Name: collection of post-mating semen from the female reproductive tract and measurement of semen liquefaction in mice
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice at JoVE.com

이 작품은 ww 수의학 대학 (WSU) 시작 기금에 의해 지원 됩니다. 저자는이 논문의 중요 한 독서에 대 한 시에라 올 슨 (WSU) 감사합니다.

모든 동물 및 절차가이 연구에 사용 된은 WSU 승인 동물 프로토콜 #4702 # 4735과 워싱턴 주립 대학 (WSU) 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 처리 합니다.
1입니다. 마우스
<ol><li>
사용 하 여 표준 C57BL/6J 성인 남성 쥐 또는 관심의 다른 긴장. 물과 음식 광고 libitum 액세스와 온도 및 습도 제어 환경에서 동물을 유지 한다.
	<ol>
<li>8 주 정도에서 10 개월에 이르기까지 남성 브리 더를 사용 합니다. 실험에서 입증 된 종만을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재생산 지역 스 트로 겐 수용 체 α ( Esr1 유전자 인코딩)의 조직 선택적 삭제와 성인 여성 쥐를 사용 하 여 상피 세포10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, 녹아웃 또는 "코" 라고)이이 연구에서 littermates (Esr1f/f, "CTRL" 라는) 제어.
	<ol>
<li>8 주 된 여성을 사용 합니다. 여성의 연령대의 실험에 따라 다양합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아침 08시 h에 estrous 사이클의 단계를 결정 합니다. 주기의 발 정기 단계에서 여성만을 사용 합니다. 질 번짐 및 cytological 분석의 자세한 방법에 대 한 이전 게시 절차11를 참조 하십시오.</li>
</ol>2. 짝짓기와 Copulatory 플러그를 평가
<ol><li>발 정기 (16시 h) 일에서 남자의 감 금 소에 여성을 집.</li>
	<li>다음날 아침 (08시 h), 남성 마우스에서 여성을 구분 합니다.</li>
	<li>짝짓기의 표시로 질 또는 copulatory 플러그의 유무를 이전에 게시 방법12 의 적응을 사용 합니다.</li>
	<li>짧게 뒷 다리 사지를 들어 꼬리의 기지에서 여성 마우스를 잡아.</li>
	<li>이쑤시개를 사용 하 여 질 오프닝에서 하얀 정액 coagulum의 존재에 의해 copulatory 플러그를 찾아. 있으면 copulatory 플러그, 이쑤시개 질 운하에 삽입할 수 없습니다.</li>
</ol>3입니다. 조직 컬렉션 전에 준비
<ol><li>10 mL Leibovitz의 L-15 미디어, 보충 1% 태아 둔감 한 혈 청의 준비 (라고 L15 미디어 + 1 %FBS) 15 mL 튜브에. waterbath에 15 분 동안 37 ° C에서 미디어를 품 어.</li>
	<li>조직 및 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 정자의 생존을 위해, 미리 데워 진 L15 미디어 + 1%의 aliquot 2 mL 2 mL microcentrifuge에서 FBS 조직 컬렉션에 대 한 관.</li>
	<li>37 ° c.에 stereomicroscope의 단계를 따뜻한 37 ° C로 열 블록을 설정 하 고 블록에는 빈 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 배치.</li>
	<li>다운스트림 응용 프로그램에서는 정자의 운동 성, 따뜻한의 37 ° c 유리 슬라이드 이미징 하는 경우</li>
</ol>4. 조직 컬렉션
<ol><li>조직 컬렉션 영역에 미리 따뜻하게 L15 미디어 + 1 %FBS 약 수를가지고.</li>
	<li>여성 안락사 (~ 08:30 h) 자 궁 경관 탈 구 다음 이산화탄소 질 식을 사용 하 여. 참고: 이것은 대략 8 h 짝짓기 후 가정 자정에 일어난 짝짓기입니다.</li>
	<li>복 부 영역을 노출 하는 부정사 위치에 동물을 놓습니다.</li>
	<li>복 부 뒷 다리 사지 근처에 70% 알코올을 스프레이.</li>
	<li>낮은 복 부의 피부에 작은 상처 (~ 1 cm)을 해가 위를 사용 합니다.</li>
	<li>지배적인 손을 꼬리 (및 필요한 경우 뒷 다리 사지)를 사용 하 여 비 지배적인 손을 당긴 다 피부 (머리)를 향해 반대 방향으로 복 부 근육을 노출 하는 동안. 이 메서드는 내장 장기에 머리 오염의 최소화 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>V-모양에 인접 한 질, 복 부의 기지에서 내장 장기를 노출 하는 복 부 근육을 잘라.</li>
	<li>내장 및 복 부 지방 노출 재생산 지역 쪽으로 이동 합니다.</li>
	<li>방광과 질 영역 위에 다른 조직에서 트림.</li>
	<li>음모 관절 질 조직에 대 한 액세스를 얻기 위해 떨어져 잘라.</li>
	<li>질에 질 직물 들어올린 직장 조직에서 질 운하를 분리 하는 위를 사용 하 여.</li>
	<li>신중 하 게 봄이 위를 사용 하 여 자 궁의 양쪽에서 mesenteric 지방에서 트림. 주의: 자 궁 안에 정액 매우 깨지기 쉬운입니다. 자 궁을 찔린 하지 않도록 주의 하십시오 또는 다른 정액 손실 됩니다.</li>
	<li>더 낮은 재생산 지역 들어올리고 양쪽의 난소 지방 패드를 잘라 합니다.</li>
	<li>미리 따뜻하게 Leibovitz L-15 미디어 + 1%의 관에는 전체 생식 기관 전송 FBS.</li>
