우리는 진심으 세포 배양 및 이미징 작업에 그들의 공헌에 대 한 이미징 핵심 시설 중서부 대학 (MWU)와 [Chanmoly 셍, 크리스토퍼 Dipollina, 대 릴 Giambalvo, 그리고 케이시 Sigerson] 학생의 그룹에 감사 합니다. 이 연구 작업은 MWU의 Intramural 교부 V.T. M.F. 및 연구 시작 자금에 의해 지원 되었다

동물의 사용을 포함 한 모든 절차는 제도적 검토 보드 승인 프로토콜 (IACUC 중서부 대학)에 의해 승인 되었습니다.
1. 마우스 배아에서 DRG 수확
<ol><li>
잘린 뒤 질 식 방법 (CO2)에 의해 성인 쥐 안락사 즉시 수술 척추 열 제거를 진행 합니다.
	<ol>
<li>Dorsally 좋은 위를 사용 하 여 피부 레이어 아래로 절단 하 여 척추 열을 노출 합니다. 동물의 나머지에서 척추 열을 구분 하는 천 골을 통해 열의 양쪽에 있는 갈비뼈를 절단 하 여 척추 열을 격리 합니다.</li>
		<li>바늘/핀을 사용 하 여 수술 매트에 척추 칼럼 (복 부 쪽)를 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>좋은 위 만들기를 사용 하 여 double 척추 운하의 복 부 측 폭로 척추의 양쪽에 잘라.</li>
	<li>현미경 수술 (배율 X 4로 설정)가 위를 사용 하 여 부드럽게 contralateral 등 쪽 척추 뿌리를 노출 하 고 주변 신경의 지 뿌리 따라 DRG를 찾으려고 편이 척수를 이동. 각 절의 척추 foramina 안에 부분적으로 숨겨집니다.</li>
	<li>DRG, 수확 한 집게 (척수와 사이 DRG) 지 루트 꼬집어 고 부드럽게 척추 구멍에서 DRG를 꺼내.</li>
	<li>DRG에 주변 척추 신경에 두 번째 집게를 배치 하 고 척추 신경 및 척추 루트 DRG를 당겨.</li>
	<li>수집된 DRG 35mm 차가운 혈 청 자유로운 미디어 (SFM)34의 3 mL를 포함 하는 배양 접시에에서 놓습니다.</li>
	<li>마른 유리 샬레에에서 각 개별 DRG 전송, 수술 현미경 청소 하 고 트림 초과 섬유와 여전히 DRG는 블레이드를 사용 하 여에 연결 하는 결합 조직. DRG는 흰색 척추 신경/루트 따라 불 룩 한 투명 구조로 쉽게 식별. 종종는 DRG를 둘러싼 혈관 발견 된다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 SFM 미디어를 포함 하는 새로운 페 트리 접시에 청소 DRG를 놓습니다.</li>
	<li>젤라틴 단백질 혼합물을 희석 ( 재료의 표참조)에 얼음 처럼 차가운 SFM (1:1).</li>
	<li>DRG 비보 전 12-잘 접시에 접시 미리 젤라틴 단백질 혼합물의 10/20 µ L로 코팅 하 고 30-60 분에 대 한 37 ° C, 5% CO2 배양 기 안에 그들을 설정 합니다.</li>
	<li>부드럽게 커버 전체 explant 및 유지 조건 (37 ° C, 5% CO2) 경작에서 explants 문화 시스템에 SFM의 1.5-2 mL를 추가 합니다. 참고: 이것은 중요 한 단계는 DRG 유리 요리만 생산 젤라틴 단백질 혼합물에 의해 고정 되어 있기 때문 에입니다. 중 합 및 pipetting 능력의 시간 부동 피하기 위해 중요 하다.</li>
	<li>성장 DRG 마다 72 h의 매체 변경 하 고 필요한 만큼 성장 하는 DRG를 하자.</li>
</ol>2. 격리 DRG에서 단일 셀 신경
<ol><li>모든 DRG 콜라 IV의 1.25 mg/mL를 포함 하는 F12 미디어의 1.2 mL 살 균 1.5 mL 튜브에 수집 하 고 37 ° C, 5% CO2 45 분에서 그것을 품 어 또 다른 45 분에 대 한 첫 번째 부 화 후이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>30 분에 대 한 트립 신 (0.025%)를 포함 하는 37 ° C, 5% CO2에 콜라 IV 치료 후 즉시 F12 미디어의 2 mL와 explants 취급 합니다.</li>
	<li>15 분 동안 37 ° C, 5% CO2 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, 33%)를 포함 된 F12 미디어 2 mL와 함께 품 어.</li>
