JBW에 대한 :;이 작품은 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 재단, Beyster 재단, 학부 연구 기회 (UROP) ATA와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 학생 연구 휄로 십 (2,010,101,926. ID 부여없이 당선 0718128) 여름 프로그램에 의해 지원되었다.

1. 단계 시스템 특성화 : 단계 분리에 대한 결정 임계 값 <ol><li> 원하는 버퍼 또는 세포 배양 매체 15 ML 50 ML 원뿔 튜브에 그림 1 (보라색 점)와 같이에 PEG와 DEX를 포함하는 솔루션을 준비합니다. 향후, PEG와 DEX는 35 kDa의 PEG 500 kDa DEX를 참조 할 수 있지만, 중요한 농도는 사용 두 고분자에 따라 변경됩니다. 각 솔루션 PEG와 DEX의 질량을 기록합니다. 높은 농도 폴리머 솔루션은 분해하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. Vortexing는 혈청이없는 솔루션을 사용할 수 있습니다. 두 폴리머가 완전히 해소 될 때까지 단백질이나 혈청을 포함하는 미디어를 들어, 흔들 무대에서 튜브를 놓습니다. 중합체를 용해하고 초기 농도 관심을 가지고하는 데 사용되는 미디어의 무게를 기록합니다. </li><li> 폴리머가 완전히 용해되면 솔루션은 구름 나타납니다. 이 단계 분리가 발생하는 첫 번째 표시입니다. 이를 확인하려면 허용폴리머 솔루션은 20 분 동안 실온에서 수직 위치에 말이다. 1000 XG에서 원심 분리가 상 분리 과정을 가속화하는 데 사용할 수 있습니다. 밀도가 바닥 단계 DEX 풍부한되며 상단 단계 PEG 풍부한 될 것입니다. </li><li> 천천히 튜브에 추가 버퍼 나 미디어를 추가 할 수 있습니다. 작은 단위대로되지 오버 슈트 상 분리 지점을에 그렇게 사용되어야합니다. </li><li> 솔루션은 분명해진다 더 이상 원심 분리 한 후, 위상 분리에 대한 임계 값에 도달 상 구분 없을 때. 관의 최종 무게를 기록합니다. </li><li> 미디어를 추가 한 후, 위상 분리가 더 이상 발생하지있는 각 두 고분자의 %의 중량 / 중량을 결정하는 최종 무게와 함께 폴리머에 대한 이전 기록 가중치를 사용합니다. </li><li> 이 값을 그리기 x-축에 Y 축 및 % 중량 / 중량 DEX의 % 중량 / 중량 PEG 있습니다. binodal 곡선으로 알려진이 플롯은, 다른 concentrati에 대한 위상 분리에 대한 임계 농도를 측정하는 데 사용하실 수 있습니다특정 세포 배양 매체에서 PEG / DEX의 기능. </li></ol> 2. 구성 1 : 제외 패턴 (96 - 잘 플레이트 형식) <ol><li> 5.0 % 세포 배양 매체의 중량 / 중량 PEG와 12.8 % 중량 / 중량 DEX 별도의 솔루션을 준비합니다. 폴리머가 서로에 대해 평형 후 ATPS이 상태를 유지하기 위해 두 배 이상 중요 지점의 ATPS 솔루션을 사용합니다. PEG 풍부한 위상 및 그 반대에 DEX의 자속의 작은 양의가 있습니다, 따라서, 중요 지점 아래의 농도 드롭으로 위상 시스템의 손실이 발생할 수있는 중요한 농도 근처도 노력하고있어. 