</ol>5. 자 궁 콘텐츠 컬렉션에서 정액 액 화 (점도)의 측정
<ol><li>stereomicroscope의 열띤된 무대에서 35mm 무 균 조직 문화 접시에 조직 3.5 mL 가득 전송 사전 예 열 L-15 미디어 + 1 %FBS 혈액과 다른 오염 물질의 조직 청소. 주의: 세척, 동안 지방, 아니라 자 궁 조직을 잡아. 정액이 시점에서 예상 되는 자 궁 안에 그대로 수.</li>
	<li>실험실 물티슈를 사용 하 여 초과 미디어의 조직 오 점.</li>
	<li>미리가 열된 microcentrifuge 관에서 난소 끝을 배치 하면서 조직 질 끝에 잡으십시오. 질 끝을 잡고, 자 궁, 자 궁 뿔 microcentrifuge 튜브에 빠지게 할 수 있도록의 기지에서 자 궁 뿔을 잘라.</li>
	<li>정액 하 게 튜브에 자 궁 뿔에서 흐름. 한적한 포 셉을 사용 하 여 부드럽게 질 끝, 남은 정액 밖으로 추방 하는 난소에서 자 궁 뿔을 짠 다.</li>
	<li>생물 학적 가방에서 티슈를 삭제 하 고 소 각.</li>
	<li>짧게는 minicentrifuge에 정액 아래로 회전 (1 ~ 2 s).</li>
	<li>튜브, 열띤된 무대에 평행 하다-정액 밖으로 유출 하지 않습니다.</li>
	<li>타이머를 준비 하 고 '을 계산 하 는'로 설정.</li>
	<li>(튜브 벽에 평행) 180 ° 각도로 정액 샘플으로 25 µ L 모 세관 튜브를 삽입 합니다. 이것은 다른 각도에서 모 세관 튜브를 잡고 각 조사 사이 가변성을 최소화 하는 것입니다.</li>
	<li>모 세관 튜브 게 타이머를 누르면 정액과 접촉.</li>
	<li>정액 25 µ L 라인에 도달 하는 데 걸리는 시간 (s)를 기록 합니다.</li>
	<li>측정 완료 되 면 바로 추가 기능 분석, 정자 운동 성의 비디오 영상 등을 위해 건조 열 블록에 다시 정액을 포함 하는 튜브를 넣어.</li>
	<li>20 분 동안 10% 표 백제 솔루션에서 튜브를 immersing 하 여 정액을 포함 하는 모 세관 튜브를 소독 하 고 세관 sharps 컨테이너에서 삭제.</li>
</ol>6. 비디오 이미징 정자 운동 성의
<ol><li>현미경 및 비디오 이미징 소프트웨어 설정.</li>
	<li>유리 슬라이드 온수 스테이지에 배치 하는 동안 미리 데워 진된 유리 슬라이드에 남은 정액의 20 µ L를 플라스틱.</li>
	<li>유리 coverslip 커버.</li>
	<li>현미경 슬라이드 coverslip 측면을 내려 놓습니다.</li>
	<li>20 X 렌즈를 사용 하 여 관심 영역을 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>100 X 객관적 렌즈 비디오 영상에 대 한 변경 합니다.</li>
	<li>30 12 프레임/s (fps)에서 비디오 s.</li>
	<li>임의로 동물 당 적어도 3 개의 다른 영역에 동영상을 기록 합니다.</li>
	<li>이미징 수행 신속 하 고 정자의 운동 성 및 생존 능력을 유지 하기 위해 슬라이드에 빛 노출을 최소화. 참고:이 이미징 절차는 2-3 분 내에서 행해져야 한다.</li>
	<li>앞에서 설명한8ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석을 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract.">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li><li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster.">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li><li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+semenogelin.">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li><li>Lilja, H., Abrahamsson, P. 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L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo.">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).</li><li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+semen+hyperviscosity:+prevalence,+pathogenesis+and+therapeutic+aspects.">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li><li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. 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(67), e4389 (2012).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Fundamentals+of+Breeding+and+Weaning.">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases.">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li><li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid.">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

