetto al wild type, questo può essere rilevato attraverso un aumento (o diminuzione) GFP fluorescenza emissione6.
Finora, tutti i metodi di analisi trasporto RTA in cellule di lievito sono stati limitati al processo retrò-traslocazione ER-a-citosol di RTA. In un sistema così artificiale, RTA contenente un segnale di importazione di ER è espresso da un promotore inducibile, risultante in un fenotipo suicida1,7. Anche se la cella associazione subunità B della ricina similarmente è manca nel setup sperimentale descritto in questo manoscritto e, quindi, non rappresenti perfettamente la situazione naturale di ricina holotoxin intossicazione8, tossina trasporti dal plasma membrana attraverso l'apparato del Golgi al pronto soccorso può essere imitata molto attentamente con questa analisi Novella. Interessante, i risultati preliminari ottenuti nello studio pilota indicano che le vie di traffico utilizzate da RTA rivelano sorprendenti analogie con l'itinerario di intossicazione di ricina holotoxin.
In sintesi, il metodo descritto può essere utilizzato per determinare il ruolo specifico di proteine cellulari selezionati nell'endocitosi RTA e traffico in lievito. Inoltre, questa messa a punto sperimentale potrebbe essere facilmente adattato a altri ribosoma inattivanti tossine prodotto e secreto da diverse specie batteriche come zymocin o tossina Shiga e lievito.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial and yeast strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 DE3(Gold)</td><td>Aligent Technologies</td><td>230130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; BY4742</td><td>Euroscarf</td><td>Y10000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; BY4742 deletion mutants</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1054</td><td>whole collection</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids used in this protocol&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24a&lt;sup&gt;(+) &lt;/sup&gt;(Novagen)</td><td>Millipore</td><td>69772-3</td><td></td></tr><tr><td>pET-RTA&lt;sub&gt;(His6)&lt;/sub&gt;</td><td>Becker &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (2016)&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td>USBio</td><td>Z1000.250</td><td>lytic enzyme for cell wall removal</td></tr><tr><td>LB broth medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>10855021</td><td>15 g agar was added for plate production</td></tr><tr><td>YNB</td><td>Thermo Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Yeast drop-out mix supplemts without leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1376-20G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>D-raffinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750-10MG</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Thermo Scientific</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>3899.1</td><td></td></tr><tr><td>PAGE ruler prestained</td><td>Fermentas</td><td>26616</td><td>protein ladder used for Western analysis</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Material for RTA purification, desalting and reader measurements&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro</td><td>Amersham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>old model, other models available</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210470</td><td>old model, not available anymore</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTAPurifier</td><td>Thermo Scientific</td><td>28406266</td><td>Product is discontinued and replaced</td></tr><tr><td>HisTRAP HP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>HiTRAP desalting column</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0003-29</td><td></td></tr><tr><td>Midisart sterile filter</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>0.2 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>660 nm assay kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies (optional)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tetra-His</td><td>Qiagen</td><td>34670</td><td>primary antibody; 1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Anti-mouse-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9044-2ML</td><td>secondary antibody, 1:10,000 dilution</td></tr></tbody></table>

a simple fluorescence-based reporter assay to identify cellular components required for ricin toxin a chain (rta) trafficking in yeast

Batterica e centrale un / tossine B sfruttano le naturali vie di traffico nelle cellule eucariotiche per raggiungere i loro target intracellulare nel citosol e infine uccidere. Un / tossine B consistono generalmente di un enzimaticamente attivo Asubunit (ad es., tossina ricina un (RTA)) e uno o più celle, associazione Bsubunit(s), che sono responsabili di tossina vincolante a specifici recettori di superficie di cella. La nostra attuale conoscenza di come A / B tossine sono in grado di efficientemente inebrianti cellule ha aiutate gli scienziati per comprendere i meccanismi cellulari fondamentali, come endocitosi e proteina intracellulare in cellule eucariotiche superiori. Da un punto di vista medico, allo stesso modo è importante identificare le rotte del narcotraffico tossina principali per trovare soluzioni adeguate di trattamento per i pazienti o per eventualmente sviluppare applicazioni basate su tossina terapeutiche per la terapia del cancro.
Dall'analisi del genoma della A / tossina B traffico in cellule di mammifero è complesso, lungo e costoso, parecchi studi sulla A / trasporto di tossina B sono stati effettuati nell'organismo modello lievito Saccharomyces cerevisiae. Pur essendo meno complessi, fondamentali processi cellulari in lievito e cellule eucariotiche superiori sono simile e molto spesso i risultati ottenuti in lievito possono essere trasferiti alla situazione dei mammiferi.
Qui, descriviamo un'analisi del reporter di veloce e facile da usare per analizzare il traffico intracellulare di RTA in lievito. Un vantaggio essenziale del nuovo test è la possibilità di indagare non solo RTA retrò-traslocazione dal reticolo endoplasmatico (ER) nel citosol, ma piuttosto di endocitosi e retrograda tossina trasporto dalla membrana plasmatica in ER. Il test si avvale di un plasmide del reporter che permette la misura indiretta della tossicità di RTA attraverso l'emissione di fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP) dopo la traduzione in vivo . Poiché RTA previene efficacemente l'inizio della biosintesi della proteina da depurinazione rRNA 28S, questo test consente l'identificazione delle proteine della cellula ospite coinvolti nel trasporto intracellulare di RTA attraverso la rilevazione dei cambiamenti nell'emissione di fluorescenza.

Il flusso di lavoro generale del protocollo descritto in questo manoscritto è illustrata nella Figura 1, approssimativamente che riassume i singoli passaggi per successo RTA purificazione e il successivo esperimento di analisi del reporter GFP. Una descrizione più dettagliata di ogni singolo passaggio può essere trovata nel protocollo. La figura 2 illustra il risultato previsto di una purificazione di RTA successo da cromatogr...

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A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

Un'analisi del Reporter di fluorescenza-basata semplice per identificare i componenti cellulari necessari per tossina ricina una catena (RTA) tratta di lievito

Nel manoscritto, descriviamo l'uso di un'analisi del reporter di fluorescenza basati su lievito per identificare componenti cellulari coinvolti nel traffico e uccidere i processi dei citotossici una subunità della ricina di tossina della pianta (RTA).

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

8.0K Views.  Saarland University. Nel manoscritto, descriviamo l'uso di un'analisi del reporter di fluorescenza basati su lievito per identificare componenti cellulari coinvolti nel traffico e uccidere i processi dei citotossici una subunità della ricina di tossina della pianta (RTA).

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Una tecnica rapida per la visualizzazione di Live cellule di lievito immobilizzato

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Ricerca

Biologia

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analisi di<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Immunologia e infezioni

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

Effetto di proteine fluorescenti su Fusion partner utilizzando saggi di tossicità di Polyglutamine in lievito

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Un'analisi del Reporter di fluorescenza-basata semplice per identificare i componenti cellulari necessari per tossina ricina una catena (RTA) tratta di lievito

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