우리 감사 앤드류 젱 IIF 실험을 수행 하 고 이미지를 수집.

프로토콜은 삼위일체 생명 공학 기관 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 샘플 및 기판 준비
<ol><li>파우치 포함 하는 기판 슬라이드를 허용 (12 웰 스와 HEp2 또는 형 간염을 포함 하는 각 슬라이드에 슬라이드 유리-2 + HEp2 코 셀 혼합물) 최적의 성능을 위해 실내 온도에 equilibrate 이전에 슬라이드 표면에 수 분의 응축을 방지 하는 샘플의 추가입니다. 이것은 약 10-15 분 사이 소요 됩니다.</li>
	<li>실내 온도에 equilibrated, 신중 하 게 제거 하는 주머니의 측면을 건드리지 그들 없이 손가락을 사용 하 여 기판 슬라이드.</li>
	<li>슬라이드 레이블 하 고 (실 온)에서 보육 실에서 샘플 및 어원이 부 화 하는 동안 슬라이드의 건조를 방지 하기 위해 물에 적신 종이 타월로 줄지어 그들을 배치. 참고: 일반적인 얼룩이 드라이 웰 스;에서 발생할 수 있습니다. 젖은 종이 타월 인큐베이션 챔버 내부 습도 제공 하 고 잘 건조를 방지.</li>
</ol>2입니다. 추가 컨트롤 및 샘플
<ol><li>이 연구, 또는 개별 슬라이드 우물에 환자 혈 청 샘플에 설명 된 대로 부정/긍정적인 컨트롤, DFS70-아나 긍정적인 세라의 조합의 약 50 µ L을 분배.</li>
	<li>슬라이드에서 각 우물에 컨트롤 및 샘플을 분배.</li>
	<li>잘 교차 오염을 방지 하기 위해, 우물 overfilling 하지 마십시오. 웰 스 overfilling 하지, 하는 동안 잘 표면의 완전 한 범위를 확인 하 고 공기 방울을 피하기 위해. 참고: 권장된 볼륨은 50 µ L 단계 2.1에 의하여.</li>
	<li>보육 실에 뚜껑을 배치 하 고 실 온에서 30 분에 대 한 슬라이드를 품 어. 어떤 아나 환자의 혈 청에 있는 경우에, 그것은이 잠복기 동안에 각 잘 현재 셀에 바인딩합니다.</li>
	<li>일단 잠복기가 끝나면, 보육 실에서 슬라이드를 제거 합니다. 탭 끝에 슬라이드를 잡고 약 10 mL 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 워시 버퍼를 피 펫을 사용 하 여 키트에 제공 된로 부드럽게 씻어 또는 10-15 미에 대 한 PBS 가득한 비 커에 전송 슬라이드 바로 PBS 워시 버퍼와 세척 (Coplin jar로 담가) 10 분 반복 모든 나머지 슬라이드와 프로세스에 대 한. 참고: Coplin jar에서 여러 슬라이드를 배치 되었는지 확인 하면 다른 슬라이드, 슬라이드의 셀 쪽에 연결 하지 못한이 유리 슬라이드에 준수는 세포 손상 됩니다.</li>
</ol>3입니다. 형광 공액의 추가
<ol><li>Coplin jar에서 한 번에 하나의 슬라이드를 제거 합니다. 슬라이드에서 초과 PBS 워시 버퍼를 제거 하려면 부드럽게 탭 또는 종이 타월에 슬라이드를 되 리. 각 키트는 FITC 안티 인간 IgG 형광 공액 표시와 함께 제공 됩니다. 각 음에 부드럽게 1 방울 (약 50 µ L) 제공 된 공액 적용 됩니다.</li>
	<li>30 분 동안 닫힌된 얼룩 보육 실에서 슬라이드를 품 어. 참고: Fc 특정 IgG 켤레를 사용 하 여 것이 좋습니다. 어떤 아나 환자의 혈 청에 있는 경우에, 여 켤레를 우물에 셀의 특정 형광이 잠복기 동안에 각 잘 현재 셀에 바인딩합니다. 공액은 빛에 민감합니다. 닫힌된 인큐베이션 챔버 각 우물에 셀의 어원이 반응으로 빛의 간섭을 방지 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>일단 잠복기가 끝나면, 보육 실에서 슬라이드를 제거 합니다. 탭 끝에 슬라이드를 보유 하 고 약 10 mL PBS 워시 버퍼를 피 펫을 사용 하 여 키트 또는 PBS로 채워진 비 커를 제공 부드럽게 씻어. 전송 슬라이드 바로 PBS 워시 버퍼와 세척 (소) Coplin jar로 나머지 모든 슬라이드 과정을 반복 하는 10 분에 대 한. 참고: Coplin jar에서 여러 슬라이드를 배치 되었는지 확인 하면 다른 슬라이드, 슬라이드의 셀 쪽에 연결 하지 못한이 유리 슬라이드에 준수는 세포 손상 됩니다.</li>
	<li>건조 종이 타월에 키트에 제공 되는 coverslips를 배치 합니다. 설치 미디어 키트와 함께 제공 됩니다. coverslip의 아래쪽 가장자리 라인에 설치 미디어의 3-4 방울 사이 적용 합니다.</li>
	<li>워시 버퍼를 포함 하는 Coplin jar에서 한 번에 한 슬라이드 밖으로 가져가 라. 초과 워시 버퍼를 제거 하려면 부드럽게 탭 또는 종이 타월에 슬라이드를 되 리.</li>
	<li>coverslip의 가장자리에 슬라이드의 아래쪽 가장자리를 배치 하 여는 coverslip에 부드럽게 슬라이드를 낮춥니다. 이 흐름에서 슬라이드의 위쪽 가장자리에 더 낮은 가장자리 coverslip에 장착 미디어 존재를 허용 하 고 슬라이드의 각 우물의 읽기를 방해할 수 있는 기포 형성을 최소화 한다. 참고: 최소 압력 커버 슬라이드는 슬라이드에 탑재 하는 사용 되어야 한다. 모든 초과 압력 덮개 미 끄 러 짐의 측면 이동을 발생할 수 있습니다. 이 왜곡 셀 및 결과의 단층 준비에 손상을 일으킬 수 있습니다.</li>
	<li>2-8 ° c.에 어둠 속에서 슬라이드 저장 최대한 빨리 그들은 탑재 또는 48 h 이내 슬라이드를 검사 합니다. 참고: 더 이상 저장 패턴 및 형광 신호 저하 될 수 있습니다.</li>
</ol>4입니다. 긍정적이 고 부정적인 결과의 식별
<ol><li>어두운 방에 있는 FITC 필터 세트를 사용 하 여 형광 현미경 슬라이드를 볼.</li>
	<li>200 X 또는 큰 양성에 대 한 최종 해석 하 고 패턴의 확대에 형광 현미경 특정 밝은 녹색 형광에 대 한 검사 합니다. 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 관찰 합니다. 참고: 긍정적인 컨트롤 (그림 2A, 동종) 핵에 밝은 녹색 형광을 표시 됩니다. 부정적인 통제 없음 특정 녹색 형광 형광 현미경 아래 표시 됩니다.</li>
	<li>각 잘에 대 한 긍정적/부정적 결과 기록 하 고 긍정적인 경우 아나 패턴을 포함 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies Available from: <a target="_blank" href="https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf">https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf</a> (2011)</li><li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANA+screening:+an+old+test+with+new+recommendations.">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li><li>Agmon-Levin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+recommendations+for+the+assessment+of+autoantibodies+to+cellular+antigens+referred+to+as+anti-nuclear+antibodies.">International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.</a> Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).</li><li>Chan, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+of+the+First+International+Consensus+on+Standardized+Nomenclature+of+Antinuclear+Antibody+HEp-2+Cell+Patterns+2014-2015.">Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015.</a> Front Immunol. 6, 412 (2015).</li><li>Malyavantham, K., Suresh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DFS70+pattern+and+impact+on+ANA+screening+using+a+novel+HEp-2+ELITE/DFS70+knockout+substrate.">Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 3 (2017).</li><li>Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+healthy+schoolchildren:+A+follow-up+analysis.">Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis.</a> Autoimmun Rev. , (2017).</li><li>Ayaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cytotoxic+anti-LEDGF+autoantibodies+in+atopic+dermatitis.">Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis.</a> Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).</li><li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+DFS+70+kd/transcription+coactivator+p75+in+atopic+dermatitis+and+other+conditions.">Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions.</a> J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).</li><li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+597+healthy+hospital+workers.">Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immune+response+directed+against+LEDGF+in+patients+with+VKH.">Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH.</a> Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).</li><li>Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+Against+DFS70/LEDGF+Exclusion+Markers+for+Systemic+Autoimmune+Rheumatic+Diseases+(SARD).">Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD).</a> Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).</li><li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+autoantibodies+to+DFS70/LEDGFp75+in+health+and+disease:+integrating+basic+science+with+clinical+understanding.">The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding.</a> Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).</li><li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+chemoluminescence+and+immunoasdorption+tests+for+anti-DFS70+antibodies+avoid+false+positive+results+by+indirect+immunofluorescence.">Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence.</a> Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).</li><li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+the+lens+and+cornea+in+anti-DFS70-positive+subjects.">Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects.</a> Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).</li><li>Daniels, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+autoantibodies+in+prostate+cancer:+immunity+to+LEDGF/p75,+a+survival+protein+highly+expressed+in+prostate+tumors+and+cleaved+during+apoptosis.">Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis.</a> Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).</li><li>Dellavance, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+spectrum+of+antinuclear+antibodies+associated+with+the+nuclear+dense+fine+speckled+immunofluorescence+pattern.">The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern.</a> J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).</li><li>Gundin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+anti-DFS70+antibodies+in+patients+with+ANA-associated+autoimmune+rheumatic+diseases+suspicion+is+cost-effective.">Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective.</a> Auto Immun Highlights. 7 (1), 10 (2016).</li><li>Kang, S. Y., Lee, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+significance+of+dense+fine+speckled+pattern+in+anti-nuclear+antibody+test+using+indirect+immunofluorescence+method.">Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method.</a> Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).</li><li>Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+anti-DFS70+antibody+and+specific+autoantibody+test+algorithms+to+patients+with+the+dense+fine+speckled+pattern+on+HEp-2+cells.">Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells.</a> Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).</li><li>Mariz, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+on+the+antinuclear+antibody-HEp-2+test+is+a+critical+parameter+for+discriminating+antinuclear+antibody-positive+healthy+individuals+and+patients+with+autoimmune+rheumatic+diseases.">Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).</li><li>Marlet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombophilia+Associated+with+Anti-DFS70+Autoantibodies.">Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies.</a> PLoS One. 10 (9), e0138671 (2015).</li><li>Mercado, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoantibodies+to+DSF70/LEDGFp75+in+Mexican+Hispanics+using+multiple+complementary+assay+platforms.">Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 1 (2017).</li><li>Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concomitance+of+disease+marker+autoantibodies+in+anti-DFS70/LEDGF+autoantibody-positive+patients+with+autoimmune+rheumatic+disease.">High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease.</a> Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).</li><li>Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+prevalence+of+anti-DFS70/LEDGF+antibodies+in+patients+with+dermatomyositis+and+other+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases.">Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases.</a> J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).</li><li>Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+anti-DFS70+antibodies+is+needed+in+routine+clinical+samples+with+DFS+staining+pattern.">Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern.</a> Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).</li><li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+DFS70/LEDGF+are+increased+in+alopecia+areata+patients.">Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients.</a> J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).</li><li>Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+and+frequency+of+cytoplasmic+and+nuclear+dense+fine+speckled+patterns+observed+in+ANA-HEp-2.">Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2.</a> Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).</li><li>Schmeling, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+Dense+Fine+Speckles+in+Pediatric+Diseases+and+Controls.">Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls.</a> J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).</li><li>Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies:+a+contemporary+nomenclature+using+HEp-2+cells.">Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells.</a> J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).</li><li>Mahler, M., Fritzler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clinical+Significance+of+the+Dense+Fine+Speckled+Immunofluorescence+Pattern+on+HEp-2+Cells+for+the+Diagnosis+of+Systemic+Autoimmune+Diseases.">The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases.</a> Clin Dev Immunol. 2012, 494356 (2012).</li><li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70/LEDGF+Antibodies+Are+More+Prevalent+in+Healthy+Individuals+Compared+to+Patients+with+Systemic+Autoimmune+Rheumatic+Diseases.">Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases.</a> J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).</li><li>Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clinical+Relevance+of+Anti-DFS70+Autoantibodies.">The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies.</a> Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).</li><li>Miyara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Phenotypes+of+Patients+with+Anti-DFS70/LEDGF+Antibodies+in+a+Routine+ANA+Referral+Cohort.">Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort.</a> Clin Dev Immunol. 2013, 703759 (2013).</li><li>Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+the+dense+fine+speckled/lens+epithelium-derived+growth+factor/p75+pattern+on+HEP-2+cells:+not+an+easy+task!+Comment+on+the+article+by+Mariz+et+al.">Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al.</a> Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).</li></ol>