같이 전 수 정액 및 여성 재생산 지역. 에서 분 비 물 간의 생리 적인 상호 작용 정액 분석에서 생체 외에서 이점을 제공할 수 있습니다 마우스 uteri에서 정액을 수집 이 연구에서 제시 하는 기술 연구원 정액 품질과 정자 생존으로 이상적인 생리 조건에서 운동 성을 확인 하 수 있습니다. 또한, 정액은 uteri에서 수집 된를 사용 하 여 수행할 수 있는 다양 한 다운스트림 분석, 예를 들어 정자 자 궁 및 정자 입력 실제 정자 수는 또한 운동 성 분석에 대 한 몇 군데 수 결정 계산 하실 수 있습니다. 수정 기능에 대 한 정액을 수집 하도록 이상적인 시간 포인트1짝짓기 후 1 ~ 2 h 이내 이어야 한다.
이전에 언급 한 다운스트림 응용 프로그램 뿐만 아니라 조사 또한 정자 수송에 억제제/화합물 관심의 효과 평가 수 처리, 정액 액 화 (또는 정액 점도), 정자 수, 정자에 운동 성, 또는 다른 지역 여성 생식 관의 정자 마이그레이션. 화합물8짝짓기 전에 여성 재생산 지역에 적용할 수 있습니다. 그런 다음, 그 억제제/화합물의 영향. 을 짝짓기 후 정액 샘플에서 평가 될 수 있다 이러한 메서드는 정자 수송을 억제 하는 피임 약의 실용성 테스트 유용할 수 있습니다.
정액 컬렉션 및 액 화/점도 측정에 대 한 배려의 중요 한 포인트는 정자의 감도 및 모 세관 튜브의 각도. 정자는 온도 변화에 민감합니다. 정자의 기능과 운동 성의 다운스트림 분석 실험 결과, 조직에 대 한 필수적 이며 정액에서 37 ° C에서 지켜질 필요가 경우 항상, 빛에 최소한의 노출. 만약 여러 여성에서 수집, 대기를 최소화 하기 위해 한 번에 한 동물을 안락사 여러 샘플을 확인 하 고 있습니다. 측정을 위해 액 화, 모 세관 튜브의 다른 각도 액 화 시간에 불일치를 생성합니다. 따라서, 조사자를 모 세관 튜브 튜브 벽에 병렬 (180 ° 각도)에서 각 조사에 의해 만들어진 변화를 최소화 하기 위해 있다. 정액 샘플 09시 h 이후에 수집 되어야 하지, 이것은 자 궁에서 액체 재흡수 때문 이다. 조사 하지 액 측정에 대 한 충분 한 액체 재료를 얻을 수 있습니다.
정액 액 화13전립선 분 비 하는 PSA의 효소 활동에 의해 중재 주로 설치 된다. 그러나, vivo에서 액 화 과정8동안 여성 생식 관의 역할을 결정 하기 위해 제한 된 연구 있다. 따라서, 컬렉션 여성 재생산 지역에서 정액의 액 화 연구에 중요 한 이점은 처리 vivo에서, 정액 여성 재생산 지역14에서 분 비 물에 노출 되었습니다 후 제공 합니다. 끝으로, 후 ejaculated 정액 액 화/점도 측정 정액과 여성 생식 기관 사이 상호 작용 해독 연구 수 있습니다.