	<li>Explants F12 미디어의 2 mL로 세 번 세척 하 고 기계적으로 해리 그들 유리 피 펫과 미디어 흐린 변할 때까지 계속 합니다. 참고:이 절차는 이전 섹션에 설명 된 대로 동물에서 청소/손질 DRG의 컬렉션을 포함 한다. Explants의 기계적 분리를 수행할 때 부드러운 고 흘림 및 작업 자료의 손실을 발생할 수 있습니다 이후 과도 한 무력을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>0.22 μ m 필터 어떤 불순물 및 과도 결합 조직 제거를 통해 해리 세포 배양을 필터링 합니다. 필터링 된 셀 (2500 x g)에서 lysate 원심 2 분.</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 셀 펠 릿 신경 문화 (1x), 항생제 혼합 (1x), L-글루타민 산 염 (0.5 m m)에 대 한 보충을 포함 하는 neurobasal 미디어의 500 µ L에서 resuspend 및 신경 성장 인자 (5 µ g/mL) ( 재료의 표참조).</li>
	<li>기본 셀 밀도 laminin 코팅 커버 슬라이드 (50 µ g/mL, 참조 테이블의 재료)에 천연된 셀 접시. 셀 카운터를 사용 하 여 셀 밀도 결정 합니다. 참고: 우리가 도금 25000 셀/커버 슬라이드에 세포. 이 기술은 신경 그리고 glial 위성 세포의 분리 수 있습니다. Pseudounipolar 신경와 공동 경작 glial 구성 요소 신경 생존을 위해 중요 한 역할을 한다.</li>
</ol>3. HSV-1 감염 DRG Explants의 DRG 파생 해리 셀
참고:이 작업 엄격 하 게는 우리는 완벽 하 게 갖춘된 실험실 중서부 대학 biosafety 위원회에 의해 승인 되는 biosafety 수준 2 (BSL-2) 요구에 따라 이루어졌다. HSV-1에의 KOS 스트레인이이 연구에 사용 되었다. 바이러스 긴장을 사용 하는 경우 적절 한 측정 및 현지 기관 지침에 따라 안전 조치 보시기 바랍니다.
<ol><li>확인 하 고 바이러스 감염 모델 SFM 미디어에 올바른 희석에 준비. 이 연구에 사용 된 바이러스는 HSV-1에의 KOS 긴장 했다. DRG 파생 작업 셀 해리 때 감염, 바이러스 같은 셀의 수 수를 의미에 대 한 다양 한 감염 (MOI)의 1 단위를 사용 합니다.</li>
	<li>Explants DRG를 감염 하는 경우 셀에는 explant의 정확한 수를 확인할 수 없으므로 virions (예를 들어, 10000 virions)의 수를 사용 합니다.</li>
	<li>Explant/셀 수 바이러스에 감염 된 살 균 셀 접시 또는 SFM 미디어와 바이러스의 혼합물을 포함 하는 튜브에 놓습니다. 참고: 우리는 25000 셀 (1 나)를 포함 하는 커버 슬라이드에 대 한 25000 virions를 사용. explant 감염, 우리는 10000 virions를 사용 합니다.</li>
	<li>열릴; 감염에 대 한 37 ° C에서 셀 플레이트 또는 관 배치 바이러스 노출 시간 바이러스 infectivity 따라 달라질 수 있습니다. 참고: 바이러스 항목 직교-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) 및 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) 분석 실험26사용 하 여 확인 되었다.</li>
</ol>4입니다. 면역 형광 검사
<ol><li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4% 포 르 말린에 explants 및 단일 셀 샘플을 수정. PBS에서 3 시간 10 분 대 한 샘플을 씻으십시오.</li>
	<li>원하는 기본 항 체 (안티-β-tubulin, 안티-peripherin, 안티-heparan 황산 염 (HS), 또는 반대로 당단백질 D (gD) 항 체, 희석에 대 한 참조 테이블의 자료 ) 0.3% 버퍼 PBS에에서 희석 된 샘플을 품 어 트리톤-X (PBST) 및 10 % 정상 염소 혈 청입니다. 밤새 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
	<li>3 번 10 분 각 PBS 가진 대 한 샘플을 씻으십시오. 1 h 적절 한 이차 항 체에 대 한 실 온에서 샘플을 품 어 (488 또는 Cy3; 희석에 대 한 재료의 표 참조) PBS에 희석.</li>
	<li>3 번 10 분 각 PBS 가진 대 한 샘플을 씻으십시오. 설치 단계 전에 20 분에 대 한 PBS에 Hoechst 염료 (1.5 µ M)와 샘플을 품 어.</li>
	<li>형광 장착 매체와 coverslip를 사용 하 여 유리 슬라이드에 샘플을 탑재 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자 없다 공개.