Kishore Malyavantham 및 Lakshmanan Suresh 저자는 삼위일체 생명 공학, 미국의 직원이 있습니다.

신경 핵 및 세포질 항 원에 있습니다 높은 조직 자기 면역 질병. IIF 형 간염-2 조직 자기 면역 질병2,,34 에 대 한 매우 민감한이 고 비용 효율적인 심사 방법으로 널리 간주 아니 단일 분석 결과 제공 하지만 최상의 가능한 감도 특이성, . 50 그 해 동안 IIF 프로토콜의 보급에도 불구 하 고 IIF 분석 결과의 정확도 매우 기술자, 프로토콜의 각 단계와 잘 관리를 사용 하 여 결과의 정확한 해석의 주의 실행의 기술에 의존 형광으로 현미경 조직 자기 면역 질병의 진단 하지 형 간염-2 IIF 같은 단일 혈 청 학적인 시험의 결과에 따라 한다.
높은 품질을 사용 하 여 시 약의 재구성 (소 주/이온), 표준화 된 키트 구성 요소 (슬라이드 형 간염-2 셀 monolayers와 샘플 희석제, 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, 미리 희석된 최적화 FITC-공액, 장착 매체)의 사용 결과에 긍정적인 영향을 미칠. 웰 스에 컨트롤 추가 예제를 건너뛰는 허위 부정적인 해석 격려 수 있습니다. 언제 든 지 슬라이드의 건조 후 샘플 또는 컨트롤의 추가 artifactual 거짓 긍정적인 반응 그리고/또한 부적당 한 패턴에 발생할 수 있습니다. 슬라이드에 너무 많은 워시 버퍼 왼쪽 또는 아티팩트가 발생할 수 있습니다 설치 매체의 분배 이전 슬라이드 우물의 건조. 매체를 장착 하거나 배치는 coverslip 이전 슬라이드 표면에 거품 생성의 부족 한 수량을 추가 하는 것은 흐리거나 초점 현미경 관찰 될 때 보이는 반응 귀 착될 수 있다. 탑재 된 슬라이드 2-8 ° C에 저장 하 고 false 네거티브 또는 artifactual 결과 최소화 하기 위해 시간 권장된 창 내에서 분석 해야 합니다.
적절 한 LED/Hg/크 세 논 빛 소스와 깨끗 한 광학 부품이 손상 되지 여기 및 방출 필터 등을 잘 피 형광 현미경을 사용 하 여 하는 것이 정확한 IIF 결과 얻기 위해 중요 합니다. 최종 사용자 차별 긍정/부정적 반응 농도 및 패턴의 해석에 대 한 훈련은 중요 합니다. 형 간염 2 IIF 분석 실험 절차, 현미경 구성 및 최종 사용자 교육 또는 기술 표준화의 부족으로 취약 하다. 합의 명명법과 대표 패턴 및 다양 한 제조 업체를 사용 하 여 인수 하는 이미지의 예 수에 의해 만들어집니다 ICAP (< www.ANApatterns.org>) 교육 목적4. 형 간염-2 셀 패턴 분류 트리 ICAP에 의해 제공 하는 다양 한 핵, 세포질, mitotic 패턴에 대 한 다양 한 패턴 연습을 쌓지 않은 눈4와 비슷한 보일 수 있습니다 사이의 미묘한 차이 배울 수 귀중 한 자원 이다. 면역 상태와 뚜렷한 협회 부족 DFS70 도전 패턴의 기본 예의 하나 이며 이전 섹션에서 설명한 대로이 패턴은 매우 건강 한 인구5에서 유행 이다.
연구에 따라 안티-DFS70 신경의 보급 달라 건강 한 동료 애 나 심사 인구, 그리고 아나 긍정적인 개인 조직의 자가 면역 질환9,16,20의 증거와 ,,3031. DFS70 신경 절연 뿐만 아니라 다른 질병 관련 된 아나 패턴 발생 보고 되었습니다. 절연 또는 monospecific DFS70 패턴 건강 한 컨트롤의 2-22%에서 하지만 자가 면역 류 마티스 질환32케이스의 1% 미만에서 보고 됩니다. 이러한 추세에 따라, DFS70 모노-긍정적인 패턴 ICAP 위원회3,,3132에 의해 면역 류 마티스 질환에서 제외 하는 조건으로 제안 했다. Autoantibody 테스트 명명법의 조화 및 애 나 보고 하는 동안 DFS70 양성을 보고 권장 형 간염 2 IIF 결과의 해석에 설립 ICAP 위원회 검사 결과4.
배제 DFS70 모노-양성 기반 조직 자기 면역 질병, 이전 현재 심사 및 확인 방법 (특히 DFS70에 대 한 그 특정)의 상태를 검토 생명 이다. DFS70 형 간염 2 IIF 및 단단한 단계의 확실 한 분석 즉 ELISA 양성, CLIA, 및 선 immunoassay/점 오 점 방법 사이 계약) 다양 한 연구13,,2225,33 사이 널리 다양 . 이 불일치에 기여 하는 매개 변수 왔다 IIF 해석 및 확실 한 분석 결과 이전5,13,34을 논의 했다. 안티-DFS70 항 체 확인에 대 한 최근 제안 된 immunoadsorption 접근 (DFS70)에 대 한 일부 현재 단단한 단계의 분석 실험의 결함을 해결 하지만 의심된 샘플에 IIF 절차에서 추가 단계를 수행 하는 연구소는 결과13보고 비용과 처리 시간을 증가 시킵니다. 형 간염-2 엘리트/DFS70 코 셀 루틴 아나 심사에 대 한 사용 하는 경우이 추가 단계가 필요 하지 않습니다. 이 전체 비용 고 또한 처리 시간에 영향을 주지 않습니다 DFS70 패턴은 초기 심사에서 분별27단계입니다. 기존의 형 간염 2 IIF 메서드를 사용 하 여 추가 단점은 공동 발생 다른 아나 패턴 심사 단계에서 DFS70 패턴을 구별할 수는 것입니다. 그러나,이 불리는 형 간염-2 엘리트/DFS70 코 셀27의 사용에 의해 극복 된다.
기존의 형 간염-2와 새로운 조작된 형 간염-2 (형 간염-2 엘리트/DFS70 코) 아나 긍정적인 컨트롤 사용 및 그들의 조합 모노-긍정적인 DFS70 제어와의 비교 평가 동시에 새로운 기판의 능력을의 유틸리티 설명 아나 스 화면 하 고 DFS70 패턴 (그림 1)를 확인 합니다. 새로운 기판에 대 한 IIF 프로토콜은 기존의 형 간염 2 IIF 메서드를 동일 합니다. 모든 질병에 관련 된 아나 패턴에 대 한 해석 체계는 DFS70 패턴 (표 1)를 제외 하 고 동일 합니다. 모노-긍정 및 혼합 DFS70 패턴의 해석 상대적으로 쉽게 새로운 메서드를 사용 하 여 고 추가 분석 (그림 1B)를 보증 하지 않습니다. 임상 실험실에서이 새로운 방법의 구현 DFS70 패턴의 해석 연관 도전을 간소화 하 고 질병 관련 추가 공개 애 나 패턴에 의해 은폐 이전 심사 아나의 전반적인 정확도 향상 DFS70 (혼합 패턴)입니다.