여성 재생산 지역 상위 및 하위 책자의 구성 됩니다. 위 재생산 지역에는 나 팔 관, 자 궁 그리고 endocervix는 포함 되어 있습니다. 낮은 재생산 지역에는 ectocervix 및 질 포함 됩니다. 인간에서는, ejaculated 정액 ectocervix1에 인접 한 질 앞쪽 벽에 입금 됩니다. 그러나 쥐,, 정액은 휩 쓸 자 궁으로2짝짓기 후 분 이내.
정액 침투 수를 정자를 일으키는 루의 초 이내에 경화 되 고3움직일 정액 젤을 포함 합니다. 액 화 물 일관성에 젤 같은에서 정액을 변경 하 여 고정된 정자를 해제 합니다. 이 과정은 정자의 운동 성 및 포유류 복제에 대 한 필수적입니다. 정액 액 화의 지식은 주로 어디 정액 문화 접시에 액 화 된다 생체 외에서 연구 기반으로 합니다. 인간에서는, 전립선 특정 항 원 또는 PSA (일컬어 kallikrein 관련 peptidase 3 또는 KLK3)의 효소 활동은 semenogelins (젤 형성 단백질 정액에 존재)4 의 가수분해를 통해 액 화에 대 한 주요 기여자 ,56. Semenogelins의 정자 이동성 증가 정액 coagulum에서 정자를 줘 라. 계란을 기름 지 게 나 팔 관으로 정자 수영을 해제. 액 화 (또는 정액 점도) 테스트는 불 임 클리닉 남성 불 임7평가에서 정액 분석을 위한 표준 초기 검 진 중 하나.
최근에 출판 된 기사를 정액 액체 여성 마우스 생식 관 후 짝짓기에서 수집 된의 분석 이후에 다 산 결함8를 일으킬 수 있는 액 화 결핍을 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 결함이 액 정액 hyperviscosity 같은 남자9, 일반 액 화는 포유류 복제를 위한 불가결 제안에 불 임 사례의 11.8 32.3%에 기여 한다. 그러나, 연구 및 치료 액 결함의 남성7에 독점적으로 집중 했다. 여성 재생산 지역 정액 액 화에서 역할을 담당 하는 가능성은 탐구 하지. 따라서, 정액 수집 및 액 화 시간 측정 방법 연구 액 관심의 모델 생물에서 불 임의 원인 중 하나 될 수 있는지 여부를 결정 하는 새로운 진단 도구를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Toothpick</td><td>Diamond</td><td>750-Flat</td><td>Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>25-&amp;mu;L glass capillary tube</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 media</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td>Supplement with 1% FBS</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>2-mL microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-A</td><td></td></tr><tr><td>Digital dry block heater</td><td>VWR</td><td>13259-052</td><td>For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection</td></tr><tr><td>Minicentrifuge</td><td>Corning</td><td>LSE 6765</td><td></td></tr><tr><td>35-mm culture dish</td><td>VWR</td><td>10861-656</td><td></td></tr><tr><td>15-mL polypropylene centrifuge tube</td><td>VWR</td><td>10025-686</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Precision</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Heated stage stereomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ10F</td><td>To keep the tissue warm prior to semen collection</td></tr><tr><td>Brightfield microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td>Optional. For video imaging of the sperm motility</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC2900</td><td>Optional. For video imaging of the sperm motility</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Optional. For video imaging of the sperm motility</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>VWR</td><td>48393-059</td><td>Optional. For video imaging of the sperm motility</td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Dilute in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 10% concentration</td></tr></tbody></table>

collection of post-mating semen from the female reproductive tract and measurement of semen liquefaction in mice