마찬가지로, 습도 및 온도 조절 보육에 세포 배양 접시를 전송하면 2 단계 등록 정보를 변경하고 두 솔루션은 miscible 할 수 있습니다. 참고 : 일부 세포가 다른 ATPS 공법과 더 나은 수행 할 수 있습니다. 사용할 수있는 공법은 1 부에서 결정된 binodal 곡선에 따라 선택 될 수있다. </li><li> 제외 patte에 사용되는 세포를 수확rning. 사용 가능한 세포의 총 수 / 농도를 결정합니다. 선택 사항 : CellTracker 또는 형광 현미경을위한 기타 비 세포 독성 라벨과 셀을 레이블을 붙입니다. </li><li> 펠렛 5.0 %의 적절한 볼륨에있는 세포와 펠렛을 resuspend는 제외 할 셀의 원하는 번호를 달성하기 위해 PEG. 예를 들어, 96 - 웰 플레이트의 잘 하나 37,500 섬유 아세포 세포는 다음날 합류를 생성하기 위해 PEG 200 μl에 resuspended해야합니다. 다른 세포 유형과 문화 기판 크기에 맞게 이러한 숫자를 확장. </li><li> micropipettor를 사용하여 건조 세포 배양 기판에 DEX의 0.5 μl 방울을 투여. 큰 볼륨 방울 더 큰 제외 영역을 생산하고 있습니다. 0.1에서 1 μl로 크기까지 방울는 제외 micropatterning하는 것이 좋습니다. 옵션 : DEX의 방울은 미리 24 시간을 입금하고 실온에서 탈수 할 수 할 수 있습니다. 이 깔끔한 패턴을 생성 할 수 있습니다. </li><li> t에 PEG 세포 현탁액 200 μl을 투여그는 잘 DEX의 방울을 커버합니다. </li><li> 37 번 12 시간의 humidified 인큐베이터 ° C, 5 % CO 2의 장소. 요리는 취급 중에 있으며이 패턴을 방해하지 않도록 수준의 보육의 선반에 배치되는 기울하지 않았는지 확인합니다. </li><li> PEG 용액을 제거하고 배지 200 μl로 세 번 씻어. </li><li> 신선한 문화 매체와 보육에 대한 수익을 추가합니다. </li><li> 제외 지역으로 세포의 움직임을 관찰 정기적으로 문화를 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 구성 2 : 아일랜드 패터닝 (96 - 잘 플레이트 형식) <ol><li> 5.0 % 위의 세포 배양 매체에 중량 / 중량 PEG와 12.8 % 중량 / 중량 DEX의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 섬의 패터닝에 사용되는 세포를 수확. 사용 가능한 세포의 총 수 / 농도를 결정합니다. </li><li> 12.8 % DEX의 적절한 볼륨의 펠렛 및 resuspend은 세포 섬 패턴에 대한 세포의 원하는 농도를 달성합니다. 5000 CE의 농도재편 / μl 이하는 강력하게 자기편 세포 유형에 권장합니다. 에 대한 어려움을 부착하거나 느슨하게 준수 세포가 세포 만 세포 / μl까지 농도가 고려 될 수 있습니다. </li><li> 위의 설명에 따라 건조 세포 배양 기판에, DEX의 피펫 0.5 μl 방울을 건조 방지하기 위해 신속하게 작업. 작은 물방울이 건조 허용하지 않습니다. 