Name: a neural network-based identification of developmentally competent or incompetent mouse fully-grown oocytes
Uploaded: 2018-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes at JoVE.com

이 작품 가능한 덕분에 의해 지원 되었다: 파 비아 대학 FRG 2016; 파 르 마 대학 FIL 2014, 2016; 그리고이 연구를 수행 하는 데 필요한 plasticware 공급에 대 한 자세. 닥터 쉐 인 윈저 (공학 부, 브리스톨 대학, 영국)는 Cell_PIV 소프트웨어를 제공 하는 감사 합니다.

동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 및 파 비아 대학에서 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 동물 22 ° C, 60% 공기 습도와 명암 주기 12:12 h의 조건 하에서 유지 되었다.
1. 난소 격리
<ol><li>Intraperitoneally 2 4-11 주 된 CD1 여성 쥐 10 U 여 포 호르몬을 자극 하는 살 균 1 mL 인슐린 주사기의 주사.</li>
	<li>46-48 h를 기다립니다.</li>
	<li>Zoletil (Tiletamina, Zolazepan cloridrate)의 50 mg/kg의 근육 주사와 anesthetize 및 마우스 무게. 자 궁 경부 전위에 의해 안락사.</li>
	<li>피부 절 개 집게의 쌍을 사용 하 여 복 벽을 덮고 파악. 피부를 잘라 하 고 한 쌍의가 위와 풀으로 체 벽 집게와 절 개를 엽니다.</li>
	<li>핀셋의 쌍을 사용 하 여, 배 짱, 자 궁 뿔을 정확 하 고 그들의 말단에 난소를 지역화 이동 합니다.</li>
	<li>부드럽게 시계 집게를 사용 하 여 난소를 누른 자 궁에 그것의 인 대를 잘라가 위를 사용 합니다. 다른 난소와 반복.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 공기에서에서 미리 예 열 하는 M2 절연 매체의 1 mL를 포함 하는 35 mm 셀 문화 페 트리 접시에 수집 된 난소를 전송 합니다.</li>
	<li>지방과 stereomicroscope에서 좋은 위를 사용 하 여 수 란 관을 제거 합니다.</li>
</ol>2입니다. 격리 적 운 Oocyte 단지의
<ol><li>찔린 antral 적 운 oocyte 단지 (COCs)는 수 동적으로 해제 될 때까지 멸 균 핀셋 및 1 G 메 마른 인슐린 바늘을 사용 하 여 난소 표면 합니다.</li>
	<li>적 운 세포는 입 제어 손을 뽑아 파스퇴르 micropipette (직경에서 200 µ m)를 사용 하 여 3 개 이상의 레이어 COCs를 수집 하 고 신선한 M2 매체의 300 µ L 방울으로 그들을 전송.</li>
	<li>부드럽게 몇 초 동안 밖으로 pipetting으로 oocytes 손으로 뽑아 파스퇴르 micropipette (직경에서 80 µ m)를 사용 하 여 주변 적 운 세포를 제거</li>
	<li>반복 해 서 전송 oocytes M2 매체의 20 µ L 드롭에서 또 하나, 적 운 세포는 완전히 제거 될 때까지.</li>
</ol>3. chromatin Oocyte 조직 기반 분류
<ol><li>5 mg/mL 1 x PBS에 희석의 어머니 솔루션에서 M2 중간 시작에 0.05 µ g/mL의 최종 농도에 Hoechst 33342 얼룩 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>3.5 µ L 마이크로 방울 Hoechst 얼룩 솔루션 35 mm 페 트리 접시의 뚜껑의 하단에 배치 합니다.</li>
	<li>각 단일 oocyte Hoechst 얼룩 드롭으로 전송 하 고 미리 따뜻하게 (37 ° C) 난방 접시에 접시를 놓고 조명 박람회를 피하기 위해 어두운 뚜껑으로 커버.</li>
	<li>보육 실 온에서 10 분, 후 더 이상 1-2 s는 oocytes UV 빛 (330-385 nm), 아래에서 10 배 확대에 형광 현미경으로 관찰 합니다.</li>
	<li>그들은 핵소체를 둘러싼 Hoechst 긍정적인 chromatin의 반지를 선물 하는 경우 oocytes 둘러싸여 핵소체 (SN) (그림 1A)로 분류 합니다.</li>
	<li>그들의 핵소체 Hoechst 긍정적인 chromatin 둘러싸이 지 고 쇼 분산 (그림 1B) 핵 내의 heterochromatic 명소 oocytes 하지 둘러싸여 핵소체 (NSN)으로 분류 합니다.</li>
</ol>4. 신경 네트워크 기반 Oocyte 분류