Ex vivo DRG 모델 두 신경 그리고 glial 대사37에 있는 microenvironment의 효과 뿐 아니라 신경 명과 상호 작용 등의 다양 한 스펙트럼을 조사 하기 위해 매우 유용 합니다. 또한, DRG 모델 병원 성 메커니즘 및 급성 만성 및 잠재성 단계 감염 또는 특정된 질병에 대 한 ex vivo 시스템 개발 하 여 마커를 관련 된 관련 된 질문을 해결 하기 위해 비용 효율적인 도구로 사용 될 수 있습니다. 또한, DRG explants에 작은 분자의 심사 도서관 약 개발이 explant 모델을 악용할 수 있습니다. 생체 외에서 모델, 특히 단일 셀 시스템, 너무 단순한 순수 관련 행사; 관련이 많습니다. vivo에서 모델을 정확 하 게 도전 하는 동안 조작, 부분적으로 부상, glial 흉터 및 금융 비용 함께 주변 ECM의 복잡성에 대 한 면역 반응 때문. 반대로, DRG explant 비보 전 전송을 허용 전체 장기의 중요 한 역할을 모든 신경 및 glial 세포 외 microenvironment를 포함 하 여 신경 네트워크의 복잡 한 organotypic 문화는 기능입니다. 그러나, ex vivo 모델의 세대 수만 비슷하지만 완전히 보답 에 비보를 발견 하는 모든 조건. 이 모델을 사용할 때 염두에 두 가지 중요 한 제한이 타이밍 이며만 진정한 수 있는 조직의 피드백의 부재에 비보를 표현. DRG 중요 한 비보 전 유지 될 수 있는 제한 된 시간이이 모델을 급성 조건과 따라서 만성 조건에 대 한 매우 신뢰할 수 있는 모델이 아닌의 조사를 위해 더 적당 한 만든다. 마찬가지로, ex vivo 모델 응답 다른 기관 또는 시스템 (예, 면역 체계)의 부재에 의해 영향 될 수 있는 연구를 위한 적합 하지 않습니다.
우리는 성공적으로는 explant 비보 전 DRG 성인과 태아 쥐 및 쥐에서 분리 하 고이 모델을 사용 하 여 neuroplasticity translational 의학에 미치는 영향의 다른 여러 측면으로 HSV-1 감염 조사 수 있었다. 감각 섬유는 explant 밖에 성장 하는 것을 허용 하기 위하여 연결 주변 캡슐이 했다 부분적으로 제거1.
수를 고려, Engelbreth-Holm-떼 (EHS) 마우스 sarcom isrich laminin, 콜라겐 IV, 헤 파 린 황산 proteoglycans (HSPG), 등 다양 한 성장 인자38ECM 단백질에서에서 추출한 젤라틴 단백질 혼합물. 이 프로토콜에서 젤라틴 단백질 혼합물 문화 매체와 1:1 희석 하 고 매체의 최종 볼륨을 추가 하기 전에 37 ° C에서 30-60 분에 대 한 유해 수 있습니다. 실내 온도;에 젤라틴 단백질 혼합물 polymerizes 따라서, 그것은 explants는 도금 고를 10-20 µ L을 찬 피 펫 팁을 사용 하 여 12 음 요리에 때까지 혼합물을 냉장 보관 권장. 타이밍 문화 시저의 마지막 효율성에 대 한 중요 하 고 유형 (및 제조) 젤라틴 단백질 혼합물의 사용에 따라 다를 수 있습니다. 젤라틴 단백질 혼합물을 완전히 생산 하지, 그것은 이미 경화 하는 경우는 explant 부동 하거나 실패 한 성장에 주요 건조 수 있습니다. 우리는 경험적으로 적절 한 온도, 시간, 그리고 젤라틴 단백질 혼합물 희석 성공적인 모델을 확인 하는 조사를 권장 합니다. 우리는 DRG explants 비보 전 7-10 일 동안 유지의 성공적인 성장의 55-70%의 효율에 도달 했습니다. explant DRG 파생 된 기본 감각 신경 및 위성 셀 공동 문화에 더 해리 했다 될 수 있습니다.

