JBW에 대한 :;이 작품은 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 재단, Beyster 재단, 학부 연구 기회 (UROP) ATA와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 학생 연구 휄로 십 (2,010,101,926. ID 부여없이 당선 0718128) 여름 프로그램에 의해 지원되었다.

1. 단계 시스템 특성화 : 단계 분리에 대한 결정 임계 값 <ol><li> 원하는 버퍼 또는 세포 배양 매체 15 ML 50 ML 원뿔 튜브에 그림 1 (보라색 점)와 같이에 PEG와 DEX를 포함하는 솔루션을 준비합니다. 향후, PEG와 DEX는 35 kDa의 PEG 500 kDa DEX를 참조 할 수 있지만, 중요한 농도는 사용 두 고분자에 따라 변경됩니다. 각 솔루션 PEG와 DEX의 질량을 기록합니다. 높은 농도 폴리머 솔루션은 분해하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. Vortexing는 혈청이없는 솔루션을 사용할 수 있습니다. 두 폴리머가 완전히 해소 될 때까지 단백질이나 혈청을 포함하는 미디어를 들어, 흔들 무대에서 튜브를 놓습니다. 중합체를 용해하고 초기 농도 관심을 가지고하는 데 사용되는 미디어의 무게를 기록합니다. </li><li> 폴리머가 완전히 용해되면 솔루션은 구름 나타납니다. 이 단계 분리가 발생하는 첫 번째 표시입니다. 이를 확인하려면 허용폴리머 솔루션은 20 분 동안 실온에서 수직 위치에 말이다. 1000 XG에서 원심 분리가 상 분리 과정을 가속화하는 데 사용할 수 있습니다. 밀도가 바닥 단계 DEX 풍부한되며 상단 단계 PEG 풍부한 될 것입니다. </li><li> 천천히 튜브에 추가 버퍼 나 미디어를 추가 할 수 있습니다. 작은 단위대로되지 오버 슈트 상 분리 지점을에 그렇게 사용되어야합니다. </li><li> 솔루션은 분명해진다 더 이상 원심 분리 한 후, 위상 분리에 대한 임계 값에 도달 상 구분 없을 때. 관의 최종 무게를 기록합니다. </li><li> 미디어를 추가 한 후, 위상 분리가 더 이상 발생하지있는 각 두 고분자의 %의 중량 / 중량을 결정하는 최종 무게와 함께 폴리머에 대한 이전 기록 가중치를 사용합니다. </li><li> 이 값을 그리기 x-축에 Y 축 및 % 중량 / 중량 DEX의 % 중량 / 중량 PEG 있습니다. binodal 곡선으로 알려진이 플롯은, 다른 concentrati에 대한 위상 분리에 대한 임계 농도를 측정하는 데 사용하실 수 있습니다특정 세포 배양 매체에서 PEG / DEX의 기능. </li></ol> 2. 구성 1 : 제외 패턴 (96 - 잘 플레이트 형식) <ol><li> 5.0 % 세포 배양 매체의 중량 / 중량 PEG와 12.8 % 중량 / 중량 DEX 별도의 솔루션을 준비합니다. 폴리머가 서로에 대해 평형 후 ATPS이 상태를 유지하기 위해 두 배 이상 중요 지점의 ATPS 솔루션을 사용합니다. PEG 풍부한 위상 및 그 반대에 DEX의 자속의 작은 양의가 있습니다, 따라서, 중요 지점 아래의 농도 드롭으로 위상 시스템의 손실이 발생할 수있는 중요한 농도 근처도 노력하고있어. 