<ol><li>4 준비와 5% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 2 mM L-글루타민, 5mm 황소자리, 100 U/mL 페니실린, 75 µ g/mL 스 35 m m 유리로 23.5 µ µ g/L 나트륨 pyruvate 보충 하는 α-MEM 매체의 2 µ L 방울 페 트리 접시 바닥 및 함께 그들을 커버 미리 데워 진된 (37 ° C) 그리고 중간 증발을 피하기 위해 미리 equilibrated 미네랄 오일. 참고: 라이브 셀 검 진 시스템을 사용 하는 경우 유지를 특정 거리에서 지침으로 7 x 7 mm의 그려진된 격자를 사용 하 여.</li>
	<li>각 드롭 전송 3-4 oocytes입니다.</li>
	<li>시간 경과 기록 소프트웨어를 갖춘 라이브 셀-심사 시스템으로 유리 하단 페 트리 접시를 놓습니다 (참조 테이블의 자료), 안정적인 온도 (37 ° C)와 CO2 환경에서 oocyte 성숙의 관측을 허용 하 농도 (5%).</li>
	<li>시간 경과 기록 소프트웨어를 엽니다. 화면에서 창 왼쪽에 oocyte 라이브 샷 모든 설정 버튼 오른쪽에 나타납니다.</li>
	<li>화면의 중앙에 배치 하려면 oocyte의 중심을 선택 합니다. 필요 하다 면 초점을 조정 합니다.</li>
	<li>전화 버튼을 선택 하 고 192; 디 아 램프 를 설정합니다 노출 시간 을 1/125 s; 이득 1.99; 그리고 해상도 를 1600 x 1200.</li>
	<li>FL2 선택한 5; 디 아 램프 를 설정합니다 노출 시간 을 3 s; 이득 에 2.37; 그리고 해상도 를 1600 x 1200.</li>
	<li>문화 드롭 내 oocyte 위치를 기록 하기 위해 새 포인트 버튼을 선택 합니다. 문화 드롭 내 각 oocyte에 대해 동일한 루틴을 반복 합니다.</li>
	<li>시간 을 선택 하 고 8 분 및 15h 총 시간 에 수집 주기 를 설정 합니다.</li>
	<li>녹화 주기를 시작할 시작 시간 을 선택 합니다.</li>
	<li>MATLAB 소프트웨어를 열고 쓰기 >>cell_piv; 고 PIV 도구를 선택 합니다.</li>
	<li>기록된 영화를 포함 하는 폴더를 선택 하 고 전체 이미지 시퀀스를 로드 하려면.jpeg 파일을 선택 합니다. 각 oocyte 관심 (ROI) 영역 선택 영역 도구를 클릭 하 여 선택 합니다.</li>
	<li>파일 메뉴에서 프로세스 PIV 를 선택 합니다. 뷰어 도구 단추를 선택 합니다. 참고: 프로그램 투자 수익 내 속도 벡터를 계산 하 고.mat 파일으로 저장 된 데이터 파일을 자동으로 생성.</li>
	<li>열려는.mat 파일을 선택 합니다. 버튼 선택 ROI 도구 를 선택 하 고 개요는 oocyte의 원을 그립니다. 파일 메뉴에서 저장을 클릭 합니다. 참고:이 지역에서 벡터 표시 됩니다 하 고 평균 크기 데이터가 그래프 창에서이 새로운 투자 수익에 대 한 업데이트.</li>
	<li>오픈 전체 시간 경과 프레임의 수집된 평균 크기 데이터 기록, 행, 프레임 시퀀스에와, 열에는 스프레드시트에 각 단일 oocyte 분석.</li>
	<li>10 하위 그룹으로 NSN와 SN oocytes의 데이터를 구성 합니다.</li>
	<li>9 하위 그룹을 사용 하 여 반복적으로 피드 포워드 인공 신경 네트워크 훈련 (FANN) 및 블라인드 테스트 1 하위 그룹.<ol>
<li>다른 반복 9 번 변경 블라인드 테스트 샘플 (10 교차 유효성 검사).</li>
	</ol>
</li>
	<li>MATLAB, 맞춤 스크립트 주요 실행 열고, 요청 시, 학습 데이터 (train.txt), NSN과 SN oocytes 사용 교육 및 시간 경과 간격 (일반적으로,에서 분석할 수 있는 파일의 이름을 삽입합니다 프레임 # 1-2 프레임 # 112-113).</li>
	<li>훈련을 수행 하기 위해 입력 을 누릅니다.</li>
	<li>테스트 데이터 (test.txt) 파일의 이름을 삽입 합니다.</li>
	<li>MATLAB 작업 공간에서 벡터 test_outputs_cyt 를 엽니다. 참고: 창이 나타납니다, 첫 번째 행, NSN과 SN oocytes에 대 한 진실한 확실성 (TP 또는 진정한 NSN)와 틀린 확실성 (FP 또는 False NSN)를 각각; 얻을 확률을 보여주는 화면에 대신, 두 번째 행에 각각 False 네거티브 (FN 또는 False SN)과 NSN과 SN oocytes에 대 한 진정한 원판 (테네시 또는 진정한 SN)을 확률에서.</li>