이 원고에서 우리를 PNS 모욕 신경 폐해에서 배열에 생물학 응답의 넓은 범위를 조사 하는 보존된 조직 같은 microenvironment로 파생 된 마우스 DRG 모델 시스템의 organotypic ex vivo 모델을 받는 방법을 보고합니다 상호 작용, neuroplasticity, 염증 성 마커, 바이러스 성 감염. 또한, 우리는 더 DRG 파생 한 감각 신경 및 위성 세포의 기본 공동 문화를 만들려는 프로토콜 개발.
DRG는 위성 회색-문제-단위 척추 신경의 등 쪽 척추 뿌리 따라 중앙 신경 시스템 (CNS) 밖에 위치 해 있습니다. DRG, 척추 foramina의 근접에 있는 pseudounipolar 감각 뉴런 하며 위성 glial 세포. Pseudounipolar 신경 셀 시체 주변 대상에서 체세포와 내장 입력을 들고 주변 프로세스 및 CNS에 세포 체에서 감각 정보를 전송 하는 중앙 프로세스에 분할 단일 neurite 기능. 연결 캡슐 정의 CNS에서 신경 그리고 glial 세포의 주변이 클러스터를 분리 하 고. DRG에서 출생 후 셀 마이그레이션 없음 설명 적 이며 지방 줄기 세포 틈새 생활1에 걸쳐 발생 하는 neurogenic 이벤트에 대 한 책임. 따라서,이 모델은 특히 성체, axonogenesis, 외상 성 병 변, 및 세포 죽음2,3,,45,6,7 공부에 적합 ,,89 .
Neuroregeneration의 분야에는 DRG vivo에서 에서 수확 explanted 시험관에서 재현 axonotmesis, 신경 세포 체는 축 삭은 완전히 절단에 부상 상태 innervated 대상10에서 분리 ,11. 그것은 잘 알려져 주변 신경 상해는 DRG에 감소 및 증가 유전자 발현을 발생할 수 있습니다 및 이러한 변경의 많은 재생 프로세스의 결과 있지만 많은 비 신경 세포에서 면역 반응 또는 다른 결과 수도 있습니다. 비보 전 을 사용 하 여이 복잡성의 일부 고립 된 DRG의 시스템을 제거 하 고 기계적 경로 보다 쉽게 조사 수 있습니다.
CNS, 많은 신경 전달 물질 GABA12,13,,1415 신경 소마의 수준에서를 포함 하 여에 대 한 수용 체의 풍부에 감각 입력을 전달에 중앙의 역할 외에도 interneuronal 크로스-여기의 증거는 DRG 감각 입력16,17의 정교한 예비 통합자는 제안할 수 있습니다. 이러한 새로운 결과 부여 DRG explant에 비슷한 신경 조직 특정 organoids의 광범위 한 실험 분야에 사용 되는 다른 "미니 두뇌" 모델 및 치료 미니 신경 네트워크 시스템의 특성 신경 질환18,19에 접근. 이러한 증거는 사실은 DRG 연결 캡슐에 의해 포위 하는 신경 조직의 개별 및 잘 정의 된 클러스터 함께 비보 전 이식에 대 한 적합 한 장기 게.
자란 마우스 DRG 매력적인 다세포 옵션 종 간의 구조 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 pathophysiologies 모델을 제공 합니다. 또한, 유전자 변형 마우스 긴장의 큰 저장소 미래 기계 론 적인 연구에 매우 도움이 되는. Neurite 확장 모두 개발 및 그 이후 부상 성장 콘 및 기판20,21사이 기계적인 상호 작용을 요구 한다. 나노 및 마이크로 패턴이 기판 neurite 결과와 그들의 microenvironments에서 지형 기능에 대응 하는 자신의 능력을 보여주는 도구로 사용 되었습니다. 뉴런, 준수, 마이그레이션, 생존과 기판22,23에 홈 같은 표면 기능 탐색에 그들의 축 삭의 방향을 표시 되었습니다. 그러나, 이러한 연구는 일반적으로 교양된 셀 라인 활용 하 고 어떻게 기본 신경 세포 지 예측 하기 어려운 비보 전또는 vivo에서 잘 정의 된, 물리적 신호에 응답.
마우스 사용이 제안에 대 한 DRG explant 모델 비보 전 진짜 셀 상호 작용 및 생 화 확 적인 신호 성장 축 삭을 둘러싼 모방 합니다. 많은 다른 neuroinflammation, axonal 재생, neurosphere 생산에서에서 배열 하는 실험적인 패러다임에서 DRG explant 가운데 모델 감각 내 바이러스 성 감염 및 대기 시간 측면을 조사 하는 유용한 도구 역할을 계속합니다 중추24,25,,2627.
신경 계통 (NS)는 일반적으로 바이러스 감염28,,2930에 대 한 대상입니다. 대부분 바이러스 감염 상피 그리고 내 피 세포 표면 그리고 주변 신경 통해 ns 표면 조직에서 그들의 방법을 감각 및 모터 섬유. 특히, 포진 심 플렉스 바이러스 타입 1 (HSV-1) 상피 세포에 초기 감염 감각 중추에 선호, 평생 대기 시간을 설정 후 PNS31,32의 DRG. PNS 감염 HSV-1 neuroptropic 기능 신경 질환33에 궁극적으로 지도 한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adult Mice NIH/Swiss</td>
			<td>Harlan Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel ECM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1270</td>
			<td>gelatinous protein mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td>*Part of SFM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22um filter</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Supplement for neuronal culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSN antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15640-055</td>
			<td>*Part of SFM media 
			Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>*Part of SFM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>N-100</td>
			<td>Nerve growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin coated coverslide</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-14-Laminin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ONPG subtrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>34055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15520034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-B-tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8328</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-peripherin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1530</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>1.5 &#181;M final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-heparan sulfate</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>H1890-10</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti gD antibody</td>
			<td>Virostat</td>
			<td>196</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td>*Part of SFM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21010-046</td>
			<td>*Part of SFM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td>*Part of SFM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51300-044</td>
			<td>*Part of SFM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td>*Part of SFM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7505</td>
			<td>*Part of SFM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 (goat anti-mouse)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 (goat anti-rabbit)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch laboratories</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat serum&#160;</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td>Flurescence mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond White Glass Coverslides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse drg explant and dissociated cell models to investigate neuroplasticity and responses to environmental insults including viral infection