아나 스 면역 중재 조직 결합 조직 질병1의 특징입니다. 여러 가지 방법은 심사와 아나 스의 확인에 대 한 고용 됩니다. IIF 기술 형 간염 2 기판 남아를 사용 하 여 가장 널리 사용 하 고 자주 아나 스1,2심사 방법 추천. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 효소 immunoassay (EIA), 화학 immunoassay (CLIA), 구슬 기반 다중 분석 등 단단한 단계의 진단 분석 방법론의 발전에도 불구 하 고 형 간염-2 IIF는 가장 널리 상영 진단 유용성 및 비용 효율성1,2,3방법. 순화 된 네이티브의 제한 된 집합에 의존 하는 위에서 언급 한 분석 결과 기술 또는 재조합 autoantigens 형 간염-2 셀 단층 준비 유리 슬라이드 우물에 그들의 자연적인 형태로 autoantigens의 광범위 한 배열을 제공 하는 반면에 분산 핵과 세포질을 환자 세라 또는 결과 다양 한 다양 한 면역 상태와 관련 된 패턴에에서 긍정적인 컨트롤에서 신경으로 반응 합니다. 이러한 패턴은 세포에 항 원의 위치에 따라 핵, 세포질와 mitotic 패턴으로 분류 됩니다. 각 패턴 및 관련된 항 원/항 질병 상태는 잘 특징된4. IIF 방법에 환자 및 제어 세라 autoantigens 그들의 자연적인 구성에서의 군중을 유지 하기 위해 적절 한 고정 형 간염-2 세포의 단층 문화를 제공 하는 유리 슬라이드 우물에 알을 품는. 환자 혈 청 또는 긍정적인 컨트롤에 신경 외피 동안 형 간염-2 셀 기판 (유리 슬라이드 잘)에 제시한 autoantigens에 바인딩할 수 있습니다. 게시물 인큐베이션, 언바운드 항 체는 씻어 하 고 바운드 항 체 IgG 클래스의 fluorescein/fluorescein isothiocyanate (FITC) 활용 안티 인간 IgG 시 약 검색 됩니다. 언바운드 보고 공액 씻 고 유리 coverslips 반응을 유지 하 고 형광 현미경 관찰을 용이 하 게 장착 매체를 사용 하 여 슬라이드 위에 거치 된다. 반응을 사용 하는 기자에 의하여 구성 된 적절 한 자극 방출 필터 조합을 갖춘 형광 현미경 관찰 된다 (FITC 기자에 대 한 진단 현미경 일반적으로 사용 하 여 필터 467의 구동 범위 -498 nm 및 513-556 nm의 방출 범위). 애 나의 존재는 셀에 특정 구조의 밝은 녹색 형광에 의해 증명 됩니다. 자동된 분석 결과 플랫폼, 달리 IIF 방법론은 세라와는 중요 한 사용자 전문성5,6얼룩 패턴의 시각적 긍정적인 결정을 diluting 직렬의 힘 드는 과정에 의존 합니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 IIF 형 간염-2로 가장 널리 사용 되 있고 패턴 (ICAP) 위원회, 아나에 국제 합의 의해 패턴 해석 및 명명법으로 표준화 노력으로 인해 아나 스의 심사 방법 권장 IIF 슬라이드 처리, 그리고 결과 해석3에 대 한 자동화 솔루션의 증가 가용성.
Psip1 유전자 제품 (LEDGF/p75/DFS70 라고도 함)을 대상으로 하는 자가 형 간염 2 IIF 메서드에서 검색 패턴의 무리 중, 최근 몇 년 동안 몇 가지 이유로4,5에에서 상당한 관심을 얻고 있다 ,6,,78,,910. DFS70 신경 건강 한 컨트롤, 높은 titers에 존재 하 고 지금까지 연구 DFS70 신경7,,89 의 존재에 대 한 뚜렷한 임상 협회를 설명 하기 위해 실패 10,11,,1213. 다양 한 질병 상태와 건강 한 동료 연구6,,89,10,14 사이 널리 다양 한 DFS70 신경에 대 한 긍정적인 결과 보고 속도 ,15,16,17,18,19,20,,2122,23 ,,2425,26,,2728. Monospecific DFS70 패턴 잘 혼합된 균질 얼룩 패턴의 해석 하지만 균질 또는 얼룩 덜 룩 한 패턴에서 차별화 된 그리고 다른 아나 스 공동 발생 방지-DFS70 항 체도 전문가 독자에 대 한 도전 이다. 심사 방법 및 DFS70 특정 단단한 단계의 분석 IIF의 현재 세대 monospecific DFS70 반응 혼합된 패턴 (그림 1A, 알고리즘의 노란색 음영된 지역)에서 분화 할 수 있다. 균질, 얼룩 덜 룩 한, DFS70 패턴 또는 혼합된 패턴, 또는 반대로, 오해는 환자 치료에 심각한 영향을 있을 수 있습니다. 현재 일반적으로 사용 되는 프로토콜은 다음과 같습니다: 아나 스 질병 관련에 대 한 단단한 단계의 확실 한 테스트의 수를 사용 하는 임상 실험실 / DFS70/LEDGF 때 고밀도 미세 얼룩 (AC-2) 패턴에 대 한 immunoadsorption 메서드 (그림 의심 되 1A)4,5.
이 프로토콜의 목표는 소설의 유틸리티 형 간염 2 IIF 기판 설계를 설명 하는 (형 간염-2 엘리트/DFS70 녹아웃 (KO), 것 이다 라고도 형 간염-2 엘리트)를 심사 하면서 동시에 아나 기존의 형 간염-2의 모든 장점을 유지 monospecific에 혼합된 아나 긍정적인 경우 (그림 1B, 알고리즘의 노란색 음영된 지역)5높은 자신감과 DFS70 패턴을 구별. 형 간염-2 엘리트 기판 수정 되지 않은 기존의 형 간염-2 셀과 1:9 비율5항 원 LEDGF/p75/DFS70 없는 조작된 셀의 대략적인 혼합물으로 구성 된다. 형 간염-2 엘리트의 IIF 절차는 기존의 형 간염 2 메서드를 동일 합니다. 형 간염-2 엘리트 기판의 독특한 구성 뿐만 아니라 기존의 HEp2의 모든 장점을 유지 하지만 초기 심사 또는 샘플 (그림 1B의 테스트에서 DFS70 패턴에서 균질, 얼룩 덜 룩 한, 그리고 혼합 반응 패턴을 분화 할 수 있다 )5. 환자 혈 청 형 간염 2 IIF 기판으로 슬라이드에 반응 하는 희석된 1:40 상영 희석 또는 개별 실험실 조건에 의하여 해야 한다. 1시 40분 또는 더 높은 titer에 특정 한 반응은 긍정적으로 간주 됩니다.
이 연구, 균질, 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 세포질 망상/의학 협회, 및 심사 (부정적인 제어 및 키트에서 제공 하는 긍정적인 아나 컨트롤)을 기준으로 중간 긍정적인 신호를 생성 하는 DFS70 패턴에 대 한 긍정적인 세라 1시 40분의 희석 형 간염 2 기판에 모노 및 혼합 패턴 시뮬레이션 선정 되었다 (기존의 고 형 간염-2 엘리트). 1:40 1시 40분으로 희석된 DFS70 긍정적인 세라 혼합 희석 개별 질병 관련 된 아나의 패턴 컨트롤 (균질, 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 또는 세포질 망상-AMA) 다양 한 비율 (제어: DFS70 100:0, 80:20, 50: 50, 과, 그리고 0:100) 전통적인 평가 형 간염-2 엘리트 기판 다음 아래에 설명 된 표준 IIF 절차.