마우스에 ejaculated 정액은 자 궁에 입금 됩니다. 사정 후 정액에서 젤 같은 일관성을 변경 물, 프로세스 라는 액 화. 이 연구에서 우리는 마우스 모델에서 여성 재생산 지역에서 후 ejaculated 정액을 수집 하는 방법을 보여줍니다. 첫째, 성인 여성 쥐 발 정기 단계에서 남자의 감 금 소에 하룻밤 보관 되어 있었다. 다음날 아침, 결합 질에 copulatory 플러그의 존재에 의해 확인 됐다. 여성 쥐 copulatory 플러그와 안락사 했다 고 각 생식 관 (질, 자 궁, oviducts, 난소), 전체적으로 수집 된 정액을 포함 하는 닫힌된 시스템을 보장. 튜브에 정액을 풀어 질 렸와 생식로 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 배치 되었다. 분석에 대 한 최대 정액 볼륨을 보장 하기 위해, 한적한 집게는 나머지 정액을 추방 하는 질 끝에 난소에서 자 궁 뿔을 집어넣은 사용 되었다. 전체 생식 관은 다음 삭제 됩니다. 정액에 포함 된 튜브는 잠시 내려 냈 지. 25 μ 모 세관 피 펫 (튜브 벽에 평행) 180 ° 각도로 튜브에 배치 했다. 25 μ 라인에 모 세관 튜브를 작성 하는 데 사용 하는 시간을 기록 했다. 검증 된 남성 종 축에서 정액은 일반적으로 25 μ 모 세관 튜브를 채우기 위해 약 60-180 s를 걸립니다. 이 정액 컬렉션 기술은 또한 정자 이미징 및 운동 성 분석 등 다른 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.

정액은 비옥한 CTRL 남성과 짝짓기 후 ctrl 키와 코 여성 약 8 h에서 수집 되었다. 액 화 (또는 정액 점도) 정액 25 μ 모 세관 튜브를 작성 하는 데 걸린 시간에 의해 정량 이다. 정액에서 CTRL uteri 수집 했다 2.06 ±0.12 분 (mean±S.E.M, n = 5) 모 세관 튜브 (그림 1)을 채우기 위해. 그러나, 정액 코 uteri에서 수집 했다 60 분 이상 (60.0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) 실험 시간. 이러한 데이터 정액은 크게 더 액 화 또는 CTRL에 보다 적게 점성 코 uteri에 비해 좋습니다.
여성 재생산 지역에서 정액을 모으기의 다운스트림 응용 프로그램 중 하나를 설명 하기 위해 정자 운동 성 비디오 이미지를 사용 하 여 평가 했다. 정액 그림 2A에서 스냅숏에서 미세한 필드 내에서 자유롭게 수영 정자를 보여주었다 CTRL uteri에서 수집. 코 uteri에서 수집한 정액 정액의 대부분 최소한의 이동성 (그림 2B) 함께 클러스터 했다 보여주었다. 이러한 연구 결과 정액 수집 여성 생식 관 8 h에서에서 짝짓기 더 정자 분석에 사용할 수 있습니다 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56670/56670fig1.jpg"> 그림 1 : 액 화 시간 (정액 점도) 정액에서 수집 마우스 uteri에서. 정액의 액 화 시간 (분)의 그래픽 표현을 짝짓기 후 약 8 h ctrl 키와 코 uteri에서 수집. 데이터를 나타내는 mean±S.E.M., n = 5 여성/유전자. p < 0.001, 짝이 없는 학생 t-테스트. 허가 이전에 게시 결과8 에서 적응. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56670/56670fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56670/56670fig2.jpg"> 그림 2 : 정액 내 정자의 대표 이미지 마우스 uteri에서 수집. 정액에 정자의 1000 X 배율에서 찍은 비디오 영상에서 대표적인 스냅샷 ctrl 키 (A) 와 (B) 코 uteri에서 수집. 이전 게시 결과8 동의에서 적응. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56670/56670fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

후에 쥐에 있는 정액 액의 측정 및 여성 재생산 지역에서 정액 짝짓기의 컬렉션

정액 액 화는 정액 젤에서 해방 될 정자에 대 한 필요 합니다. 이 연구는 여성 재생산 지역 포스트 성교에서 정액을 수집 하 고 정액 액 화 시간을 측정 하기 위한 절차를 제공 합니다.

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.4K 조회수.  Washington State University. 정액 액 화는 정액 젤에서 해방 될 정자에 대 한 필요 합니다. 이 연구는 여성 재생산 지역 포스트 성교에서 정액을 수집 하 고 정액 액 화 시간을 측정 하기 위한 절차를 제공 합니다.