이 프로토콜 지 루트 마우스 파생 중추 (DRG) explant 및 생체 외에서 DRG 파생 공동 문화 해리 감각 신경 그리고 glial 위성 세포의 비보 전 모델을 설명합니다. 이들은 다양 한 생물학 응답 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해에서 이르는 말 초 신 경계 (PNS)의 생리 적 및 병 적인 상태와 관련 된 조사를 유용 하 고 다재 다능 한 모델 neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염입니다. DRG explant의 사용은 여러 이유로 단순한 단일 셀 모델에 비해 과학적으로 유리 하다. 예를 들어, organotypic 문화, DRG explant 비보 전 모든 신경 그리고 glial 기능에 중요 한 역할을 재생 하는 세포 외 microenvironment를 포함 하 여 전체 신경 네트워크의 전송을 수 있습니다. 또한, DRG explants 또한 유지할 수 있습니다 비보 전 위해 몇 일 및 문화 조건으로 불안정 수 있습니다 원하는. 또한, 수확된 DRG 수 수 더 해리를 생체 외에서 공동 문화에 기본 감각 신경 그리고 glial 신경 상호 작용, neuritogenesis, axonal 콘 상호는 extracellular 조사 위성 glial 세포의 microenvironment, 그리고 더 일반적으로, 신경 물질 대사와 관련 된 모든 측면. 따라서, DRG explant 시스템 유연성을 다양 한 비용 효율적인 방식으로, 생리 적, 생물 학적 및 병 적인 조건에 관련 된 이벤트를 연구의 큰 거래를 제공 합니다.