마찬가지로, 습도 및 온도 조절 보육에 세포 배양 접시를 전송하면 2 단계 등록 정보를 변경하고 두 솔루션은 miscible 할 수 있습니다. 참고 : 일부 세포가 다른 ATPS 공법과 더 나은 수행 할 수 있습니다. 사용할 수있는 공법은 1 부에서 결정된 binodal 곡선에 따라 선택 될 수있다. </li><li> 제외 patte에 사용되는 세포를 수확rning. 사용 가능한 세포의 총 수 / 농도를 결정합니다. 선택 사항 : CellTracker 또는 형광 현미경을위한 기타 비 세포 독성 라벨과 셀을 레이블을 붙입니다. </li><li> 펠렛 5.0 %의 적절한 볼륨에있는 세포와 펠렛을 resuspend는 제외 할 셀의 원하는 번호를 달성하기 위해 PEG. 예를 들어, 96 - 웰 플레이트의 잘 하나 37,500 섬유 아세포 세포는 다음날 합류를 생성하기 위해 PEG 200 μl에 resuspended해야합니다. 다른 세포 유형과 문화 기판 크기에 맞게 이러한 숫자를 확장. </li><li> micropipettor를 사용하여 건조 세포 배양 기판에 DEX의 0.5 μl 방울을 투여. 큰 볼륨 방울 더 큰 제외 영역을 생산하고 있습니다. 0.1에서 1 μl로 크기까지 방울는 제외 micropatterning하는 것이 좋습니다. 옵션 : DEX의 방울은 미리 24 시간을 입금하고 실온에서 탈수 할 수 할 수 있습니다. 이 깔끔한 패턴을 생성 할 수 있습니다. </li><li> t에 PEG 세포 현탁액 200 μl을 투여그는 잘 DEX의 방울을 커버합니다. </li><li> 37 번 12 시간의 humidified 인큐베이터 ° C, 5 % CO 2의 장소. 요리는 취급 중에 있으며이 패턴을 방해하지 않도록 수준의 보육의 선반에 배치되는 기울하지 않았는지 확인합니다. </li><li> PEG 용액을 제거하고 배지 200 μl로 세 번 씻어. </li><li> 신선한 문화 매체와 보육에 대한 수익을 추가합니다. </li><li> 제외 지역으로 세포의 움직임을 관찰 정기적으로 문화를 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 구성 2 : 아일랜드 패터닝 (96 - 잘 플레이트 형식) <ol><li> 5.0 % 위의 세포 배양 매체에 중량 / 중량 PEG와 12.8 % 중량 / 중량 DEX의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 섬의 패터닝에 사용되는 세포를 수확. 사용 가능한 세포의 총 수 / 농도를 결정합니다. </li><li> 12.8 % DEX의 적절한 볼륨의 펠렛 및 resuspend은 세포 섬 패턴에 대한 세포의 원하는 농도를 달성합니다. 5000 CE의 농도재편 / μl 이하는 강력하게 자기편 세포 유형에 권장합니다. 에 대한 어려움을 부착하거나 느슨하게 준수 세포가 세포 만 세포 / μl까지 농도가 고려 될 수 있습니다. </li><li> 위의 설명에 따라 건조 세포 배양 기판에, DEX의 피펫 0.5 μl 방울을 건조 방지하기 위해 신속하게 작업. 작은 물방울이 건조 허용하지 않습니다. 