비디오: Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of otherwise healthy women during their reproductive years18,32-34. Predisposing factors include antibiotic usage, uncontrolled diabetes and disturbance in reproductive hormone levels due to pregnancy, oral contraceptives or hormone replacement therapies33,34. Recurrent VVC (RVVC), defined as three or more episodes per year, affects a separate 5 to 8% of women with no predisposing factors33.
An experimental mouse model of VVC has been established and used to study the pathogenesis and mucosal host response to Candida3,4,11,16,17,19,21,25,37. This model has also been employed to test potential antifungal therapies in vivo13,24. The model requires that the animals be maintained in a state of pseudoestrus for optimal Candida colonization/infection6,14,23. Under such conditions, inoculated animals will have detectable vaginal fungal burden for weeks to months. Past studies show an extremely high parallel between the animal model and human infection relative to immunological and physiological properties3,16,21. Differences, however, include a lack of Candida as normal vaginal flora and a neutral vaginal pH in the mice.
Here, we demonstrate a series of key methods in the mouse vaginitis model that include vaginal inoculation, rapid collection of vaginal specimens, assessment of vaginal fungal burden, and tissue preparations for cellular extraction/isolation. This is followed by representative results for constituents of vaginal lavage fluid, fungal burden, and draining lymph node leukocyte yields. With the use of anesthetics, lavage samples can be collected at multiple time points on the same mice for longitudinal evaluation of infection/colonization. Furthermore, this model requires no immunosuppressive agents to initiate infection, allowing immunological studies under defined host conditions. Finally, the model and each technique introduced here could potentially give rise to use of the methodologies to examine other infectious diseases of the lower female genital tract (bacterial, parasitic, viral) and respective local or systemic host defenses.

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Key techniques to be used in the evaluation of Candida vaginitis in an experimental animal model are described. The methods will allow rapid collection of vaginal specimens and lymphocytes from draining lumbar lymph nodes. These techniques could give rise to mouse models of other diseases in the female lower genital tract.

의 실험 마우스 모델에서 질 접종 및 샘플 수집을위한 프로토콜 칸디다 질염

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

연구

면역학 및 감염병학

Assessment of Sexual Behavior of Male Mice

Sexual behavior is highly species-specific. Although rodents have slightly different sexual behaviors, mice and rats have a similar sexual behavioral pattern. The purpose of this article is to describe the hormone-induced estrus ovariectomized female model and the experimental procedure for the assessment of sexual behavior of male mice. The most important sexual behavioral elements are demonstrated in the video and illustrations. The critical steps, advantages, and limitations of the sexual behavior test are explained as well. Finally, the behavior parameters are presented, and mounting, intromission, and ejaculation processes in mating are distinguished. Behavioral parameters are assessed in terms of the occurred duration and counts during the test period.

This article describes how to perform sexual behavior tests in male mice.

남성 마우스의 성적 행동의 평가

Sexual behavior is highly species-specific. Although rodents have slightly different sexual behaviors, mice and rats have a similar sexual behavioral ...

행동분석학

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

그룹 B의 쥐 모델<em&gt; 연쇄상 구균</em&gt; 질 식민

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph

The female reproductive organs, specifically the vagina and cervix, are composed of various cellular components and a unique extracellular matrix (ECM). Smooth muscle cells exhibit a contractile function within the vaginal and cervical walls. Depending on the biochemical environment and the mechanical distension of the organ walls, the smooth muscle cells alter the contractile conditions. The contribution of the smooth muscle cells under baseline physiological conditions is classified as a basal tone. More specifically, a basal tone is the baseline partial constriction of smooth muscle cells in the absence of hormonal and neural stimulation. Furthermore, the ECM provides structural support for the organ walls and functions as a reservoir for biochemical cues. These biochemical cues are vital to various organ functions, such as inciting growth and maintaining homeostasis. The ECM of each organ is composed primarily of collagen fibers (mostly collagen types I, III, and V), elastic fibers, and glycosaminoglycans/proteoglycans. The composition and organization of the ECM dictate the mechanical properties of each organ. A change in ECM composition may lead to the development of reproductive pathologies, such as pelvic organ prolapse or premature cervical remodeling. Furthermore, changes in ECM microstructure and stiffness may alter smooth muscle cell activity and phenotype, thus resulting in the loss of the contractile force.
In this work, the reported protocols are used to assess the basal tone and passive mechanical properties of the nonpregnant murine vagina and cervix at 4-6 months of age in estrus. The organs were mounted in a commercially available pressure myograph and both pressure-diameter and force-length tests were performed. Sample data and data analysis techniques for the mechanical characterization of the reproductive organs are included. Such information may be useful for constructing mathematical models and rationally designing therapeutic interventions for women&#8217;s health pathologies.

