이 방법은 주변 고치와 같은 감각 연구 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 대부분의 생리적 상태를 시뮬레이션 하는 모델감각 뉴런의 세포 메커니즘을 조사 하는 것입니다. 2~3주 된 쥐의 트렁크에서 요추 등 뿌리 간리아를 수집합니다.
척추의 측면을 따라 두 개의 컷을 만들고 요추 척추의 장밋빛 정도를 표시하기 위해 측면 절단을 합니다. 그런 다음 뼈 절단 집게를 사용하여 척추의 등뼈 근육을 제거하십시오. 다음으로 척추의 등대 부분을 제거하고 척수를 노출시십시오.
그런 다음 해부 가위와 집게를 사용하여 척수를 제거하십시오. 마지막 갈비뼈에서 척추를 계산하여 요추 DRG를 식별합니다. 이 다이어그램은 척추 위치를 보여줍니다.
마이크로 가위를 사용하여 L1에서 L6까지 12개의 양자 요추 DRG를 수집합니다. 배양의 순도를 향상시키기 위해 부착 된 신경 섬유를 제거하십시오. 각 요추 DRG를 35mm 배양 접시에 얼음 냉간 세럼 프리 배지 2밀리리터가 들어 있는 접시로 옮긴다. DRG 함유 35mm 접시를 라미나르 후드로 옮기고, 피펫으로 세럼이 없는 배지로 DRG를 세척합니다.
멸균 핀셋을 사용하여 DRG를 멸균 콜라게나아제 타입 1A 의 2밀리리터를 포함하는 새로운 35mm 배양 요리로 이동합니다. 콜라게나아제 용액에 37도 의 조직 배양 배양기를 30분 간 배치하여 세포의 해리를 시작합니다. 인큐베이션에 이어 콜라게나제 용액을 제거하고 행크의 균형 잡힌 소금 용액 2밀리리터로 DRG를 세 번 세척합니다.
다음으로, 요리에 사전 0.05%의 트립신 EDTA의 2밀리리터를 추가하고, 이전과 같이 30분 동안 인큐베이터에서 DRG를 소화합니다. 소화 후 유리 파이펫을 사용하여 DRG 함유 용액 2밀리리터를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 전송합니다. DRG는 유리 파이펫에 충실할 수 있으므로 이 단계를 주의해서 수행해야 합니다.
실제 손실은 유리 파이펫의 테이퍼 끝에 DRG 함유 솔루션을 유지하고 솔루션을 원심분리기 튜브로 천천히 전송하지만 일시 중지없이 방지 할 수 있습니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 5분간 290배 G로 용액을 원심분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 제거하고 DRG를 다시 중단하는 세럼이없는 매체의 또 다른 두 밀리리터를 추가합니다.
마지막 원심 분리 후 조직을 다시 중단하기 위해 미리 따뜻해진 배양 배지의 2밀리리터를 사용하여 세척을 두 번 반복합니다. 이전에 준비된 멸균 화염 연마 파이펫을 사용하여 DRG를 약 60회 수동으로 세배로 삼화합니다. 다음으로, CO2 인큐베이터로부터 양배지 1밀리리터를 함유한 폴리 L-리신 코팅 24웰 플레이트를 제거한다.
요리에서 배양 된 문화 매체를 흡인. 하나의 쥐에서 DRG 세포를 4 개의 우물로 시드하십시오. 이것은 약 500, 000 세포의 파종 밀도를 잘 당 제공합니다.
다음 날, 배양 배지를 10 마이크로몰라 AraC, 밀리리터 NGF당 100 나노그램으로 보충된 배지로 대체한다. 세포 도금 후 3일째에, 미리 따뜻진 혈청 없는 배지의 0.5 밀리리터로 배지를 변경하고 1시간 동안 배양한다. 인큐베이션 동안, RNase 가 없는 물의 한 마이크로리터에 50 밀리몰러 siRNA를 트랜스펙트당 혈청 이없는 배지 12.5 마이크로리터에 추가합니다.
그런 다음 각 배회에 대해 혈청이없는 매체 의 10 마이크로 리터로 트랜스페트 시약의 파이펫 2.5 마이크로 리터. 파이펫으로 두 솔루션을 혼합하고 실온에서 10 분 동안이 혼합 형질 전환 솔루션을 인큐베이션하십시오. 10분 후, DRG 함유 24웰 플레이트의 우물에 경질 용액을 넣고 부드럽게 흔들어 섞습니다.
6 시간 인큐베이션에 따라, 세포의 각 우물에 20 %의 FBS, 10 마이크로 몰라 아라C, 100 나노 그램배의 배양 배지의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 마지막으로, DRG를 섭씨 37도 CO2 인큐베이터에서 66시간 동안 배양합니다. 도금 후 6일째, siRNA 경질 후 72시간 후, 배양 배지를 혈청 이없는 배지의 200마이크로리터로 변경한다.
30분 분량의 인큐베이션을 마친 후 자극 화학 물질의 마이크로리터 1개를 추가하고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. NPFFR2 고뇌스트, dNPA 및 해당 차량이 여기에 사용됩니다. 필요한 기간 동안 배양 후, 배양 접시로부터 배양 배지를 수집하고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분간 5000회 G로 수집하여 중단된 불순물을 제거한다.
원심분리에서 상체를 수집하고 필요에 따라 인산염 완충식식물로 희석하십시오. 분석 시사용 가능한 효소 면역 분석 키트를 가진 신경 전달 물질의 수준을 말합니다. 첫날, 화살로 표시된 단일 뉴런의 세포 본체가 접시 의 바닥에 부착되었다.
화살촉에 의해 표시된 신경교 세포도 존재한다. 신경교 세포는 둘째 날에 감각 뉴런의 세포 체를 둘러싸고 중복 및 확장 된 과정, 셋째 날에 더욱 눈에 띄는 과정. 또 다른 배양에서, CGRP 단백질은 뉴런의 모양을 밝히기 위하여 얼룩이 있었습니다.
CGRP 단백질 염색은 감각 신경의 세포질 및 축삭에 나타납니다. 신경 세포와 신경교 세포의 핵 형태는 DAPI로 얼룩질 때 구별됩니다. 뉴런은 신경교 세포보다 더 크고 둥근 핵을 가지고 있습니다.
비교하여, 신경교의 핵은 모양에 더 타원형입니다. 일단 마스터되면, 제대로 수행되는 경우이 기술은 2 시간 반에서 수행 할 수 있습니다. 이 비디오를 시청 한 후, 당신은 동구 대 신경절을 해부하고 배양하는 방법에 대한 좋은 이해를 가지고, 기본 생리 적 기능을 조사하는 도구로 사용해야합니다.
1 차 적인 세포와 함께 작업 하는 것이 일반 세포주와 함께 작업 하는 것 보다 훨씬 더 어려울 수 있습니다 잊지 마세요, 그리고 부드러운 되 고 항상 이러한 절차를 수행 하는 경우 가장 좋은 방법입니다.