	<li>수식을 사용 하 여: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), 백분율로 표시 FANN 정확도 계산 하.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte.">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li><li>Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+value+of+oocyte+morphology+in+human+IVF:+a+systematic+review+of+the+literature.">Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature.</a> Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).</li><li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+configurations+in+the+germinal+vesicle+of+mammalian+oocytes.">Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes.</a> Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).</li><li>Vigone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+based+identification+of+mouse+cumulus+cell+markers+that+predict+the+developmental+competence+of+their+enclosed+antral+oocytes.">Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes.</a> BMC Genomics. 14, 380 (2013).</li><li>Bui, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+movement+profiles+of+mouse+surrounding+nucleolus+and+not-surrounding+nucleolus+antral+oocytes+during+meiotic+resumption.">Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption.</a> Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).</li><li>Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organisation+and+nuclear+architecture+in+growing+mouse+oocytes.">Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).</li><li>Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+it+take+to+make+a+developmentally+competent+mammalian+egg?.">What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?.</a> Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).</li><li>Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+oocyte+nucleus+and+cytoplasm+to+the+determination+of+meiotic+and+developmental+competence+in+mice.">Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice.</a> Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).</li><li>Ajduk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+actomyosin-driven+contractions+induced+by+sperm+entry+predict+mammalian+embryo+viability.">Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability.</a> Nat. Commun. 2, 417 (2011).</li><li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-&#950;-induced+Ca2++oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Phospholipase C-&#950;-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li><li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed+forward+artificial+neural+network:+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer.">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li><li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network:+A+Review.">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

