우리는 그녀의 전문 기술 검토를 위해 IIF 실험과 캐롤 흐너을 수행하기위한 카산드라 브라이언트 감사합니다.

1. 준비 및 기판 선택에게 샘플 <ol><li> 포장에서 시약을 제거하고 각 항목이 실내 온도에 올 수 있습니다. 시약을 준비하고 방향 삽입에 따라 환자의 혈청을 희석. 참고 : NOVA 라이트 슬라이드가 바코드이고 쉽게 실험실 정보 시스템 LIS 함께 자동화 시스템에 통합 될 수있다. 이 절차는 수동 슬라이드 처리를 도시한다; 높은 처리량 실험실은, 그러나, 자동 슬라이드 처리 장비를 선택할 수 있습니다. </li></ol> 컨트롤 및 샘플의 2. 추가 <ol><li> 양성 대조군 및 적절한 슬라이드 우물에 음성 대조군의 1 방울 1 방울을 분사합니다. 나머지 우물에 희석 한 환자의 혈청 피펫 20-25 μL. 한 번에 하나의 슬라이드를 처리합니다. </li><li> 바닥에 젖은 종이 타월로 얼룩 컨테이너에서 슬라이드를 놓습니다. 용기를 덮고 30 분간 슬라이드 (들)을 부화. 참고 : 습한 조건 의지마르지 기판을 방지합니다. 우물의 건조는 인공적인 염색 될 수 있습니다. 이 배양 기간 동안, 환자의 혈청에서 항 핵 항체를 각 웰에 고정 된 세포의 항원에 바인딩합니다. </li><li> 잠복기 후, 세척 버퍼의 부드러운 스트림을 사용하여 혈청을 씻어 낸다. 기판의 손상을 방지 우물 사이의 샘플의 크로스 오버, 각 슬라이드를 방지하기 위해 약간 우물에 직접 스트림을 연출 방지 할 수 있습니다. 초과 세척 버퍼를 누르고 약 5 분 동안 세척 버퍼를 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 놓습니다. </li></ol> 형광 복합체의 3. 추가 <ol><li> 하나 하나는, 세척 완충액에서 슬라이드를 제거하고 부드럽게 과잉 세척 완충액을 제거하기 위해 탭. 각 웰에 (FITC 항 - 인간 IgG 표시) 형광 공액 1 방울을 적용합니다. 가습 용기에 30 분 동안 슬라이드를 품어하고, 염색을 교체해야합니다용기 뚜껑. 참고 : ANA의 테스트를 위해, IgG의 구단 특정 공역의 사용을 권장합니다. 공액 민감한 가볍고, 커버는 습한 환경을 유지 이외에 빛에 대한 노출로부터 슬라이드를 보호 할 것이다. 이 배양 기간 동안 복합체는 세포 항원에 바인딩 한 환자의 항 - 핵 항체에 결합 할 것이다. 이 복합체는 웰에서 형광의 존재 하에서 결과 바인딩. </li><li> 린스 전술 한 바와 같이 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 종이 타월에 커버 슬립을 놓고 커버 슬립의 아래쪽 가장자리에 연속 라인에 설치 매체를 적용 할 수 있습니다. </li><li> 세척 버퍼에서 각 슬라이드를 제거하고 여분의 세척 버퍼를 제거하기 위해 부드럽게 슬라이드를 누릅니다. 커버 슬립의 가장자리에 슬라이드의 하단을 터치합니다. </li><li> 부드럽게 커버 슬립에 장착 매체는 기포 형성없이 슬라이드의 상단에 유입되는 방식으로 커버 슬립 상에 슬라이드를 낮추기. 참고 : 공동, 설치 매체의 최적 량을 사용하여 포함 verslipping은 완벽하게 연습이 필요하는 기술입니다. </li></ol> 긍정 및 부정적인 결과 4. 확인 수동 해석 <ol><li> 보기 어두운 방에있는 형광 현미경으로 슬라이드. 세포의 분포와 형광의 균일 성을 평가하기 위해 20X 또는 25X 목적으로 전체 잘 스캔을 수행 </li><li> 양성과 패턴에 대한 최종 해석을 만들기 위해 40X 목표로 전환합니다. </li><li> 긍정적이고 부정적인 컨트롤 봐. 1 + 4 +에서 반응성의 등급을 매기는 척도를 사용하여 학년 양성. 참고 : 음성 대조군은 완전히 어둡게 표시되지 않을 수도 있습니다,하지만 종종 낮은 수준의 특이 형광을 표시합니다. 양성 대조군은 핵에 밝은 사과 녹색 형광 (그림 1)이 표시됩니다. </li></ol> 자동화 된 해석 참고 : 책상 외에도에서수동 해석, 부하 및 NOVA보기 자동 형광 현미경 또는 기타 자동화 된 디지털 영상 기기로 스캔 슬라이드에 대한; 더 암실이 필요하지 않습니다. 해당 슬라이드 유형을 선택하여 프로젝트를 생성 한 후, 기기는 물론 각 세포의 고해상도 디지털 이미지를 획득하고 저장합니다. 또한, NOVA보기 형광 강도를 측정하고, 양 또는 음으로 결과를 분류하고, 긍정적 인 샘플에 대한 패턴 인식을 제공합니다. 이미지는 NOVA보기 결과의 최종 해석, 수정 및 확인 가능, 고해상도 컴퓨터 모니터에 운영자가 볼 수 있습니다. 보고서는 확인 결과를 생성 할 수있다. 이 결과의 해석에 도움을 것입니다 디지털 현미경 경험 실험실 기술자와 함께 사용되어야한다.