선택 사항 : PEG 용액 200 μl를 미리 잘에 추가 할 수 있습니다. DEX의 방울 그런 다음 그 아래로 가라 앉을과 문화의 표면 연락을 드릴 것입니다 PEG 용액에 증착 될 수있다. 이 청소기 섬 패턴을 생성 할 수 있습니다. </li><li> PEG 200 μl과 DEX의 방울을 다룹니다. </li><li> 37 번 12 시간의 humidified 인큐베이터 ° C, 5 % CO 2의 장소. 요리는 취급 중에 있으며이 패턴을 방해하지 않도록 수준의 보육의 선반에 배치되는 기울하지 않았는지 확인합니다. </li><li> PEG 용액을 제거하고 배지 200 μl로 세 번 씻어. </li><li> 신선한 문화를 추가매체와 인큐베이터으로 돌아갑니다. </li><li> 섬에서 셀 이동 및 확산 바깥쪽으로를 관찰하기 위해 정기적으로 문화를 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 구성 3 : 배제 공동 문화 (96 - 잘 플레이트 형식) <ol><li> 5.0 % 위의 세포 배양 매체에 중량 / 중량 PEG와 12.8 % 중량 / 중량 DEX의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 제외하고 섬의 패터닝에 사용되는 세포를 수확. 각각의 셀 타입에 사용할 수 세포의 총 수 / 농도를 결정합니다. 선택 사항 : 일부 세포 pairings는 크게 다른 확산 지수를 표시 할 수 있습니다. 섬 패턴 세포를 (특히 장기의 문화를) overpopulating에서 제외 세포를 방지하기 위해 2 시간에 미토 마이신 C와 배제에 사용 된 세포를 치료하거나 수확 전에 비추다. 이 확산을 방지 할 수 있습니다. 형광 CellTracker 염료가 필요한 경우 두 세포 집단을 구분하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 펠렛 exclusio의 세포와 펠렛을 resuspendN 5.0 %의 PEG의 적절한 볼륨의 패턴은 위 세포의 원하는 번호를 달성합니다. 위와 같이, 세포의 원하는 농도를 달성하기 위해 12.8 % DEX의 적절한 볼륨으로 섬의 패턴에 대한 펠렛을 Resuspend. </li><li> micropipettor를 사용하여 건조 세포 배양 기판에 DEX 세포 현탁액의 0.5 μl 방울을 투여. 작은 물방울이 건조 허용하지 않습니다. </li><li> PEG의 세포 현탁액 200 μl로 DEX의 방울을 다룹니다. </li><li> 37 번 12 시간의 humidified 인큐베이터 ° C, 5 % CO 2의 장소. 요리는 취급 중에 있으며이 패턴을 방해하지 않도록 수준의 보육의 선반에 배치되는 기울하지 않았는지 확인합니다. </li><li> PEG 용액을 제거하고 배지 200 μl에 세 번 씻는다. </li><li> 신선한 문화 매체와 보육에 대한 수익을 추가합니다. </li><li> 세포 인구 사이의 상호 작용을 관찰하기 위해 공동 문화를 모니터링 할 수 있습니다. 선택 사항 : 컨트롤은 배제 나 섬 패터닝 개인을 수행하여 준비 할 수 있습니다idually, 상호 작용하지 않는 공동 문화 셀이나 패터닝 전이나 후에 하나 또는 둘 모두 세포 인구의 관심 경로를 차단합니다. </li></ol>

