이 프로토콜은 바이러스 감염 중 마우스 말초 신경계에서 신경 염증 반응의 개시 및 발달에 대한 연구를 허용합니다. 이 모형으로, 감염은 신경 선동적인 반응의 운동성의 최대 평가를 허용하는 주변및 중추 신경계에 주변에서 더 큰 거리를 여행합니다. 수술 패드의 척추 위치에 5~7주 된 마취 C57BL/6 마우스를 배치한 후 페달 반사에 대한 반응부족을 확인한다.
그리고 100에서 180 개의 모래 에머리 보드를 사용하여 발 뒤꿈치와 보행 패드 사이에 뒷발 패드 의 글라브러스 피부를 부드럽게 래브라데하고 약 20 패스의 보드가 있습니다. 그런 다음 미세 한 집게를 사용하여 찰과상에 의해 분리 된 지층 각질을 천천히 벗겨 내어 지층 바살레를 노출시하십시오. 부드러운 혼합 후, 포티컬에 적용 20 바이러스 접종의 적절한 티터의 마이크로 리터는 abraded 풋 패드에.
대조동물의 발판에서만 매체로 모의 접종을 수행합니다. 각 응용 프로그램 후, 부드럽게 30 분 동안 10 분마다 바이러스의 흡착을 용이하게하기 위해 바늘의 샤프트와 풋 패드를 10 번 문질러. 마모된 풋패드가 건조되면, 쥐가 임상 후속 및 샘플링을 위해 동물을 개별 케이지에 넣기 전에 흉골 이내까지 모니터링하여 회복하도록 허용하십시오.
적절한 실험 시점에서 심장, 폐, 비장, 췌장, 간, 신장 및 방광을 포함한 바이러스 가 노출된 장기를 얼음에 있는 개별 1.5 밀리리터 마이크로튜브로 수집합니다. 그런 다음 발 뒤꿈치와 보행 패드 사이의 마모 된 풋 패드를 수확하고 샘플을 얼음에 개별 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 넣습니다. 다음으로, 마우스를 경향이 있는 위치에 놓고 70%에탄올로 털을 적시습니다.
척추 컬럼을 노출하려면 골반 부위에 작은 절개를 하고 뒷두에서 머리쪽으로 피부를 제거합니다. 앞다리와 뒷다리를 제거하려면 가위를 사용하여 양쪽의 척추와 평행하고 가깝게 자른다. 그리고 두개골의 기지에서 머리를 제거합니다.
가위를 사용하여 앞골 매그넘에서 정면 뼈까지 두개골을 엽니다. 그리고 집게를 사용하여 측면 방향으로 두개골을 엽니 다. 그런 다음 집게를 사용하여 뇌를 부드럽게 떠서 뇌를 얼음에 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 넣습니다.
구부러진 가위를 사용하여 근육, 지방 및 연조직의 척추를 청소하고 꼬리를 제거합니다. 그런 다음 그대로 척수열을 얼음 위에 얼음 위에 멸균 된 얼음 차가운 PBS15 밀리리터 튜브에 3 시간 이상 놓습니다. 해부 후, 남은 연조직을 제거할 수 있도록 척수를 조직 배양 접시로 옮기십시오.
면도날을 사용하여 S2, L1 및 T1 척추의 척추를 통과하는 세 개의 횡반 컷을 만듭니다. 멸균 얼음 차가운 PBS를 포함하는 개별 15 밀리미터 요리로 조각을 전송합니다. 이후 분석을 위해 세그먼트의 원점이 추적 및 표시를 유지합니다.
그런 다음 집게를 사용하여 한 세그먼트 등쪽을 위로 고정하고 면도날을 사용하여 중간선을 통해 세로가 잘라 서 컬럼을 두 개의 동일한 반으로 분할합니다. 척추의 왼쪽과 오른쪽을 구별할 수 있도록 신선하고 멸균된 얼음-차가운 PBS를 새로운 페트리 접시에 모두 놓습니다. 해부 현미경에서 미세한 집게를 사용하여 척골 컬럼의 각 절반에서 척수를 부드럽게 벗겨 서 소달 방향으로 가십시오.