<table><tbody><tr><td>HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240</td><td></td></tr><tr><td>ANA positive control</td><td>Trinity Biotech&amp;nbsp;</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>DFS70 antibody positive control</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240</td><td></td></tr><tr><td>Negative control</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan&#039;s blue counterstain</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Buffer diluent for serum</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips&amp;nbsp;</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials used in the study but not provided by the kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diagnostic fluorescent microscope</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td></td><td>Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1</td></tr><tr><td>Incubation chamber</td><td>Trinity Biotech</td><td></td><td>provided for customers (no catalog #)</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>n/a</td><td></td><td>General labware</td></tr><tr><td>Paper towels</td><td>n/a</td><td></td><td>General lab supplies</td></tr><tr><td>distilled/deionized water</td><td>n/a</td><td></td><td>General lab supplies</td></tr></tbody></table>

simultaneous distinction of monospecific and mixed dfs70 patterns during ana screening with a novel hep-2 elite/dfs70 knockout substrate

조직 자기 면역 결합 조직 무질서는 반핵 항 체 (애 나) 순환 특징. 아나 심사에 사용할 수 있는 여러 기술이 있다, 간접 면역 형광 검사 (IIF) 인간 상피 세포-2 (형 간염-2) 기판을 사용 하 여 우수한 감도 때문에 기본 및 권장 방법 남아 있다. 형 간염 2 기판 다양 한 핵과 세포의 세포질을 통해 배포 하는 다양 한 단백질 및 핵 산 autoantigens autoantibody 바인딩에서 발생 하는 패턴을 검색할 수 있습니다. Monospecific 형 간염 2 기판에 긍정적인 반응에서 또한 인 혼합된 패턴의 큰 다양성 해석 및 보고의 정확도 복잡 하 게. 최대한 주의 최근에 받은 한 특정 예제에서는 밀도 괜 찮 얼룩 덜 룩 한 70 (DFS70) 패턴입니다 렌즈 파생 하는 상피 성장 인자 (LEDGF) 이라고 불리는 단백질에 특히 묶는 신경에서 유래. 명확한 연관 특정 조직의 자가 면역 질환 및 건강 한 인구에 있는 높은 보급의 중요 한 DFS70 패턴의 정확한 해석을 만들었습니다. 기존의 형 간염-2 기판을 사용 하 여 질병 관련 된 패턴에서 DFS70 패턴의 정확한 구별은 도전 이다. 또한, 균질, 얼룩 덜 룩 한, 및 혼합 균질 얼룩 패턴 등 질병 관련 패턴 함께 DFS70 패턴의 빈번한 起 IIF 해석 복잡 하 게. 이 백서의 목적은 소설의 유틸리티 동시에 둘 다에 높은 신뢰와 DFS70 패턴을 구별 하는 기능을 제공 하면서 기존의 형 간염 2 기판의 모든 장점을 유지 하는 형 간염 2 IIF 기판 설계를 설명 하는 monospecific 그리고 혼합된 아나 긍정적인 예입니다. 새로운 기판 수 정체 질환 관련 아나 패턴 이전 DFS70 패턴에 의해 은폐 하 더 이다.