하나 마우스 oocytes 뿐만 아니라 다른 종족 들이 프로토콜을 수행 하는 동안 알아서 해야 합니다 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 일단 그들의 여 포에서 격리, oocytes 한다 즉시 전송 기록 방울에 동반자 적 운에서 분리 트리거 세포로 GV MII 전환 시작. 현재 프로토콜을 가능한 수정 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 추가 M2 매체 COCs 절연을 위해 사용 될 수 있습니다. IBMX GV MII 전환의 즉각적인 발생을 방?...

여성 불 임 여성의 증가 수에 영향을 주는 병 이다. 세계 보건 기구에 따르면 약 20% 커플의 되지 않습니다 비옥한, 여성 불 임 인 40%. 또한, 암 치료를 받고 여자의 1/3 (300000/년 및 30000/년 미국이 나 이탈리아, 각각) 조기 난소 실패를 개발.
암 환자에서 불 임 방지 하는 전략 (GV MII 전환) MII 단계로 GV oocytes 분리와 뒤 에서 체 외 성숙 (IVM) 종양학 치료 전 난소 낭의 cryopreservation입니다. 수정와 개발 프로세스와 전체 임신 성공1,2oocyte 발달 능력의 비-침략 적 마커의 가용성 향상 것 이다.
Supravital 형광 색소 Hoechst 33342와 얼룩 후 관찰 그들의 염색 질 구성에 따라 가득 포유류 oocytes는 포위 핵소체 (SN) 또는 하지 포위 핵소체 (NSN)3로 분류 됩니다. 그들의 다른 chromatin 조직 외에 이러한 두 가지 유형의 oocytes 많은 형태학 상과 기능적인 차이3,,45,6,7,8 표시 ,9, meiotic 및 발달 그들의 능력을 포함 하 여. 난소에서 분리 하 고 생체 외에서성숙 하는 때 모두 oocytes의 MII 무대를 입력 하 고 정자 수정 후 2-셀 단계로 개발 하지만 SN chromatin 조직 들만 기간9를 개발할 수 있습니다. 비록 좋은 유능한 대 무능 한 oocytes를 선택 하기 위한 분류 방법으로, 주요 단점은 자체 형광 색소와 무엇 보다도 자외선의 검색에 사용 되는 셀에 있을 수 있는 돌연변이 효과.
모든 이러한 이유로, 우리는 동일한 높은 분류 정확도 유지 하면서 Hoechst의 사용을 대체할 수 있는 SN 또는 NSN chromatin 구조와 관련 되었던 다른 비-침략 적 표시에 대 한 검색. 세포질 운동 속도 (CMVs)의 경과 관찰 셀 상태의 독특한 기능으로 떠오르고 있다. 예를 들어 최근 학문 CMVs 사이 협회 기록 수정 시간과 완료 preimplantation 및 전체 용어 개발10,11마우스 및 인간의 zygotes의 용량에서 설명 했다.
이러한 이전 연구를 바탕으로, 우리가 여기 발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 oocytes5,6,,78의 인식에 대 한 플랫폼을 설명 합니다. 플랫폼 기반으로 세 가지 주요 단계: 1) Oocytes antral 낭에서 격리는 먼저 둘러싸여 핵소체 (SN) 또는 아닙니다 포위 핵소체 (NSN); 그림 뿐만 아니라 그들의 chromatin 구성 중 하나에 따라 분류 각 단일 oocyte의 GV MII 전환 하는 동안 발생 하는 CMVs의 2) 시간 경과 이미지 촬영 및 분석 입자 이미지 velocimetry (PIV); 그리고 3) PIV와 얻은 데이터 분석으로 피드 포워드 인공 신경 네트워크 (FANN) 맹인 분류12,13. 우리는 그것을 테스트 하 고 다른 포유류 종 (예, 소, 원숭이 및 인간)에 대 한 사용 가능한 준비 하도록 마우스에 대 한 설계 절차의 가장 중요 한 단계의 세부 정보를 준다.