Neuroplasticity 및 신경-환경 상호 작용의 여러 측면 DRG와 단일 해리 셀 문화 모델을 사용 하 여 조사 수 있습니다. 우리는 DRG explant와 DRG 파생 해리 셀 개요로 서 그림 1에 표시를 분리 하 여 연구를 시작 했다. 조직 및 단일 셀 모델은 다양 한 면역 형광 검사, 서쪽 오 점, 게놈 분석, 실험 설계 및 목표의 성격에 따라 다른 분석 기법 등 분자 기술 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 첫째, 우리는 axonal 성장 (그림 2)에 생 화 확 적인 큐의 효과 조사 하기 위해 우리의 DRG explant 모델을 사용. 더블 또는 트리플 면역 형광 검사에서 peripherin (그림 2A, B; 레드)와 β-tubulin (그림 2A, B; 녹색)의 차동 식 모두 신경 셀 시체와 주변 neurite 콩나물을 확인 했다. 세포 핵 발견 했다 Hoechst 얼룩 (그림 2A, 파란색)과. 위에서 언급 한 마커의 표현 했다 추가 4 %paraformaldehyde 톰 단면 (그림 3A)에 고정 후 전체 DRG explant에서 분석. 우리의 결과 peripherin 및 β-tubulin는 선택적으로 표현 절 뉴런의 두 모집단에서 peripherin는 "작은 빛", 신경의 "큰, 어두운" 모집단에서 β-tubulin에 각각 표시 되 고 확인 했다. 감각 뉴런에서 신흥 중 표시와 함께 neurites immunolabeled 주변으로 종료 하기 전에 전체 신경 절을 통해 전기가 발견 됐다. Hoechst 얼룩은 주로 glial 위성 핵에서 신경 절 내에서 위치를 식별합니다. 그림 3B에 표시 된 대로 전체 세포 분리 기술 후 신경 위성 세포 상호 작용을 더 나은 시각 수 있습니다. 블루 스테인드 위성 세포 핵 β-tubulin-긍정적인 감각 신경 소마와의 광범위 한 neurites 주변으로 보였다.
우리는 더 DRG 파생 해리 셀 HSV-1 감염 조사에 활용 하 고 감각 신경 (그림 4)에서 염증 반응에 관련 된. 후 게시물 감염 (탐정)의 1 h, HSV-1 안티-HSV-1 gD 항 체 glial 세포 (그림 4A)와 DRG 뉴런 (그림 4B) 모두를 사용 하 여 검색 되었습니다. 또한, HS 얼룩은 추가 실시 이후 바이러스 첨부 파일 또는 호스트 셀 바인딩 도킹 위치를 제공 하는 HS. HS는 다기능 세포 외 기질 (ECM)의 중요 한 구성 요소로 알려져 되었으며 세포 접착, 셀 신호, 및 상처 치유, 배아 개발, 암 개장 하는 ECM에서 주요 역할을 광범위 하 게 문서화 침공, 섬유 증, 그리고 neuroinflammation35,36. 흥미롭게도, HS axonal 성장 (그림 4C)을 허용 하는 microenvironment에 그것의 잠재적인 역할을 제안 하는 ECM에 얼룩이 관찰 합니다. 마지막으로, β-tubulin 얼룩 사용 하는 neurites 긍정적인 마커로 뉴런의 무결성을 확인 하.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56757/56757fig1.jpg"> 그림 1 . 회로도 표현을 실험 DRG와 단일 문화 모델 셀. DRG 성인 NIH/스위스 쥐, 과도 한 capsular 결합 조직, 그리고 어느 explanted ex vivo로 전체 explant에서 청소 또는 감각 신경 및 위성 세포의 기본 공동 문화에 해리를 격리 했다. 두 모델은 여러 분석 기술로 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56757/56757fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56757/56757fig2.jpg"> 그림 2 . DRG organotypic 문화 axonal 성장 조사를 모델 시스템으로 개발. DRG 비보 전 6 일에 대 한 성장 axonal는 explant에서 돋 아 조사 하는 데 사용 했다. 우리가 어떻게 다른 면역 형광에 의해 보여 생 화 확 적인 조건 섬유 콩나물의 분포에 영향을 미칠 수: 무작위로 성장과 무질서 (A) 더 선형 및 조직 패션 (B)에 비해. explants 안티-β-Tubulin (녹색)와 안티-peripherin (적색)로 표시 됩니다. 세포 핵은 Hoechst 물 얼룩 (파란색). 바 규모 = 100 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56757/56757fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56757/56757fig3.jpg"> 그림 3 . 격리 된 신경 문화 모델의 분자 특성. 전체 DRG의 섹션 peripherin 및 β-tubulin 절 뉴런의 두 모집단에 선택적 표현의 두 마커를 보여주는 대 한 항 체와 immunolabeled 했다. Peripherin (레드)은 "작은, 가벼운" 신경에 표현 되며 β-tubulin (녹색) "큰, 어두운" 신경에 표현 된다. Hoechst 얼룩은 주로 glial 위성 핵 신경 절 (A) 내에서 위치를 식별합니다. 신경-위성 세포 상호 작용 전체 세포 분리 기술 (B) 후 더 나은 구상 될 수 있다. 여기 우리는 β-tubulin-긍정적인 감각 신경 육체와 위성 glial 세포로 둘러싸인 그 neurites 표시 (Hoechst: 핵, 블루). 스케일 바, A = 100 µ m; B = 25 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56757/56757fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56757/56757fig4.jpg"> 그림 4 . DRG 파생에서 HSV-1 엔트리 모델의 해리 셀. Β-tubulin-긍정적인 neurites (녹색)에 따라 묘사 하는 천연된 위성 세포의 HSV-1 감염 gD 안티 바이러스 항 체 (레드)를 사용 하 여 공개 됩니다. 위성 glial 세포 핵 Hoechst (A)와 블루 얼룩이 있다. 동일한 항 체 천연된 DRG 신경 (B)에 있는 바이러스 성 항목을 보여준다. 공동 heparan 황산 염 (HS, 녹색)에 대 한 항 체를 세포 막에 표현으로 표시 됩니다. HS는 세포 외 기질 (녹색)의 구성 요소 이며 또한 axonal 성장 (C)에 대 한 중요 한 역할을 한다. 신경 세포는으로 표시 peripherin (빨간색) Hoechst 블루는 위성 세포의 핵을 식별 하는 데 사용 됩니다. 스케일 바 = 25 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56757/56757fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