간염-2 엘리트/DFS70 코 기판 고전적인 아나 패턴을 유지 하 고 DFS70 패턴의 명확한 구별을 용이 하 게:
전통과 조작 셀 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판에는 동일, LEDGF/p75 제외한 모든 autoantigens 보존 합니다. 키트에 의해 제공 하는 부정적인 제어 기준 형광 신호를 설정 합니다. 형 간염-2 엘리트에 균질, 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 그리고 미토 콘 드 리아 패턴에 대 한 긍정적인 컨트롤 기존의 형 간염 2 IIF 기판 (그림 2A)에 예상된 패턴을 동일한 패턴을 생성합니다. 이러한 참조 패턴 각 패턴의 항 원 및 질병 협회 함께 상세히에서 설명 되었습니다 이전4,29. 표 1에 그림 2A 에서 관찰 된 패턴에 대 한 간략 한 설명이 제공 됩니다.
형 간염-2 엘리트에 DFS70 패턴:
각 셀의 약 10% 잘 보여 고밀도 미세 얼룩 덜 룩 한 패턴 (ICAP 명명법을 할당: AC-2) 그 interphase 핵에 관찰 될 수 있다와 mitotic 핵 (그림 2B)에 본은 chromatin 관련 얼룩. 기존의 형 간염 2 기판에 모든 셀이이 패턴 DFS70 긍정적인 샘플 반응 때 할 것 이다. 형 간염-2 셀의 나머지 ~ 90% 기 절 LEDGF 항 원 인코딩 psip1 유전자 있고 따라서 신호 또는 패턴 monospecific DFS70 긍정적인 세럼 (그림 2B)와 반응 하는 때를 생성 하지 않습니다. 형 간염-2 세포의 10%에 DFS70 패턴 및 셀 현재 추가 패턴 (예를 들어, 잘 얼룩 덜 룩 한 또는 nucleolar)의 나머지 부분에 해당 하는 밝은 형광 있다면 혼합된 패턴의 존재를 나타냅니다. 이러한 패턴의 가까이 시험 DFS70 패턴 이외에 존재 하는 모든 autoantibody 특이성을 확인 필수적 이다. 형 간염-2 엘리트 기판, 샘플으로 만든 세라의 패널의 기능을 보여 주기 위해 DFS70와 아나의 다양 한 농도 세라를 제어 하 고 기존에 테스트 및 형 간염-2 엘리트 기판 표준 IIF를 사용 하 여 프로토콜 (그림 3 , 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7).
DFS70 Monospecific와 기존의 고 형 간염-2 엘리트 기판에 혼합된 반응의 해석:
각 특정 질병 관련 된 아나 패턴 (그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7), monospecific 아나 왼쪽에 대부분 열 패턴 및 monospecific DFS70 맨 오른쪽에 패턴 관찰할 수 있습니다. 중간에 3 열 다양 한 질병 관련의 비율 및 DFS70 패턴 긍정적인 컨트롤을 나타냅니다. 결과 혼합된 패턴은 (그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7, 맨 위 행) 기존 형 간염 2 기판에 분별을 도전. 그러나, 대부분의 예제를 소설 형 간염-2 엘리트 기판 셀 수정 되지 않은 및 설계 강도에 차이 별개 (때 밝은 덜 밝은 셀의 비율을 뿐만 아니라 DFS70 신경의 존재를 확인 1:9) 하지만 또한 보조 아나 패턴을 보여준다. 균질 DFS70 또는 얼룩-DFS70 혼합 반응, 자신 있게 다양 한 추가 분석 (그림 1A)를 실행 하는 실험실에 이르게 올바른 패턴을 예측할 수는. Centromere-DFS70 및 nucleolar DFS70 혼합 반응, DFS70 양성은 매우 도전적인 의심 (그림 5, 그림 6). Nucleolar 및 세포질 망상/의학 반응, DFS70 패턴은 지배적인 세라 비율 50%에 도달할 때까지. 모든 예에서 형 간염-2 엘리트 기판 DFS70 패턴을 제시할 수 있습니다 고 강도의 넓은 범위 기본 보조 패턴 레벨 따라서 더 정확한 아나 해석을 용이 하 게 한다.
에 밀접 하 게 혼합된 패턴, 아나 고 DFS70 긍정적인 컨트롤 했다 확대 (그림 8) 모두 기존의 고 형 간염-2 엘리트 기판의 다양 한 50: 50 조합에 대 한 결과 관찰 합니다. 그것은 interphase와 mitotic 얼룩 해석 및 보고 된 패턴의 정확도 향상을 형 간염 2 기판에 DFS70를 포함 하 여 모든 아나 패턴에 대 한 관찰을 권장 합니다. 그러나, 혼합 패턴, 세포 핵을 나누어 제시 차동 패턴 정확한 해석을 용이 하 게 하기에 충분 하지 않을 수 있습니다. 빨간색 화살표 (그림 8) 설계와 기존의 셀에 mitotic 핵을 나타냅니다. 그것은 혼합 반응 셀 분할에 준수 하지 않는 DFS70 질병 관련 된 해석에 대 한 규칙의 설립된 세트와 함께 애 나 패턴을 관찰할 수 있습니다. 노란색과 파란색 화살표 수정 되지 않은 (DFS70 KO) 형 간염-2 설계 된 세포 핵, 각각 나타냅니다. 모든 조합 (그림 8), 분명 강도 차이가 수정 되지 않은 세포 핵 얼룩 (~ 10%)와 조작된 세포 핵 (~ 90%) 패턴 같은 현미경 시야에서 관찰, 동시 상영을 가능 하 게 하 고 DFS70 패턴의 확인입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig1.jpg"> 그림 1: 아나 기존의 형 간염-2 고 형 간염-2 엘리트/DFS70 코 IIF 메서드를 사용 하 여 알고리즘을 심사. (A) 회로도 unravels 심사 단계 (노란색 음영된 지역)에서 monospecific 및 혼합된 DFS70 긍정적인 패턴 식별에서 기존의 형 간염 2 IIF의 결핍 및 질병 관련 보조 아나 패턴을 배제 하지 못하는 수 있습니다 DFS70 패턴에 의해 감춰 될. 또한, 현재 세대의 DFS70 특정 단단한 단계의 확실 한 분석은 아나 스에 대 한 추가 확인 테스트에 이르게 monospecific DFS70 양성 확인 수 없습니다. (B) 회로도 아나 스, monospecific 및 혼합된 DFS70 반응의 동시 구별의 심사에 대 한 형 간염-2 엘리트의 기능을 보여 하 고 단단한 단계 DFS70에 대 한 필요성을 없애 확인 분석 실험. 크게 형 간염-2 엘리트를 사용 하 여 알고리즘 아나 심사 간소화 되 고 확인 분석 실험의 필요한 수를 감소 시킨다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig2.jpg"> 그림 2: 클래식 애 나 및 DFS70 패턴 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판에. (A) 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판 고전적인 아나 패턴 유지. 