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저자 가브리엘라 Lakos, 카산드라 브라이언트, 캐롤 흐너, 안나 Eslami는 INOVA 진단의 직원입니다.

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the &#8220;gold standard&#8221; for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns. 
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells. 
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

용어 항핵 항체 (ANA)는 DNA, 단백질과 리보 1, 2 등의 세포 핵의 성분과 반응하여자가 항체의 다양성을 설명합니다. HEP-2 세포, 항원의 수백 네이티브 단백질 배열, ANA 1의 검출을위한 이상적인 기판을 제공한다. 인간 혈청에서 ANA의 검출은 결합 조직 질환에 대한 중요한 검사 도구이며, IIF는 ANA 1 테스트를위한 참조 방법이다. 최근 HEP-2 세포에 IIF는 항원 특이적인 면역 및 다중 방법에 약간의 실험실에서 대체되었습니다. 때문에 위음성 결과에 대한 우려와 임상에 대한 투명성의 부족, 류머티스의 미국 대학은 HEP-2 세포를 사용하여 IIF는 ANA 1 심사에 대해 &quot;금 표준&quot;해야한다는 결론을 내렸다 태스크 포스를 형성했다. 때문에 ANA 검사의 주관적인 성격, 간염-2 세포의 품질에결과의 정확하고 자신이보고에 tegral. 유사 분열 세포의 높은 숫자의 존재는, 최적의 세포 형태, 충분한 컨 플루, 관련 항원의 발현이 특히 중요하다. IIF 패턴 인식은 환자의 진단에 도움이되는 중요한 도구 역할을합니다. 다양한 패턴의 의미를 이해하는 것은 임상 및 실험실 직원이 진단을 확인하기위한 적절한 후속 테스트를 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 균질 ANA 패턴 항 dsDNA 또는 염색질 항체의 존재 하에서 발생할 수 있고, 전신 홍반 루푸스 (SLE) 3과 연관 될 수있다. 다른 측면에서, 최근 일반적으로 일상적인 시료의 최대 12 %에서 볼 수있는 소위 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬 (DFS)은, 주로 안티 DFS70 항체와 연관되어 있는지 설명하고있다. 이러한자가 항체는 (다른 질병 특정 ANA없이) 분리에있는 경우는 전신자가 면역 류마티스 질환과 연관되지 않은 &lt;&gt; 4-9 한모금. 안티 DFS70 항체에 대한 이에 확증 시험, 불필요한 반사 테스트를 줄이는 데 도움이 상당한 비용 절감 효과를 제공하고, 환자의 불안을 완화 할 수 있습니다. IIF는자가 항체를 검출하는 제 선 스크리닝 방법임을 감안할 때, 그것은 사용자가 시약 및 티슈 기질의 선택이 결과에 영향을 미칠 수있는 방법을 이해하는 것이 중요하다. IIF 기술은 본질적으로 주관적이기 때문에, 사용되는 시약이 최고 품질의 결과를 제공하는 것이 중요하다. 이 비디오 프로토콜이 목표는 IIF 법, ANA와 연관된 공통 패턴을 수행하기 위해 필요한 정확한 단계를 사용자에게 익숙하고, 실험실 작업 흐름을 간소화하고 결과를 표준화 할 수있는 새로운 발전을 도입하는 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td>
			<td style="width:189px;">INOVA Diagnostics</td>
			<td style="width:135px;">708102</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NOVA View Instrument</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>NV2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation License</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barcode Scanner</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells

ANA 테스트에 류머티스 위치 문의 미국 대학은 ANA 1 선별을위한 황금 표준 방법으로 IIF의 사용을 규정하고있다. IIF는 전문가의 손에 우수한 선별 검사이지만, 처리 및 IIF를 열람하는 기술적 인 어려움은 슬라이드 - 같은 노동 집약적 인 슬라이드 처리, 수동 독서 경험에 대한 필요성, 훈련 기술자 및 어두운 방에서의 사용으로 - IIF 방법을 현대, 자동화 실험실의 워크 플로우에 맞게하기 어렵다. 고품질 ANA 검사 향한 첫 번째와 중요한 단계는주의 슬라이드 처리합니다. 이 절차는 노동 집약적이며, 전체 프로세스의 이해뿐만 아니라, 세부 사항 및 경험에주의가 필요합니다. 슬라이드 판독 어두운 방에서 형광 현미경에 의해 수행되고, 세포주기의 문맥에서, 다양한 패턴에 익숙한 숙련 된 기술자에 의해 수행및 계면과 나누어 세포의 형태. IIF가 제대로이 기술을 수행하는 단계를 이해, SARD의 첫 번째 라인 검사 도구입니다 제공하는 것은 매우 중요합니다. 최근, 디지털 영상 시스템은 IIF 슬라이드의 자동 판독을 위해 개발되었다. 이러한 NOVA보기 자동 형광 현미경으로 이러한 시스템은, 일상 IIF 워크 플로우를 간소화하도록 설계되었습니다. NOVA보기함으로써 해석에서 이미지 수집을 분리, 우물의 고해상도 디지털 이미지를 획득하고 저장; 이미지는 고해상도의 컴퓨터 모니터에 해석을 볼 수 있습니다. 그것은 나중에 참조 할 수 있도록 이미지를 저장하고 이미지에 형광 강도 데이터를 제공하여 운전자의 해석을 지원합니다. 또한 예비 양수 또는 음수로 결과를 분류하고, 긍정적 인 샘플에 대한 패턴 인식을 제공합니다. 요약하면, 그것은 암실에 대한 필요성을 제거하고, 자동화하고 IIF의 준비 상태를 간소화NG / 해석 워크 플로우. 가장 중요한 것은 독자와 수치 사이의 일관성을 증가시킨다. 또한, 바코드 슬라이드의 사용과, 전송 오류는 샘플 추적하고 긍정적 인 환자 식별을 제공하여 제거된다. 이 증가 된 환자 데이터의 무결성과 안전을 초래한다. 이 동영상의 전체적인 목적은 슬라이드 처리, 일반적인 IIF 패턴의 식별, 및이 기술을 단순화하고 조화 새로운 발전의 도입을 포함 IIF 절차를 보여주는 것이다.