This protocol utilized a commercially available pressure myograph system to perform pressure myograph testing on the murine vagina and cervix. Utilizing media with and without calcium, the contributions of the smooth muscle cells (SMC) basal tone and passive extracellular matrix (ECM) were isolated for the organs under estimated physiological conditions.

압력 근엽을 이용한 뮤린 생식 계통의 양축 기저톤 및 수동 테스트

The female reproductive organs, specifically the vagina and cervix, are composed of various cellular components and a unique extracellular matrix (ECM). ...

생체공학

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

마우스 Estrous 사이클 스테이징 확인을 위해 질 세척, 크리스탈 바이올렛의 착색 및 질 Cytological 평가를 수행

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

생물학

Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also termed the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The reproductive axis is a key integrator of environmental and internal input adapting fertility to favorable conditions for reproduction. Prior to embarking upon a fertility study in mice and rats, sexual maturity is evaluated to exclude the possibility that the observed reproductive phenotypes are caused by delayed or absent pubertal onset. This protocol describes a non-invasive approach to assess pubertal onset in males through the determination of preputial separation, and in females through vaginal opening and first estrus. After the confirmation of the completion of puberty and the achievement of sexual maturity, a fertility study can be initiated. The procedure describes the optimal breeding conditions for mice and rats, how to set up a fertility study, and what parameters to evaluate and determine if the treatment or gene deletion has an impact on fertility.

Many treatments and genetic mutations impact the timing of sexual maturity and fertility. This protocol describes a non-invasive method to evaluate pubertal onset in mice and rats prior to setting up a fertility study in sexually mature animals.

Pubertal 발병을 확인 하 고 쥐 및 쥐에 다 산 분석 결과 수행 하 여 생식 능력의 결정

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. Here, we present an easy and inexpensive method that would be instrumental for testing new drugs decreasing uterine contractility. This method utilizes the unique ability of the entire mouse reproductive tract to exhibit spontaneous motility when maintained ex vivo in a Petri dish containing oxygenated Krebs buffer. This spontaneous motility resembles the wave-like myometrial activity of the human uterus, referred to as endometrial waves. To demonstrate the effectiveness of the method, we employed a well-known uterine relaxant drug, epinephrine. We demonstrate that the spontaneous motility of the entire mouse reproductive tract can be quickly and reversibly inhibited by 1 &#181;M epinephrine in this Petri dish model. Documenting the changes of uterine motility can be easily done using an ordinary smart phone or a sophisticated digital camera. We developed a MATLAB-based algorithm allowing motion tracking to quantify spontaneous uterine motility changes by measuring the rate of uterine horn movements. A major advantage of this ex vivo approach is that the reproductive tract remains intact throughout the entire experiment, preserving all intrinsic intrauterine cellular interactions. The major limitation of this approach is that up to 10-20% of uteri may exhibit no spontaneous motility. Thus far, this is the first quantitative ex vivo method for assessing spontaneous uterine motility in a Petri dish model.

Uterine contractions are important for the well-being of females. However, pathologically increased contractility may result in dysmenorrhea, especially in younger females. Here, we describe a simple ex vivo preparation allowing quick assessment of the efficacy of smooth muscle relaxants that may be used for treating dysmenorrhea.

마우스 생식 기관 자발적 운동성 및 데이터 분석을 위한 MATLAB 기반 자궁 운동 추적 알고리즘을 평가하기 위한 Ex Vivo 방법

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...

Development of a Novel Endometrioma-Simulating Mouse Model

Establishment of an Experimental Mouse Model of Endometrioma to Study its Related Infertility

Endometrioma (OMA), a subtype of endometriosis characterized by the formation of endometriotic cysts in the ovaries, affects 17-44% of individuals diagnosed with endometriosis. Women with OMA often experience compromised fertility, yet the exact mechanisms underlying OMA-associated infertility remain unclear. Notably, existing animal models simulate superficial peritoneal endometriosis (SUP) and deep infiltrating endometriosis (DIE), leaving a notable gap in research focused on OMA. In response to the gap of knowledge, this paper introduces a pioneering OMA-simulating mouse model and provides a comprehensive description of the techniques and procedures employed in the model. With a high success rate of 83% and ovarian lesion specificity, this model holds significant promise for advancing our understanding of OMA, particularly in the context of infertility. It offers a valuable platform for conducting targeted research into OMA-associated fertility challenges, potentially paving the way for improved diagnostic and therapeutic strategies in the field of reproductive medicine.