선택 사항 : PEG 용액 200 μl를 미리 잘에 추가 할 수 있습니다. DEX의 방울 그런 다음 그 아래로 가라 앉을과 문화의 표면 연락을 드릴 것입니다 PEG 용액에 증착 될 수있다. 이 청소기 섬 패턴을 생성 할 수 있습니다. </li><li> PEG 200 μl과 DEX의 방울을 다룹니다. </li><li> 37 번 12 시간의 humidified 인큐베이터 ° C, 5 % CO 2의 장소. 요리는 취급 중에 있으며이 패턴을 방해하지 않도록 수준의 보육의 선반에 배치되는 기울하지 않았는지 확인합니다. </li><li> PEG 용액을 제거하고 배지 200 μl로 세 번 씻어. </li><li> 신선한 문화를 추가매체와 인큐베이터으로 돌아갑니다. </li><li> 섬에서 셀 이동 및 확산 바깥쪽으로를 관찰하기 위해 정기적으로 문화를 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 구성 3 : 배제 공동 문화 (96 - 잘 플레이트 형식) <ol><li> 5.0 % 위의 세포 배양 매체에 중량 / 중량 PEG와 12.8 % 중량 / 중량 DEX의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 제외하고 섬의 패터닝에 사용되는 세포를 수확. 각각의 셀 타입에 사용할 수 세포의 총 수 / 농도를 결정합니다. 선택 사항 : 일부 세포 pairings는 크게 다른 확산 지수를 표시 할 수 있습니다. 섬 패턴 세포를 (특히 장기의 문화를) overpopulating에서 제외 세포를 방지하기 위해 2 시간에 미토 마이신 C와 배제에 사용 된 세포를 치료하거나 수확 전에 비추다. 이 확산을 방지 할 수 있습니다. 형광 CellTracker 염료가 필요한 경우 두 세포 집단을 구분하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 펠렛 exclusio의 세포와 펠렛을 resuspendN 5.0 %의 PEG의 적절한 볼륨의 패턴은 위 세포의 원하는 번호를 달성합니다. 위와 같이, 세포의 원하는 농도를 달성하기 위해 12.8 % DEX의 적절한 볼륨으로 섬의 패턴에 대한 펠렛을 Resuspend. </li><li> micropipettor를 사용하여 건조 세포 배양 기판에 DEX 세포 현탁액의 0.5 μl 방울을 투여. 작은 물방울이 건조 허용하지 않습니다. </li><li> PEG의 세포 현탁액 200 μl로 DEX의 방울을 다룹니다. </li><li> 37 번 12 시간의 humidified 인큐베이터 ° C, 5 % CO 2의 장소. 요리는 취급 중에 있으며이 패턴을 방해하지 않도록 수준의 보육의 선반에 배치되는 기울하지 않았는지 확인합니다. </li><li> PEG 용액을 제거하고 배지 200 μl에 세 번 씻는다. </li><li> 신선한 문화 매체와 보육에 대한 수익을 추가합니다. </li><li> 세포 인구 사이의 상호 작용을 관찰하기 위해 공동 문화를 모니터링 할 수 있습니다. 선택 사항 : 컨트롤은 배제 나 섬 패터닝 개인을 수행하여 준비 할 수 있습니다idually, 상호 작용하지 않는 공동 문화 셀이나 패터닝 전이나 후에 하나 또는 둘 모두 세포 인구의 관심 경로를 차단합니다. </li></ol>