<table><tbody><tr><td>Folligon</td><td>Intervet</td><td>A201A02</td><td>Hormonal treatment</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>For oocyte heterochromatin staining</td></tr><tr><td>Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430165</td><td>For COCs isolation</td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red</td><td>Merck-Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>For COCs isolation</td></tr><tr><td>MEM Alpha medium (1X) + Glutamax&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td>For oocyte in vitro maturation</td></tr><tr><td>Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom&amp;nbsp;</td><td>WillCo&amp;nbsp;</td><td>GWSt-3522</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>BioStation IM-LM&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MFA91001</td><td>Live cell screening system&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>Delchimica Scientific Glassware</td><td>6709230</td><td>For follicles manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>To prevent contamination and medium evaporation</td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>To prevent medium contamination&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML16141079</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3310</td><td>For making up &amp;alpha;MEM media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;P4562</td><td>For making up &amp;alpha;MEM media</td></tr><tr><td>Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate)</td><td>Virbac Srl</td><td>QN01AX9</td><td>For mice anesthesia</td></tr><tr><td>Cell_PIV sofware&amp;nbsp;</td><td>Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Natick, MA&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td><td>For multi-paradigm numerical computing</td></tr></tbody></table>

a neural network-based identification of developmentally competent or incompetent mouse fully-grown oocytes

불 임 클리닉 발달 유능한 대 무능 한 oocytes 전반적인 임신 결과 향상 비-침략 적 절차를 사용 하 여 선택 하는 기능에서 도움이 됩니다. 우리는 최근 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포 (GV)에서 세포질 움직임의 분석 이어서 분열 II 단계 동안 마우스 oocytes의 미세한 라이브 관측에 따라 분류 방법 개발 이 경과 기간 동안 발생 하는. 여기, 우리는이 절차의 상세한 프로토콜을 제시. Oocytes 가득 antral 낭에서 격리 되며 15 h 37 ° C, 5% CO2시간 경과 분석 위해 현미경 내부에 대 한 교양. 사진은 8 분 간격으로 찍힌다. 이미지 각 oocyte 대 한 세포질 이동 속도 (CMVs) 문화 기간에 걸쳐 발생의 프로 파일을 계산 하는 입자 이미지 Velocimetry (PIV) 방법을 사용 하 여 분석 된다. 마지막으로, 각 단일 oocyte의 CMVs는 발달 관할 또는 91.03%의 정확도로 무능 한 배우자의 확률을 예측 수학 분류 도구 (피드 포워드 인공 신경 네트워크, FANN)를 통해 먹인 다. 이 프로토콜, 마우스에 대 한 설정 인간을 포함 한 다른 종의 oocytes에 지금은 테스트 수 있습니다.

그림 2 는 각각 처음 (GV) 및 끝 (MII) IVM 절차의 대표적인 발달 유능 하 고 무능 한 oocyte를 보여준다. IVM 가득 마우스 oocytes의 15 h 문화 발생합니다. 시간 경과 관찰 감수 분열의 진행을 기록 하 고는 GVBD와 첫 번째 극 시체의 돌출을 포함 하 여 주요 meiotic 이벤트 감지.
분석 및 비교 무능 한 oocytes 발달 유능한 ...

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A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

여기, 선물이 oocyte 발달 능력 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포에서 분열 II 단계 동안 수행의 비-침략 적 평가 대 한 프로토콜. 이 방법은 입자 이미지 velocimetry (PIV)와 신경망 분석 시간 경과 영상을 결합합니다.

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

a-neural-network-based-identification-developmentally-competent-or

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K 조회수.  University of Pavia. 여기, 선물이 oocyte 발달 능력 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포에서 분열 II 단계 동안 수행의 비-침략 적 평가 대 한 프로토콜. 이 방법은 입자 이미지 velocimetry (PIV)와 신경망 분석 시간 경과 영상을 결합합니다.

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Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

연구

발생학

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

유전학

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

성인 마우스 난소의 정확한 여포 열거

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

마우스의 Prophase-Arrested 난모세포에서 DNA 손상 확인

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

저자 스포트라이트: 포유류 난모세포와 착상 전 배아의 DNA 손상 반응 이해 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

요약

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핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

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Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가