This study introduces a novel mouse model specifically designed to simulate endometrioma, a clinically significant subtype of endometriosis. By utilizing C57BL/6J mice, the model aims to elucidate the pathophysiological mechanisms underlying endometrioma-related infertility, offering a refined tool to bridge the current knowledge gap in reproductive medicine.

Endometrioma (OMA), a subtype of endometriosis characterized by the formation of endometriotic cysts in the ovaries, affects 17-44% of individuals ...

의학

자궁 경부 조작은 보조 생식을 위해 마우스에서 가성 임신을 유도했습니다.

Inducing Pseudopregnancy in Female Mice Without the Need for Vasectomized Males Prior to Non-Surgical Embryo Transfer or Artificial Insemination

For successfully maintaining pregnancy with embryo transfer or artificial insemination,&#160;female recipient mice must be induced into a pseudopregnant state. Female mice are traditionally paired overnight with vasectomized males, and the following morning, the presence of a copulation plug is assessed. To increase the efficiency of producing pseudopregnant females, a cervical manipulation technique has been standardized to be used in combination with non-surgical embryo transfer or artificial insemination techniques in mice. The blunt end of a small plastic rod is inserted vaginally to contact the cervix and is vibrated for 30 s by contact with a trimmer. The procedure is quick and does not require anesthesia or analgesia. This technique increases the reliability and predictability of producing pseudopregnant females and entirely eliminates the requirement for vasectomized males. For CD1 mice, the efficiency of pseudopregnancy induction using cervical manipulation was 83% for females in estrus (N = 76) but only 38% of females in estrus were plugged by vasectomized males (N = 24). Artificial insemination in CD1 mice was performed by estrus synchronization with hormones, cervical manipulation, and the uterine transfer of sperm. Artificial insemination recipients receiving cervical manipulation (N = 76) had a pregnancy rate of 72% and an average litter size of 8.3 pups. This method can also be used to produce pseudopregnant females for non-surgical embryo transfer. Therefore, inducing pseudopregnancy by cervical manipulation is a convenient and efficient alternative to mating with a vasectomized male when performing non-surgical assisted reproduction techniques. Using cervical manipulation provides 3Rs (replacement, reduction, and refinement) benefits for assisted reproduction techniques by reducing the number of animals required and eliminating the necessity for surgically altered males.

저자 스포트라이트: 비수술적 배아 이식 또는 인공 수정 전에 정관 수술을 받은 수컷 생쥐 없이 암컷 마우스에서 가성 임신 유도  

The cervical manipulation method presented can induce pseudopregnancy in mice without the need for breeding females with vasectomized males. The induction of pseudopregnancy is required for the success of non-surgical embryo transfer and non-surgical artificial insemination, both of which are also presented.

비수술적 배아 이식 또는 인공 수정 전에 정관 수술을 받은 수컷 없이 암컷 마우스에서 가임신을 유도하는 행위

For successfully maintaining pregnancy with embryo transfer or artificial insemination,&#160;female recipient mice must be induced into a pseudopregnant ...

후에 쥐에 있는 정액 액의 측정 및 여성 재생산 지역에서 정액 짝짓기의 컬렉션

요약

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의 실험 마우스 모델에서 질 접종 및 샘플 수집을위한 프로토콜 칸디다 질염

남성 마우스의 성적 행동의 평가

그룹 B의 쥐 모델

압력 근엽을 이용한 뮤린 생식 계통의 양축 기저톤 및 수동 테스트

마우스 Estrous 사이클 스테이징 확인을 위해 질 세척, 크리스탈 바이올렛의 착색 및 질 Cytological 평가를 수행

Pubertal 발병을 확인 하 고 쥐 및 쥐에 다 산 분석 결과 수행 하 여 생식 능력의 결정

마우스 생식 기관 자발적 운동성 및 데이터 분석을 위한 MATLAB 기반 자궁 운동 추적 알고리즘을 평가하기 위한 Ex Vivo 방법

Establishment of an Experimental Mouse Model of Endometrioma to Study its Related Infertility

비수술적 배아 이식 또는 인공 수정 전에 정관 수술을 받은 수컷 없이 암컷 마우스에서 가임신을 유도하는 행위

비수술적 배아 이식 또는 인공 수정 전에 정관 수술을 받은 수컷 없이 암컷 마우스에서 가임신을 유도하는 행위