이 보고서에서 organotypic 문화와 지 루트 마우스 파생 중추의 해리 주 문화의 장점 다양 한 메커니즘 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해와 관련 된 조사를 강조 표시 됩니다. neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염에 응답입니다.

성인 마우스 DRG Explant와 해리 셀 모델 Neuroplasticity 바이러스 성 감염을 포함 한 환경 모욕에 대 한 응답을 조사 하

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

adult-mouse-drg-explant-dissociated-cell-models-to-investigate

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.9K 조회수.  Midwestern University. 이 보고서에서 organotypic 문화와 지 루트 마우스 파생 중추의 해리 주 문화의 장점 다양 한 메커니즘 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해와 관련 된 조사를 강조 표시 됩니다. neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염에 응답입니다.

비디오: Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature infants and the most common antecedent of cerebral palsy. PVL is characterized by periventricular white matter damage with prominent oligodendroglial injury. Hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation are the primary causes of PVL. We use P6 mice to create models of neonatal brain injury by the induction of hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation with unilateral carotid ligation followed by exposure to hypoxia with or without injection of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Immunohistochemistry of myelin basic protein (MBP) or O1 and electron microscopic examination show prominent myelin loss in cerebral white matter with additional damage to the hippocampus and thalamus. Establishment of mouse models of PVL will greatly facilitate the study of disease pathogenesis using available transgenic mouse strains, conduction of drug trials in a relatively high throughput manner to identify candidate therapeutic agents, and testing of stem cell transplantation using immunodeficiency mouse strains.

We established mouse models of periventricular leukomalacia (PVL), the predominant brain injury in premature infants characterized by periventricular white matter lesions. Hypoxia/ischemia with/without systemic infection are the primary causes of PVL. Unilateral carotid ligation and hypoxia exposure with/without lipopolysaccharide injection creates PVL-like lesions in P6 mice.

Periventricular Leukomalacia의 마우스 모델

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

연구

신경과학

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors. Using animal models to accomplish this goal, many methodological strategies require invasive techniques to manipulate the intensity of the behavior of interest (e.g., lesion methods, pharmacological manipulations, microdialysis techniques, genetically-engineered animal models). The utilization of a comparative species approach allows researchers to take advantage of naturally occurring differences in response strategies existing in closely related species. In our lab, we use two species of the Peromyscus genus that differ in paternal responses. The male California deer mouse (Peromyscus californicus) exhibits the same parental responses as the female whereas its cousin, the common deer mouse (Peromyscus maniculatus) exhibits virtually no nurturing/parental responses in the presence of pups. Of specific interest in this article is an exploration of the neurobiological factors associated with the affiliative social responses exhibited by the paternal California deer mouse. Because the behavioral neuroscience approach is multifaceted, the following key components of the study will be briefly addressed: the identification of appropriate species for this type of research; data collection for behavioral analysis; preparation and sectioning of the brains; basic steps involved in immunocytochemistry for the quantification of vasopressin-immunoreactivity; the use of neuroimaging software to quantify the brain tissue; the use of a microsequencing video analysis to score behavior and, finally, the appropriate statistical analyses to provide the most informed interpretations of the research findings.