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저자는 재정 이익을 경쟁 없습니다.

ATPS 셀 micropatterning 방법은 세포 배양 기술의 능력 이외의 거의 전문 지식을 필요로 신속하게 마스터 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 저렴한 신속하고 세포 유형과 문화 다양한 형식의와 호환되는지입니다. 이러한 이유로, 우리의 프로토콜은 쉽게 특히 생명 과학자, 세포 증식, 이주 및 chemotaxis, 그리고 세포 인구 중 juxtacrine 및 paracrine 상호 작용의 영향을 연구하는 사람들에 의해 채택되어야한?...

이 호환되지 않는 고분자의 솔루션은 충분히 높은 농도에서 함께 혼합 수용액 2 단계 시스템 (ATPSs)는 형식입니다. 단계 분리는 분자량과 극성 고분자의, 솔루션, 산도 및 수성 용매 1, 2의 이온 콘텐츠의 온도를 포함 다양한 요소에 의해 영향을받습니다. 별도의 두 폴리머 솔루션 선택 단계 시스템의 physiochemical 특성에 의해 결정하지만,되는 시점은 일반적으로 ATPSs는 생명 공학에 사용 할 수 있도록, 비 denaturing 조건 하에서 낮은 폴리머 농도 (20 % 이하 중량 / 중량)에 발생 응용 프로그램 3-9. 지금까지 가장 광범위하게 연구 ATPS는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) / dextran (DEX) 시스템입니다. 이 저렴하고 biocompatible 폴리머에 의해 형성 ATPS는 원래 분자 파티션 2, 10에 의해 분자의 정화에 대한 설명되었다. 파티션상 시스템에 기여하지 않은 추가 분자 또는 입자 PEG와 DEX과 혼합 할 때 발생합니다. DEX 또는 PEG 중 대한 상대적 동질성을 바탕으로 분자 또는 입자는 우선적으로 두 단계 중 하나에 또는 인터페이스에있는 것입니다. PEG / DEX ATPS의 또 다른 속성은 두 폴리머 단계 사이의 계면 장력의 존재입니다. PEG 및 DEX에 의해 형성 ATPSs은 일반적으로 기름과 물 등의 액체 - 액체 2 상 시스템보다 훨씬 낮 계면 긴장을 표시하지만, 계면 장력 세력은 여전히 바이러스, 세포와 단백질을 합산이 같은 작은 입자에 효과를 발휘 , 11-13. 포유류의 세포에 대한 해로운 영향이 내에 포함되는 경우, 높은 분자량 PEG와 DEX 소금의 생리적 농도의 존재에 낮은 농도 (5 % 이하의 중량 / 고 분자량의 폴리머 종류에 대한 중량)에서 별도의 있기 때문에, 몇 있습니다 시스템14-16. 최근 계면 특성과 ATPSs의 파티션 효과를 세포 패터닝 14, 16-20 위해 우리 실험실에 의해 적용되었습니다. 이것은 micropatterning에 의해 PEG의 존재의 세포 배양 기판에 밀도가 DEX 솔루션을 달성했습니다. 세포 PEG 단계에 통합 될 때, 그것들은 PEG / DEX 계면 장력 20 인해 DEX의 방울을 입력에서 제외됩니다. 세포 DEX 단계에서 패턴 할 때, 그것들은 계면 장력과 분할 16, 17, 19에 의해 세포 배양 기판의 표면에 유지됩니다. 세포 패터닝을위한 다른 방법 대조적으로, ATPS 세포 패터닝은 배우기 쉽습니다 만 고분자 자체, 그리고 세포 배양을 수행하고 micropipettor를 사용할 수있는 기능에 대한 기초적인 지식이 필요합니다. 세포 패터닝을위한 다른 방법은 종종 쉽게 번째로 번역되지 않은 특수 장비 및 교육을 포함전자 생명 과학. 예를 들어, 일부 방법 (microcontact 인쇄 나 잉크젯 인쇄) 간접적 이후 휴대 첨부 파일 21, 22에 대한 사이트 역할을 문화 기판에 세포 접착 분자의 패턴을 적용하여 패턴 세포. 간접적 인 접근 방법은 몇 가지 세포 유형에 대한 유용한 있지만, 사용자 기술과 패터닝 도구를 제조하는 전문 장비의 높은 수준을 필요로하고, 특정 세포 유형 / 생체 분자 패턴에 따라 특이성이 부족 할 수 있습니다. 또한, 세포는 판상 흐름 패턴, stenciling 및 잉크젯 인쇄 23-26를 포함 직접 패터닝의 방식에 의해 높은 패턴 특이성으로 증착 될 수있다. 그러나 이러한 기술은 사용자의 전문 지식과 전문 장비를 필요로하고, 인쇄 과정에서 세포가 손상 될 수 있습니다. 이러한 접근 방법은 일반적으로 생명 과학에 유용한 도구가 될 세포 패터닝을위한 세포의 정확한 패턴을 생산하지만, 비용 효과적인이어야합니다구현하기 간단한 차. 여기 우리는 이전에 출판 응용 프로그램에 설명 된 ATPSs를 사용하여 패턴 배양 한 세포를 생성하는 자세한 프로토콜을보고합니다. 만 micropipettors를 사용하여 사용자는 마이그레이션 assays에 대한 셀 제외 지역 또는 셀 섬을 생성 할 수 있습니다. 이것은 어느 DEX 단계에서 세포를 유지하거나 DEX에서 PEG 단계에 입금 셀을 제외 PEG / DEX 계면 장력에 의해 달성된다. 이 두 기본 패턴 기술을 결합함으로써, 빠르게 등 간 섬유 아세포 세포 공동 문화와 같은 세포의 공동 문화를 생성 할 수 있습니다. 패터닝 방법, ATPS 매개 변수와 예상 결과가 자세히 설명되어 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 제조업 자 </td></tr><tr><td> Dextran 500,000 kDa </td><td> Pharmacosmos, 덴마크 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 글리콜 35,000 kDa </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td></tr><tr><td> 헬러 </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> HepG2 C3A </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> 3T3 NIH </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> 셀 트래커 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr></tbody></table>

cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems

빠르고, 사용하기 쉬운 저렴 세포 패터닝 기술은 세포 세포 상호 작용과 조직 엔지니어링 시스템을 공부 높은 처리량 세포 assays, 플랫폼의 미래 발전을 위해 필요합니다. 이 자세한 프로토콜은 임계 농도 위에 결합 상 별도의 때 dextran (DEX) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 biocompatible 솔루션을 사용 세포의 공동 문화를 생성하는 방법을 설명합니다. 세포는이 방법을 사용하여 구성 다양한 패턴 할 수 있습니다. 셀 제외 패턴은 기판에 DEX의 방울을 인쇄하고 PEG가 포함 된 셀의 솔루션을 다루는하여 수행 할 수 있습니다. 두 폴리머 솔루션을 사이에 형성 계면 장력은 DEX 비말의 바깥 주위에 빠지지 및 마이그레이션 assays에 사용 할 수있는 원형 개간를 형성 세포가 발생합니다. 셀 섬은 PEG 용액에 세포 풍부한 DEX 단계를 분배하거나 DEX를 덮고하여 패턴 할 수 있습니다PEG의 솔루션을 비말. 공동 문화는 DEX 섬의 패턴과 셀 제외를 조합하여 직접 형성 될 수있다. 이 방법은 수동 micropipetting 등의 액체 처리 방법, 다양한와 호환 있으며, 거의 모든 자기편 세포 유형으로 사용할 수 있습니다.

세포 패터닝을위한 PEG와 DEX의 적절한 조합을 선택하려면이 binodal 곡선을 결정하는 것이 중요합니다. 이 곡선은 ATPS가 형성 수 있으며, 온도, 산도 및 이온 콘텐츠를 기반으로 고분자의 주어진 세트에 따라 다를 수의 점을 delineates. 사용자 정의 중간 공법을 필요로 배양 세포의 경우는 실험적으로 binodal 곡선을 결정하기 위해 필요할 수 있습니다. 이것은 멀리 binodal과 PEG와 DEX 내용에 변화 (그?...

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Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

수성 2 단계 시스템은 세포 동시에 패턴 여러 사람들에게 사용되었습니다. 세포 패터닝을위한이 빠르고 쉬운 방법은 dextran과 폴리에틸렌 글리콜 및 두 개의 폴리머 솔루션 사이에 존재 계면 장력의 수성 솔루션의 위상 분리의 장점을 걸립니다.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K 조회수.  University of Michigan. 수성 2 단계 시스템은 세포 동시에 패턴 여러 사람들에게 사용되었습니다. 세포 패터닝을위한이 빠르고 쉬운 방법은 dextran과 폴리에틸렌 글리콜 및 두 개의 폴리머 솔루션 사이에 존재 계면 장력의 수성 솔루션의 위상 분리의 장점을 걸립니다.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

세포 네트워크의 창조를위한 플라즈마 리소그래피 표면 Patterning

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

연구

생체공학

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

수성 환경에서 탄화수소 전환을 사용하는 툴킷

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3D 종이 미세 유체 장치를 구축하기 위해 접착제 패터닝을 사용하여

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

미세 유동 프로브와 라이브 셀 레이어의 빠른 빼기 패터닝

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

DNA를 사용하여 세포의 간단하고, 적당한, 모듈식 패터닝

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...