고전적인 균질 반응 및 DFS70 긍정적인 반응 키트에서 제공 하는 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 생산 되었다. 다른 반응 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 그리고 세포질 망상/의학 반응5에 대 한 이전 설립된 긍정적인 제어 세라를 사용 하 여 제작 했다. (B) 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판 설계와 기존의 셀, DFS70 패턴의 쉬운 구별을 용이 하 게 제공 합니다. 회로도 결과 DFS70 monospecific 반응 패턴 interphase에 얼룩이 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 셀에 대 한 세포 핵을 나누어 보여 줍니다. 설계 형 간염-2 세포는 일반적으로 기존의 형 간염 2 기판에 DFS70 autoantibody 반응에 의해 은폐 보조 패턴의 동시 탐지를 가능 하 게 LEDGF/p75/DFS70 항 원 없는. 화살표 (노란색) mitotic 세포 핵의 예를 나타냅니다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig3.jpg"> 그림 3: DFS70와 조합에 균질 세라. DFS70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 균질 패턴 제어와 결합 하 고 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig4.jpg"> 그림 4: DFS70 세라 조합에 얼룩 및. DFS70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 얼룩 덜 룩 한 패턴 제어와 결합 하 고 전통과 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig5.jpg"> 그림 5: 조합에서 DFS70 및 centromere 세라. DFS 70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 centromere 패턴 제어와 결합 하 고 전통과 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig6.jpg"> 그림 6: DFS70와 함께에서 nucleolar 세라. DFS 70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 nucleolar 패턴 제어와 결합 하 고 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig7.jpg"> 그림 7: DFS70와 조합에 세포질 망상/의학 세라. DFS70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 미토 콘 드 리아 패턴 제어와 결합 하 고 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig8.jpg"> 그림 8: 혼합 패턴 (50: 50 비율) 기존에 생산 고 형 간염-2 엘리트 기판. 두 기판 사이의 차이 계시 했다. 빨간색 화살표는 두 기판 설계와 기존의 셀에 mitotic 핵을 나타냅니다. 이러한 조합에 대 한 기존의 형 간염-2 기질에 세포 핵을 나누어 제시 차동 패턴 혼합된 패턴의 정확한 해석에 대 한 충분 하지 않습니다. 세포 분열에 혼합된 DFS70 반응 수 교란 질병 관련 된 해석에 대 한 규칙의 설립된 세트 애 나 패턴을 관찰할 수 있습니다. 노란색과 파란색 화살표 수정 되지 않은 (DFS70 KO) 형 간염-2 설계 된 세포 핵, 각각 나타냅니다. 모든 조합에 대 한 얻은 결과 설계 기판에 테스트: 분명 강도 차이에 속하는 interphase 핵 패턴 수정 되지 않은 셀 (~ 10%)와 조작된 셀 (~ 90%)은 관찰, 활성화 동시 검색 및 DFS70 패턴의 확인 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>아나 패턴</td>
			<td colspan="2">설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>균질</td>
			<td colspan="2">전체 핵 fluoresces 확산 얼룩 패턴으로 균등 하 게.</td>
		</tr>
<tr>
<td>얼룩</td>
			<td colspan="2">이산, 얼룩의 벌금 굵고 핵에 걸쳐 형광.  미세 얼룩 덜 룩 한 하 고 거친 얼룩 덜 룩 한 패턴 설명 되었습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nucleolar</td>
			<td colspan="2">nucleoli 핵 내의 여러 고체 또는 얼룩 덜 룩 한 시체로 얼룩. 하위 이전 설명 했습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Centromere</td>
			<td colspan="2">한정 된 수의 큰 얼룩입니다. 반응 항 원 세포 유사 분열을 겪고 있는 압축 된 염색체와 분리.</td>
		</tr>
<tr>
<td>세포질 망상/의학</td>
			<td colspan="2">세포질은 미토 콘 드리 아의 긍정적인 얼룩과 세분화 된 나타납니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">DFS70</td>
			<td colspan="2">•Conventional 형 간염-2 셀: 고밀도 미세 얼룩 덜 룩 한 패턴 mitotic 핵에 볼 얼룩 interphase 핵 chromatin 관련에 관찰.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">•Engineered DFS70 코 셀: 안티-DFS70 항 체 생산 부정적인 얼룩이 지기</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">형 간염-2 엘리트 DFS70 코 / 약 1:9 비율에, 기존의 고 설계 (DFS70 KO) 세포. 기존의 셀 전형적인 DFS70 패턴을 생성 하 고 조작된 셀 DFS70 monospecific/절연의 긍정적인 반응으로 반작용 하는 때 부정적인 패턴을 생성.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 아나 패턴의 설명.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate at JoVE.com