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저자는 재정 이익을 경쟁 없습니다.

ATPS 셀 micropatterning 방법은 세포 배양 기술의 능력 이외의 거의 전문 지식을 필요로 신속하게 마스터 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 저렴한 신속하고 세포 유형과 문화 다양한 형식의와 호환되는지입니다. 이러한 이유로, 우리의 프로토콜은 쉽게 특히 생명 과학자, 세포 증식, 이주 및 chemotaxis, 그리고 세포 인구 중 juxtacrine 및 paracrine 상호 작용의 영향을 연구하는 사람들에 의해 채택되어야한?...

이 호환되지 않는 고분자의 솔루션은 충분히 높은 농도에서 함께 혼합 수용액 2 단계 시스템 (ATPSs)는 형식입니다. 단계 분리는 분자량과 극성 고분자의, 솔루션, 산도 및 수성 용매 1, 2의 이온 콘텐츠의 온도를 포함 다양한 요소에 의해 영향을받습니다. 별도의 두 폴리머 솔루션 선택 단계 시스템의 physiochemical 특성에 의해 결정하지만,되는 시점은 일반적으로 ATPSs는 생명 공학에 사용 할 수 있도록, 비 denaturing 조건 하에서 낮은 폴리머 농도 (20 % 이하 중량 / 중량)에 발생 응용 프로그램 3-9. 지금까지 가장 광범위하게 연구 ATPS는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) / dextran (DEX) 시스템입니다. 이 저렴하고 biocompatible 폴리머에 의해 형성 ATPS는 원래 분자 파티션 2, 10에 의해 분자의 정화에 대한 설명되었다. 파티션상 시스템에 기여하지 않은 추가 분자 또는 입자 PEG와 DEX과 혼합 할 때 발생합니다. DEX 또는 PEG 중 대한 상대적 동질성을 바탕으로 분자 또는 입자는 우선적으로 두 단계 중 하나에 또는 인터페이스에있는 것입니다. PEG / DEX ATPS의 또 다른 속성은 두 폴리머 단계 사이의 계면 장력의 존재입니다. PEG 및 DEX에 의해 형성 ATPSs은 일반적으로 기름과 물 등의 액체 - 액체 2 상 시스템보다 훨씬 낮 계면 긴장을 표시하지만, 계면 장력 세력은 여전히 바이러스, 세포와 단백질을 합산이 같은 작은 입자에 효과를 발휘 , 11-13. 포유류의 세포에 대한 해로운 영향이 내에 포함되는 경우, 높은 분자량 PEG와 DEX 소금의 생리적 농도의 존재에 낮은 농도 (5 % 이하의 중량 / 고 분자량의 폴리머 종류에 대한 중량)에서 별도의 있기 때문에, 몇 있습니다 시스템14-16. 최근 계면 특성과 ATPSs의 파티션 효과를 세포 패터닝 14, 16-20 위해 우리 실험실에 의해 적용되었습니다. 이것은 micropatterning에 의해 PEG의 존재의 세포 배양 기판에 밀도가 DEX 솔루션을 달성했습니다. 세포 PEG 단계에 통합 될 때, 그것들은 PEG / DEX 계면 장력 20 인해 DEX의 방울을 입력에서 제외됩니다. 세포 DEX 단계에서 패턴 할 때, 그것들은 계면 장력과 분할 16, 17, 19에 의해 세포 배양 기판의 표면에 유지됩니다. 세포 패터닝을위한 다른 방법 대조적으로, ATPS 세포 패터닝은 배우기 쉽습니다 만 고분자 자체, 그리고 세포 배양을 수행하고 micropipettor를 사용할 수있는 기능에 대한 기초적인 지식이 필요합니다. 세포 패터닝을위한 다른 방법은 종종 쉽게 번째로 번역되지 않은 특수 장비 및 교육을 포함전자 생명 과학. 예를 들어, 일부 방법 (microcontact 인쇄 나 잉크젯 인쇄) 간접적 이후 휴대 첨부 파일 21, 22에 대한 사이트 역할을 문화 기판에 세포 접착 분자의 패턴을 적용하여 패턴 세포. 간접적 인 접근 방법은 몇 가지 세포 유형에 대한 유용한 있지만, 사용자 기술과 패터닝 도구를 제조하는 전문 장비의 높은 수준을 필요로하고, 특정 세포 유형 / 생체 분자 패턴에 따라 특이성이 부족 할 수 있습니다. 또한, 세포는 판상 흐름 패턴, stenciling 및 잉크젯 인쇄 23-26를 포함 직접 패터닝의 방식에 의해 높은 패턴 특이성으로 증착 될 수있다. 그러나 이러한 기술은 사용자의 전문 지식과 전문 장비를 필요로하고, 인쇄 과정에서 세포가 손상 될 수 있습니다. 이러한 접근 방법은 일반적으로 생명 과학에 유용한 도구가 될 세포 패터닝을위한 세포의 정확한 패턴을 생산하지만, 비용 효과적인이어야합니다구현하기 간단한 차. 여기 우리는 이전에 출판 응용 프로그램에 설명 된 ATPSs를 사용하여 패턴 배양 한 세포를 생성하는 자세한 프로토콜을보고합니다. 만 micropipettors를 사용하여 사용자는 마이그레이션 assays에 대한 셀 제외 지역 또는 셀 섬을 생성 할 수 있습니다. 이것은 어느 DEX 단계에서 세포를 유지하거나 DEX에서 PEG 단계에 입금 셀을 제외 PEG / DEX 계면 장력에 의해 달성된다. 이 두 기본 패턴 기술을 결합함으로써, 빠르게 등 간 섬유 아세포 세포 공동 문화와 같은 세포의 공동 문화를 생성 할 수 있습니다. 패터닝 방법, ATPS 매개 변수와 예상 결과가 자세히 설명되어 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 제조업 자 </td></tr><tr><td> Dextran 500,000 kDa </td><td> Pharmacosmos, 덴마크 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 글리콜 35,000 kDa </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td></tr><tr><td> 헬러 </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> HepG2 C3A </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> 3T3 NIH </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> 셀 트래커 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr></tbody></table>

cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems

빠르고, 사용하기 쉬운 저렴 세포 패터닝 기술은 세포 세포 상호 작용과 조직 엔지니어링 시스템을 공부 높은 처리량 세포 assays, 플랫폼의 미래 발전을 위해 필요합니다. 이 자세한 프로토콜은 임계 농도 위에 결합 상 별도의 때 dextran (DEX) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 biocompatible 솔루션을 사용 세포의 공동 문화를 생성하는 방법을 설명합니다. 세포는이 방법을 사용하여 구성 다양한 패턴 할 수 있습니다. 셀 제외 패턴은 기판에 DEX의 방울을 인쇄하고 PEG가 포함 된 셀의 솔루션을 다루는하여 수행 할 수 있습니다. 두 폴리머 솔루션을 사이에 형성 계면 장력은 DEX 비말의 바깥 주위에 빠지지 및 마이그레이션 assays에 사용 할 수있는 원형 개간를 형성 세포가 발생합니다. 셀 섬은 PEG 용액에 세포 풍부한 DEX 단계를 분배하거나 DEX를 덮고하여 패턴 할 수 있습니다PEG의 솔루션을 비말. 공동 문화는 DEX 섬의 패턴과 셀 제외를 조합하여 직접 형성 될 수있다. 이 방법은 수동 micropipetting 등의 액체 처리 방법, 다양한와 호환 있으며, 거의 모든 자기편 세포 유형으로 사용할 수 있습니다.

세포 패터닝을위한 PEG와 DEX의 적절한 조합을 선택하려면이 binodal 곡선을 결정하는 것이 중요합니다. 이 곡선은 ATPS가 형성 수 있으며, 온도, 산도 및 이온 콘텐츠를 기반으로 고분자의 주어진 세트에 따라 다를 수의 점을 delineates. 사용자 정의 중간 공법을 필요로 배양 세포의 경우는 실험적으로 binodal 곡선을 결정하기 위해 필요할 수 있습니다. 이것은 멀리 binodal과 PEG와 DEX 내용에 변화 (그?...

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Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

수성 2 단계 시스템은 세포 동시에 패턴 여러 사람들에게 사용되었습니다. 세포 패터닝을위한이 빠르고 쉬운 방법은 dextran과 폴리에틸렌 글리콜 및 두 개의 폴리머 솔루션 사이에 존재 계면 장력의 수성 솔루션의 위상 분리의 장점을 걸립니다.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

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18.3K 조회수.  University of Michigan. 수성 2 단계 시스템은 세포 동시에 패턴 여러 사람들에게 사용되었습니다. 세포 패터닝을위한이 빠르고 쉬운 방법은 dextran과 폴리에틸렌 글리콜 및 두 개의 폴리머 솔루션 사이에 존재 계면 장력의 수성 솔루션의 위상 분리의 장점을 걸립니다.