HEP-2 세포의 염색 결과를 평가할 때, 다섯 가지 주요 핵 패턴은 가장 일반적으로보고 있습니다 : 균질, 얼룩덜룩 한, 센트로, nucleolar, 핵 점. 이러한 패턴은자가 항체는 핵의 특정 성분에 대한 결합의 결과이다. ANA 테스트는 핵 구조에 따라 다릅니다 만, 세포질 구조에 대한자가 항체와 관련된 세포질 패턴도 관찰 할 수있다. 일부의 경우, 몇개의 항체가 샘플에 존재할 수도 있고, 이미지가 혼합 된 패턴으로 나타날 수있다. 좀더 자주 관찰하고 IIF 방법에 의해 검출 될 수 종종 세포주기의 특정 패턴이있다; 가장 최근에, 특별한 임상 적 의의 소위 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬가 약간 ANA 양성 혈청에 설명되어 있습니다. 균일 한 패턴 균일 한 패턴을 확인하려면, 잘 스캔 및 유사 분열 또는 분할을 식별세포. 유사 분열 세포의 응축 된 염색질 (그림 2, 주황색 화살표는) 종종 균일 한 패턴, 휴식 세포 전시 유니폼, 전체 핵의 확산 형광 (그림 nuclei.In 휴식 세포에 비해 더 뚜렷하다 고체, 균일 한 형광을 나타내는 2, 흰색 화살표). 이 특성 패턴은 종종 항 dsDNA 항체 (10)의 결과입니다. 얼룩덜룩 한 패턴 거친 반점 패턴, 유사 분열 세포가 응축 된 염색체 영역에는 염색 (그림 3, 주황색 화살표)를 표시하지 않습니다. 휴식 세포 핵 전체에 걸쳐 입상 형광을 나타낸다. 핵 반점 거친 또는 벌금으로 정의 할 수 있습니다. 조악한 반점 패턴은 종종 안티 SM 및 안티 RNP (11)의 결과이다. 미세 얼룩덜룩 한 패턴에서 휴식 세포는 일반적으로 균일 한 D에, 핵을 통해 벌금이나 확산 반점을 보여istribution (그림 4, 흰색 화살표). 미세 얼룩덜룩 한 패턴은 종종 반대로 SSAand 방지 SSB (12)의 결과입니다. 조밀 한 미세 얼룩 무늬 그것은 지금 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬 (DFS)은 일상적인 테스트에서 일반적인 것으로 인식하고, 샘플의 많은 12 %에 방지 DFS70자가 항체에 대한 양성한다. 그러나, 격리에있는이자가 항체는 전신자가 면역 류마티스 질환 4 -6와 연관되지 않습니다. 이 항체는 건강한 개인과 SARD 6과 관련이없는 질병 베어링 환자에서 유행이다. 안티 DFS70 항체에 대한 확실한 테스트는 불필요한 반사 테스트를 줄이는 데 도움이 상당한 비용 절감 효과를 제공하고, 환자의 불안을 완화 할 수 있습니다. DFS 패턴을 확인하고 ANA 양성 환자와 의사 모두에게 불안을 일으킬 수 어렵 기 때문에, 그것은 매우 identi 후 확인 시험을 수행하는 것이 좋습니다<html> ANA의 임상 적 의의를 명확히하기 위해 항-DFS70 항체 암시 패턴을 붙였을 것은 5,6 positivty. 세포 핵 (그림 5, 흰색 화살표) 핵에 걸쳐 전시 균일하게 분포 된 미세 얼룩을 쉬고이 패턴에서, 유사 분열 세포 (그림 5, 주황색 화살표), 중기 염색질의 긍정적 인 얼룩덜룩 한 얼룩을 보여줍니다. 센트로 패턴 , 센트로 패턴을 식별하는 우물을 검사하고 유사 분열 또는 분할 세포를 식별합니다. 유사 분열 세포 (그림 6, 주황색 화살표)에서 이산 얼룩 밀접 종종 &quot;중기 바&quot;로 설명하는 것에 관련된다. 센트로 패턴에서 휴식 세포 (그림 6, 흰색 화살표)은 핵에 걸쳐 분산 약 40 ~ 60 이산 얼룩을 보여줍니다. 센트로 패턴 안티 CENP의 결과, B는 C 13 항체. 단계 &quot;&gt; Nucleolar 패턴 다른 nucleolear 패턴이 염색체 지역의 긍정적 인 염색을 표시하는 동안 일부 nucleolar 패턴, 유사 분열 세포의 확산 세포질 염색 (그림 7, 오렌지 화살표)과 음의 염색체 영역과 연결되어 있습니다. nucleolar 패턴은 약한 얼룩덜룩 또는 핵질의 균일 한 염색과 함께, 핵소체의 동종 또는 얼룩덜룩 염색 (그림 7, 흰색 화살표)와 연결되어 있습니다. 이러한 패턴이 반대로 RNA 중합 효소 III와 관련된, 안티 fibrillarin, anti-Th/To 및 anti-PM/Scl는 (14, 15)을 항체. 핵 도트 패턴 핵 도트 패턴은 음의 중기 유사 분열 세포 (그림 8, 주황색 화살표)로 및 휴식 세포 핵에있는 몇몇 개별 얼룩 (그림 8, 흰색 화살표)와 연결되어 있습니다. 이 특성 패턴은 종종 SP-100, PML, 또는 P80 콜린자가 항체의 결과입니다. 이 항체는 같다<html> 원발성 담즙 성 간경변과자가 면역 간염 (16) sociated. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . 그림 1 음성 대조군 (왼쪽) : 세포가 아닌 특정 형광 낮은 수준,하지만 특정 핵 염색을 표시 긍정적 인 제어 (오른쪽). 세포는 애플 그린 핵 형광을 표시합니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 동종 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow는) 우수 형광을 보여줍니다. 휴식 세포도, 확산 염색 (whitearrow)를 보여줍니다. &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; 그림 3. 거친 얼룩덜룩 한 무늬입니다. 유사 분열 세포 (주황색 화살표) 음의 얼룩을 보여줍니다. 휴식 세포는 별개의 얼룩덜룩 한 얼룩 (흰색 화살표)를 보여줍니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4. 미세 얼룩덜룩 한 무늬입니다. 유사 분열 세포 (주황색 화살표) 음의 얼룩을 보여줍니다. 휴식 세포는 별개의 미세한 반점이 얼룩 (흰색 화살표)를 보여줍니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> 그림 5. 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬입니다. 유사 분열 세포 (주황색 화살표) 미세 과립 고체 염색을 보여줍니다. 휴식 세포 (whitearrow) 아주 좋은, 확산 얼룩덜룩 한 얼룩을 보여줍니다. 그림 6. Centromere에 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow) 쇼 유니폼, 별도의 얼룩 무늬가있다. 세포 (whitearrow)을 휴식하는 세포 핵 당 40 ~ 60 이산 얼룩을 보여줍니다. <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> 그림 7. Nucleolar 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow는) 세부 염색의 큰 클러스터를 나타납니다. 핵소체의 휴식 세포 nucleishows 형광 (whitearrow). <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> 그림 8. 원자력 도트 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow)는 부정적인 나타납니다. 휴식 세포가 거의 없음을 보여 discr핵 (whitearrow)의 ETE 얼룩은. 또한, nucelar 도트 패턴은 미토콘드리아 항원 (빨간색 화살표)에 대한자가 항체와 관련된 세포질 염색과 공존 할 수 있습니다.

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Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

간접 면역 형광 (IIF) 분석은 전통적으로 인간 혈청에 항핵 항체 (ANA)의 검출에 사용되어왔다. 이 항체의 존재는 전신자가 면역 류마티스 질환 (SARD)의 진단에 도움을 줄 수있다. 이 프로토콜은 효율적으로 정확하게 이러한자가 항체를 검출하기 위해 IIF 기술을 수행하는 방법을 보여줍니다.

반핵 항체 HEP-2 세포를 사용하여 상영

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

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Research

JoVE Journal

Biology

133.7K 조회수.  INOVA Diagnostics, Inc..  간접 면역 형광 (IIF) 분석은 전통적으로 인간 혈청에 항핵 항체 (ANA)의 검출에 사용되어왔다. 이 항체의 존재는 전신자가 면역 류마티스 질환 (SARD)의 진단에 도움을 줄 수있다. 이 프로토콜은 효율적으로 정확하게 이러한자가 항체를 검출하기 위해 IIF 기술을 수행하는 방법을 보여줍니다. 

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Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

연구

생물학

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

임무 LentiPlex는 포유 동물 세포에서 shRNA 도서관 검사를 풀링

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...