그런 다음 두 척수를 각각 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 넣고 멸균 얼음-차가운 PBS 500 마이크로리터를 얼음 위에 놓습니다. 등쪽 뿌리 신경절을 노출하려면 척추의 한쪽에서 다른 쪽으로 수막을 부드럽게 제거합니다. 그리고 척추에서 노출 된 백색 척추 신경을 당깁니다.
척추 세그먼트에서 15밀리미터 페트리 요리로 둥근 투명한 등살 뿌리 신경절을 수확하여 차가운 PBS를 15밀리미터로 수확합니다. 그리고 방금 입증 된 바와 같이 ipsilateral 및 모순 된 등갈 뿌리 신경절을 수집합니다. 척수 신경과 등쪽 루트 신경절을 다른 두 척추 기둥 세그먼트에서 수확한 후, 조직의 모든 튜브를 고속으로 원심분리합니다.
그런 다음 슈퍼 나츠제를 흡습하고 액체 질소로 샘플을 플래시 동결하고 균질화 될 때까지 영하 80도에서 저장합니다. 조직 균질화를 위해, 각 샘플의 100 밀리그램을 계량하기 전에 얼음에 얼어 붙은 조직의 튜브를 해동. 멸균 구슬과 500 마이크로리터의 방사성 면역 침전 분석 버퍼를 포함하는 2밀리리터 마이크로센심심분리기 튜브로 이송합니다.
다음으로, 2분 동안 초당 20사이클에서 균질화의 실온에서 조직을 방해하고, 1분 대기 기간, 20사이클은 2분 더 진행한다. 균질화의 두 번째 라운드 후, 원심 분리는 새로운 적절하게 표시 튜브로 각 슈퍼 나탄의 500 마이크로 리터를 전송하기 전에 고속으로 조직을 원심 분리. 다운스트림 분석전까지 영하 20도에 보관하십시오.
마모 부위는 제어 풋패드에 표시됩니다. 그리고 치유 과정의 일환으로 마모 부위에 지각이 형성되는 것이 일반적이다. 대조적으로, 의사로 접종된 마우스는, 붓기와 발적을 특징으로 하는 인도적인 끝점에서 발판의 가혹한 염증을 보여줍니다.
접종된 풋패드와 등대 뿌리 신경절의 조직 병리학 검사는 감염된 발 섹션 내의 표피 괴사와 심한 진피 염증을 드러낸다. 호중구의 침투는 또한 DRG 섹션에 감염된 의사랍에서 관찰된다. G-CSF 단백질 발현의 현저한 증가는 7시간 82시간 후 감염시 대조군과 비교하여 인질 감염된 마우스의 풋패드 및 등쪽 뿌리 신경절에서 측정된다.
중요한 G-CSF 수준은 또한 통제에 비해 척수, 두뇌, 심혼 및 간 조직에 있는 82 시간 후 감염에서 관찰됩니다. 더욱이, IL-6의 중요한 수준은 24 시간 감염 후에서 시작하는 가짜 감염된 마우스의 모든 시험된 조직에서 검출됩니다. 모리번드 상태에서, 의사 근간, 척수 및 뇌에서 발견되었습니다.
psuedorabies의 높은 세포질 발현으로 감염 된 마우스에 있는 등쪽 뿌리 신경절의 뉴런에서 당단백질 gB. 성공적인 감염을 보장하기 위해, 열에 바이러스의 물방울이 마모 된 풋 패드에서 떨어지지 않는 것이 중요합니다. 이 동물 모델은 바이러스 유발 말초 신경 병증을 방지하기 위해 항 염증 및 항 바이러스 약물의 효능을 테스트하는 플랫폼을 제공 할 수 있습니다.