The comparative species approach allows behavioral neuroscientists to explore various neurobiological factors associated with specific behaviors viewed as characteristic of a specific animal model. Taking advantage of naturally occurring differences in behavior between closely related species, this technique doesn&#x2019;t require invasive techniques to manipulate the expression of the behavior.

아버지의 응답의 신경 생물학을 맡은 이후로 비교 종의 접근법을 사용

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

성인 마우스 Utricle 및 아데노 바이러스 - 매개 지원하는 세포 감염의 해부

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular mechanisms of synaptic plasticity. Long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) induced in acute hippocampal slices are widely accepted as cellular models of learning and memory. There are numerous studies that use live cell imaging or immunohistochemistry approaches to visualize activity dependent protein dynamics. However these methods rely on the suitability of antibodies for immunocytochemistry or overexpression of fluorescence-tagged proteins in single neurons. Immunoblotting of proteins is an alternative method providing independent confirmation of the findings.&#160;The first limiting factor in preparation of subcellular fractions from individual tetanized hippocampal slices is the low amount of material. Second, the handling procedure is crucial because even very short and minor manipulations of living slices might induce activation of certain signaling cascades. Here we describe an optimized workflow in order to obtain sufficient quantity of nuclear enriched fraction of sufficient purity from the CA1 region of acute hippocampal slices from rat brain. As a representative example we show that the ERK1/2 phosphorylated form of the synapto-nuclear protein messenger Jacob actively translocates to the nucleus upon induction of LTP and can be detected in a nuclear enriched fraction from CA1 neurons.

We provide a detailed protocol for induction of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampus and the subsequent isolation of nuclear enriched fractions from the tetanized area of the slice. This approach can be used to determine activity dependent nuclear protein import in cellular models of learning and memory.

해마 조각에서 CA1 핵 농축 분획의 분리는 Synapto 핵 메신저 단백질의 활동에 의존하는 핵 가져 오기를 공부합니다

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Zebrafish의 성인 Telencephalon의 자상 부상 : 척추 동물의 뇌 신경 발생과 재생을 조사하는 방법

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

신경 퇴행성 질환의 마우스 모델에 대한 후각 분석 실험

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

스트라이프 분석은 해리 해마 신경 세포를 사용하여 단백질 기판의 매력적인 또는 혐오감 활동을 연구하는

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

소설 행동 분석은 (엉망으로 꿀벌을 자유롭게 이동 개인의 미각 응답을 조사하기<em&gt; 뒤의 terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions in the immature and adult brain. Here we describe a zinc histochemical staining procedure that reveals differences in staining patterns among different layers and brain regions. Others have utilized this procedure not only to reveal the distribution of zinc-containing neurons and circuits in the brain, but also to successfully delineate areal and laminar boundaries in the developing and adult brain in several species. Here we illustrate this staining procedure with images from developing and adult ferret brains. We reveal a zinc-staining pattern that serves as an anatomical marker of areas and layers, and can be reliably used to distinguish visual cortical areas in the developing and adult visual cortex. The main goal of this protocol is to present a histochemical method that allows the accurate identification of layers and regions in the developing and adult brain where other methods fail to do so. Secondarily, in conjunction with densitometric image analysis, this method allows one to assess the distribution of synaptic zinc to reveal potential changes throughout development. This protocol describes in detail the reagents, tools, and steps necessary to successively stain frozen brain sections. Although this protocol is described using ferret brain tissue, it can easily be adapted for use in rodents, cats, or monkeys as well as in other brain regions.

We describe a histochemical procedure that reveals characteristic laminar and areal zinc staining patterns in different brain regions. The zinc-staining pattern may be used in conjunction with other anatomical markers to reliably distinguish layers and regions in the developing and adult brain.

시 냅 스 아연 Histochemistry 다른 지역과 개발 및 성인 두뇌에서 하기의 사용

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

세포외 매트릭스 단백질에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 마이크로 패터닝을 위한 PRIMO 시스템을 사용하여 단백질의 빛 유발 분자 흡착

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...