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

DFS70 자가 기존의 형 간염-2 기질을 사용 하는 경우 정확한 해석을 도전 만드는 일반적인 반핵 항 체 질병 관련 된 패턴을 모방. 프로토콜에서는 기존의 형 간염-2 검사 및 monospecific 및 혼합된 아나 긍정적인 경우에 높은 신뢰와 DFS70 패턴을 구별 아나 소설 조작된 형 간염 2 기판의 이점을 설명 합니다.

Monospecific 및 소설 형 간염-2 엘리트/DFS70 녹아웃 기판으로 아나 심사 중 혼합된 DFS70 패턴의 동시 구별

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

simultaneous-distinction-monospecific-mixed-dfs70-patterns-during-ana

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.7K 조회수.  A Trinity Biotech Company. DFS70 자가 기존의 형 간염-2 기질을 사용 하는 경우 정확한 해석을 도전 만드는 일반적인 반핵 항 체 질병 관련 된 패턴을 모방. 프로토콜에서는 기존의 형 간염-2 검사 및 monospecific 및 혼합된 아나 긍정적인 경우에 높은 신뢰와 DFS70 패턴을 구별 아나 소설 조작된 형 간염 2 기판의 이점을 설명 합니다.

비디오: Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

연구

암 연구학

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

유전학

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

생체공학

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

초파리를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물의 식별을 위한 스크리닝 방법

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences that encode rRNAs, composing regions called ribosomal DNA (rDNA) loci. Many organisms' genomes contain more than one rDNA locus distributed across different chromosomes, and rRNA may be transcribed from multiple rDNA loci or only a single locus. Changes in rRNA transcription sources often indicate ribosomal distress. However, the homogeneity of rRNA obstructs distinguishing if rRNA is transcribed from multiple or a single rDNA locus. Here, we describe a method that uses single nucleotide polymorphism-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) to distinguish rRNA transcription between Drosophila melanogaster rDNA loci on the X and Y chromosomes. This method leverages locus-specific rRNA variants to enable easy detection of the source of rRNA transcription with single-cell resolution. This assay can be applied to any Drosophila cell type and may be adapted for use in other systems.

The protocol describes single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) method to distinguish ribosomal RNA transcripts derived from the X or Y chromosome ribosomal DNA locus in Drosophila melanogaster.

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH: Drosophila melanogaster에서 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

생화학

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key element is the quantitative determination of a tumor-specific genetic alteration in relation to a universal sequence using a dual-probe digital PCR assay and the subsequent calculation of the proportion of tumor cells. The assay is carried out on a culture containing tumor cells of an established line and spiked-in non-tumor cells. The mixed culture is treated with a test drug at various concentrations. After the treatment, DNA is prepared directly from the survived adhesive cells in wells of 96-well plates using a simple and inexpensive method, and subjected to a dual-probe digital PCR assay for measuring a tumor-specific genetic alteration and a reference universal sequence. In the present demonstration, a heterozygous deletion of the NF1 gene is used as the tumor-specific genetic alteration and a RPP30 gene as the reference gene. Using the ratio NF1/RPP30, the proportion of tumor cells was calculated. Since the dose-dependent change of the proportion of tumor cells provides an in vitro indication for specificity of the drug, this genetic and cell-based in vitro assay will likely have application potential in drug discovery. Furthermore, for personalized cancer-care, this genetic- and cell-based tool may contribute to optimizing adjuvant chemotherapy by means of testing efficacy and specificity of candidate drugs using primary cultures of individual tumors.

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

The goal of this protocol is to assess specificity of anticancer drugs in vitro using mixed cultures containing both tumor and non-tumor cells.

항암 약의 특이성 평가<em&gt; 체외</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

의학

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

생물학

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although IIF is an excellent screening test in expert hands, the technical difficulties of processing and reading IIF slides &#8211; such as the labor intensive slide processing, manual reading, the need for experienced, trained technologists and the use of dark room &#8211; make the IIF method difficult to fit in the workflow of modern, automated laboratories.
The first and crucial step towards high quality ANA screening is careful slide processing. This procedure is labor intensive, and requires full understanding of the process, as well as attention to details and experience.
Slide reading is performed by fluorescent microscopy in dark rooms, and is done by trained technologists who are familiar with the various patterns, in the context of cell cycle and the morphology of interphase and dividing cells. Provided that IIF is the first line screening tool for SARD, understanding the steps to correctly perform this technique is critical.
Recently, digital imaging systems have been developed for the automated reading of IIF slides. These systems, such as the NOVA View Automated Fluorescent Microscope, are designed to streamline the routine IIF workflow. NOVA View acquires and stores high resolution digital images of the wells, thereby separating image acquisition from interpretation; images are viewed an interpreted on high resolution computer monitors. It stores images for future reference and supports the operator&#8217;s interpretation by providing fluorescent light intensity data on the images. It also preliminarily categorizes results as positive or negative, and provides pattern recognition for positive samples. In summary, it eliminates the need for darkroom, and automates and streamlines the IIF reading/interpretation workflow. Most importantly, it increases consistency between readers and readings. Moreover, with the use of barcoded slides, transcription errors are eliminated by providing sample traceability and positive patient identification. This results in increased patient data integrity and safety.
The overall goal of this video is to demonstrate the IIF procedure, including slide processing, identification of common IIF patterns, and the introduction of new advancements to simplify and harmonize this technique.

Indirect immunofluorescent (IIF) assays have traditionally been used for the detection of antinuclear antibodies (ANA) in human serum. The presence of these antibodies can aid in the diagnosis of systemic autoimmune rheumatic diseases (SARD). This protocol demonstrates how to effectively perform the IIF technique to accurately detect these autoantibodies.

반핵 항체 HEP-2 세포를 사용하여 상영

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...